Introduction
המוח האנושי מורכב 85 מליארד נוירונים משוערים ותאים שאינם עצביים 85 מיליארדים נוספים כוללים גליה 1. לחלק הגדול יותר של 100 השנים האחרונות מדעני המוח התמקדו בעיקר באוכלוסיית התאים העצבית, תאי גליה להאמין להיות קצת יותר מאשר תאים פסיביים תמיכה שספקו תמיכה מבנית לנוירונים - ומכאן האטימולוגיה היוונית של "גליה" תורגמה לאנגלית כ "דבק". לאחרונה, עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי אינטראקציות עצביות-גליה עשויות להיות הרבה יותר בסיסיות להיבטים בסיסיים של נוירוביולוגיה, נוירופיזיולוגיה, והראשית וההתקדמות של מחלות ניווניות רבות. תאי המוח הקטן גרגיר (CGCs), האוכלוסייה הומוגנית העצבית הנפוצה ביותר במוח האנושי, שולטים במוח הקטן ומהווים יותר מ -90% מהבוחרים הסלולריים שלה. כתוצאה מכך, תאים אלה היו בשימוש נרחב במבחנה כמערכת מודל לtהוא חקר התפתחות עצבית, פונקציה, ופתולוגיה 2-6.
עם זאת, תרבויות CGC עדיין מכילות מיקרוגלים וגליה אחרות בפרופורציות לטעון משמעותיות. כתוצאה מכך, נתוני CGC putatively מוצגות תגובות עצביות ישירות לטיפולי תאים שונים עשויים למעשה מתעוררים - בחלקו או בסך הכל - מהתגובה המשנית העקיפה של השכן גליה בתרבות. כדי להעריך את זה, אנחנו סלקטיבי בוטלו microglial מתרבויות עצביות CGC עם הסיוע של אסתר L-לאוצין תיל (LME). LME הוא סוכן lysomotropic שימש במקור כדי להרוס באופן סלקטיבי מקרופאגים 7, ומאז משמש לרוקן גם באופן סלקטיבי מיקרוגלים מעצביים, astrocyte, ותרבויות גליה מעורבות 8,9,10. LME מופנם על ידי מקרופאגים ומיקרוגליה, שבו היא גורמת להפרעת lysosomal ואפופטוזיס לאחר מכן 13,14. המקרופאגים ומיקרוגליה הם אופייני עשירים בlysosomes, גורמים להם להיות particularly פגיע בחשיפה לטיפול LME. פרוטוקול זה מספק דרך רבת עוצמה, אך פשוטה וקלה לברר את התרומה של מיקרוגליה בניסויי ניצול CGC ומערכות אחרות עצביות / גליה תרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים במסמך זה בוצעו בהתאם לבעלי חיים בריטניה (הליכים מדעיים) Act of 1986.
1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות
- הכן שני מספריים מעבדה הנירוסטה לנתח ושני מלקחיים מעבדה נירוסטה. החיטוי כל המכשירים והמקום בO מכסה המנוע התרבות / N תחת אור אור (UV) אולטרה סגול לעיקור.
- הפוך 500 מיליליטר של תקשורת חיונית בינוני מינימום (ממ) תרבות (10% עובריים שור [FBS] סרום, 20 מ"מ KCl, 25 מ"מ NaHCO 3, 30 מ"מ D-גלוקוז, L-גלוטמין 2 מ"מ, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו -6 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין) ולסנן לעקר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
- הכן 24 צלחות תרבות היטב המכילות 14 מ"מ, עובי coverslips מספר 1. החיטוי coverslips ומעיל ב/ L 100 מ"ג פולי-ד-ליזין (PDL) כפי שתואר קודם לכן 3. אור UV לעקר O / N.
2. הכנת פתרונות CGC תרבות
- הכן 'פתרון' (100 מיליליטר) בautoclaved אור UV, טופל, סטרילי DH 2 O המכיל 250 מ"ג של גלוקוז, 300 מ"ג של סרום שור אלבומין [BSA], 955 מ"ג של בופר פוספט [PBS] (Ca 2 + ו Mg + חינם), ו 1 מיליליטר של 3.8% MgSO 4 · 7H 2 O.
- הכן 'פתרון ב' (10 מיליליטר) מכיל 1 מיליליטר של 5 מ"ג / מיליליטר טריפסין המדולל ב9 מיליליטר של א 'הפתרון
- הכן 'C פתרון "(10 מיליליטר) מכיל DNase 1,000 יחידות, 0.5 מ"ג של מעכבי טריפסין הסויה, של 3.8% MgSO 4 · 7H 2 O 100 μl, בדילול מלא עד 10 מיליליטר עם א' הפתרון
- הכן 'D פתרון "(20 מיליליטר) מכיל 3.2 מיליליטר של C פתרון, בדילול מלא עד 20 מיליליטר עם א' הפתרון
- הכן הפתרון מאוזן של BSA / ארל תמיסת מלח (EBSS) המכיל EBSS, 25 מ"מ NaHCO 3, 3 מ"מ MgSO 4 · 7H 2 O, ו4 BSA%, pH 7.4, כפי שתואר לעיל 3.
- הכן LME ידי הוספת LME הטהור לתוך 5 מיליליטר של מדיום תרבות ממ לתת ריכוז סופי של 150 מ"מ LME, להחזיר את הפתרון לpH 7.4 באמצעות מד pH benchtop, ומסנן לעקר באמצעות sulfone 28 מ"מ polyether (PES) 0.2 מיקרומטר מזרק מסנן.
3. Culturing CGCs
- לאסוף cerebella מגורי חולדה ישנים 4-7 יום כפי שתואר בעבר 3. הנח מייד בצלחת פטרי המכילה 5 מיליליטר פתרון על קרח.
- יוצקים את הפתרון עודף מרקמת המוח קטנה ומקום במכסה צלחת פטרי.
- קוצצים דק רקמה עם סכין גילוח בערה היטב בלפחות שלושה כיוונים שונים.
- להוסיף רקמה קצוצה לפתרון B (לשטוף צלחת פטרי עם פתרון כדי להבטיח רקמה מוגבלת אבד) ומקום באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ללחוץ בעדינות כל כמה דקות.
- להוסיף D פתרון (20 מיליליטר) לצינור כדי לנטרל את טריפסין, לרעוד ואחוזיםrifuge ב 65 XG במשך 5 דקות.
- יוצקים את supernatant.
- Resuspend ב 4 מיליליטר של תמיסת ג Triturate היטב (כ 10 פעמים כל אחד) עם שלוש טפטפות זכוכית הלוהבת של הפחתת קוטר, עד ההשעיה היא הומוגנית ככל האפשר.
- לאט ובעדינות להוסיף כמה טיפות של homogenate זה על גבי BSA / EBSS. אם זה מתחיל לשקוע דרך BSA / EBSS, triturate יותר ו / או להוסיף פתרון יותר קטן ג homogenate צריך לשבת בשכבה על גבי BSA / EBSS. לא לרעוד. ספין ב 100 XG במשך 5 דקות.
- הסר supernatant וגלול גלולים (רך) ב 1 מיליליטר של מדיום ממ.
- ספירת תאים באמצעות haemocytometer וצלחת ב800,000 תאים / coverslip ב500 μl של מדיום ממ. מקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 6% CO 2.
- לשנות את המדיום למחרת (24-36 שעות לאחר ההכנה). הפוך פתרון של מדיום ממ המכיל 10 מיקרומטר של cytidine מחזור התא arabinofuranosyl המעכב (ARAÇ).
- לכל אחדcoverslip, לשמור על 250 μl של המדיום הישן בצלחת גם טרי 24, לשאוב את השאר, להוסיף 250 μl של מדיום ממ הנורמלי ולשאוב זה לשטוף את התאים, ולאחר מכן להוסיף 250 μl של מדיום ישן חזרה לתאים והעליונים עד עם 250 μl של מדיום המכיל ARAÇ.
הערה: ניתן להשתמש בתאים מ6 ימים במבחנה (DIV).
- לכל אחדcoverslip, לשמור על 250 μl של המדיום הישן בצלחת גם טרי 24, לשאוב את השאר, להוסיף 250 μl של מדיום ממ הנורמלי ולשאוב זה לשטוף את התאים, ולאחר מכן להוסיף 250 μl של מדיום ישן חזרה לתאים והעליונים עד עם 250 μl של מדיום המכיל ARAÇ.
4. סלקטיבי וכלת Microglia (הנערכת בשעה 6 DIV)
- להוסיף LME הטהור עד 5 מיליליטר של aliquot נפרד של מדיום ממ לתת ריכוז סופי של 150 מ"מ LME.
- להחזיר את הפתרון לpH 7.4 ומסנן לעקר באמצעות sulfone 28 מ"מ polyether (PES) מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק.
- לדלל פתרון לריכוז של 50 מ"מ (2 x LME) במדיום ממ ומקום באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות יחד עם מדיום ממ רגיל לתרבויות שליטה.
- הסר מחצית (250 μl) בינוני ממ מתרבויות CGC ולשמור על 37 מעלות צלזיוס.
- תאי פינוקעם מדיום ממ המכיל 2 x LME (250 μl), כלומר דילול 1: 1 נותן ריכוז טוב של 25 מ"מ, או עם מדיום מראש חימם ממ ללא LME (250 μl) לתרבויות שליטה.
- דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified עם 6% CO 2 עבור שעה 1.
- לשטוף את תאי פעמיים במדיום ממ טרי מראש חימם להסיר תקשורת LME המכיל, ולאחר מכן להחליף את מדיום התרבות נשמרת ונפח שווה של מדיום ממ הטרי מראש חימם לבארות המקבילות.
- חזור תרבויות לחממה (humidified עם 6% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס) ולהשאיר למנוחה למשך 24 שעות לפני כל טיפול נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולת של טכניקה זו כדי לחסל באופן סלקטיבי מיקרוגלים מCGC ו / או תרבויות מעורבות מסתמכת על היכולת העתידית של החוקר לזהות בצורה מדויקת ולהבדיל מיקרוגלים מהתאים המקיפים אותם. זה יכול להיות מושגים באמצעות יצרנית תא microglial הספציפי, כגון isolectin-B4, כפי שמודגם באיור 1. כפי שהודגם באיור 2, לא חל שינויים נצפים לastrocyte וצפיפות עצבית ומורפולוגיה נרשמו ביחס לכל אחת מקבוצות הטיפול העיקריות. חשוב לציין, לא חל שינוי משמעותי במורפולוגיה עצבית או astrocytic נצפה כאשר טופלו תרבויות עם LME לבד, תמיכה פעולת microglial הספציפי של המתחם. איור 3 א לא מראה שינויים נצפים בצפיפות astrocyte ומורפולוגיה מתרבות astrocyte מכרסם העיקרי 12, אבל עושה להציג הפסד של מיקרוגליה זיהום. באיור 3, כמו ב, לא חל שינויים בastrocyצפיפות te ומורפולוגיה נראו; עם זאת, הפסד בזיהום מספר ותגובתיות microglial נצפה. לתיאור קצר של פרוטוקול immunocytochemistry (ICC) בשימוש בכתב היד הזה, אנא ראה התייחסות 11.
איור 1: אפיון של טיפול LME של CGCs. (א) נציג תמונות מimmunocytochemistry ניסויים (ICC) בוצעו על תרבויות CGC לאחר טיפול עם 25-75 מ"מ LME עבור שעה 1, ואחריו לשטוף פעמי. ICC בוצע עם DAPI (כחול) לכימות של מספר הכולל של תאים ומורפולוגיה מוצגות אפופטוטיים אלה, וisolectin-B4 (4 IB) (ירוק) לזיהוי וכימות microglial. בר סולם = 30 מיקרומטר. כימות (B) של תאים בו מוצגות מורפולוגיה אפופטוטיים, מוגדרת כעיבוי הכרומטין גרעיני (פסים אפורים;% ממספר כולל של תאים בתחום) ומספר כולל microglial, כאחוז מרמות שליטה (פסים ירוקים). -tests t של סטודנט מזווג בוצעו בין הבקרות הרלוונטיות וטיפול ספציפי של LME; * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; n = 3. (כלומר 3 חזרות עצמאיות).
איור 2: אפיון של תופעות של 25 מ"מ טיפול LME על נוירונים והאסטרוציטים בתרבויות CGC. לוח של תמונות מייצגות מניסויים שבוצעו בבית הדין הפלילי הבינלאומי תרבויות CGC לאחר טיפול עם 25 מ"מ LME עבור שעה 1. ICC בוצע עם DAPI (כחול), אנטי-β-III טובולין (ירוק) לזיהוי שינויים בצפיפות עצבית ואנטי-GFAP (אדום) לזיהוי שינויים בצפיפות ומורפולוגיה astrocytic. ביקורת שלילית תמונות (CTR -ve) מייצגות תרבויות CGC בי antibodie העיקרישל הושמטו. בר סולם = 30 מיקרומטר.
איור 3: אפיון נוסף של היעילות של 25 מ"מ טיפול LME בהסרת מיקרוגלים מתרבויות astrocytic. לוח () של תמונות מייצגות מניסויים שבוצעו בבית הדין הפלילי הבינלאומי תרבויות astrocyte עיקריות לאחר טיפול מקדים עם 25 מ"מ LME עבור שעה 1. ICC בוצע עם DAPI (כחול), אנטי-GFAP (אדום) לזיהוי שינויים בצפיפות astrocytic ומורפולוגיה, ואנטי-ED1 (ירוק) לזיהוי של מספר microglial. (ב) נציג תמונות מניסויים שבוצעו בבית הדין הפלילי הבינלאומי תרבויות astrocyte עיקריות לאחר טיפול עם LPS (1 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 24 שעות הבאות לפני טיפול עם 25 מ"מ LME עבור שעה 1. ICC בוצע כפי שתואר באבל עם אנטי GFAP (ירוק) ואנטי-iNOS (אדום) לזהות microg מופעלליה. ביקורת שלילית תמונות (-ve CTR) מייצגות תרבויות CGC בי הנוגדנים העיקריים הושמטו. בר סולם = 30 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעדים החשובים ביותר כדי להבטיח את הסילוק בררני המוצלח של מיקרוגלים מCGC ו / או תרבויות מעורבות הן: 1) שמירה על תרבות CGC סטרילי ובריאה; 2) מסנן חיטוי הבינוני LME המכיל וחוזר הפתרון לpH 7.4; 3) שמירה על תקשורת CGC נשמרת וLME המכיל תקשורת ב 37 ° C כדי למנוע הלם חום; ו 4) עובד במהירות כדי לצמצם את זמן תאים נשמרים מחוץ לחממה.
אנחנו השתמשנו 25 מ"מ LME לרוקן מיקרוגלים מתרבויות CGC - ריכוז מותאם בעבר במעבדה שלנו. עם זאת, כמה מיקרוגלים עדיין יישארו בתרבות בעקבות טיפול LME, שיש סבורים עשויים לשקף אוכלוסייה של מיקרוגליה המובחנים, מתרבים שאינן. ואכן, Hamby et al. (2006) מצאו כי 50-75 מ"מ LME נדרש לחסל מיקרוגלים מmonolayers astrocyte צפיפות גבוהה 13. יש לנו גם הראינו בעבר כי בג microglial הטהורultures, 10 מ"מ LME היה מספיק כדי להרוג את כל המיקרוגלים, אבל רק עם 24 שעות זמן דגירה 14.
שיטות אלטרנטיביות להיפטר מודלים תרבית תאים של זיהום מיקרוגלים הגיעו לאחרונה לאור. קרוקר et al. (2008) הפגין גישה חדשנית לחסל מיקרוגלים מתרבויות astrocyte על ידי קידום בידול עצבי תאי גזע (המל"ל) להאסטרוציטים בלידה (P0-P2) עכברים 15. הם מצאו כי טכניקה זו בוטלה לחלוטין מיקרוגלים מהתרבויות, למרות שמנגנוני התופעות אינם ידועים. . בנוסף, Kumamaru et al (2012) משמש clodronate liposomal - biophosphonate הידוע לגרום לאפופטוזיס ב מקרופאגים - לחסל מיקרוגלים בתרבויות astrocyte עיקריים מעכברי P3 16. מתחם זה עובד באופן דומה ובאותה הרמה של יעילות כמו LME; למרות המחברים טוענים כי כLME יכול להיות רעיל להאסטרוציטים בתנאים מסוימיםעקב דיפוזיה שלה בחינם לתאים - שיבוש יכולת הדבקת astrocyte 13 - clodronate liposomal מייצג שיטה משופרת לרוקן מיקרוגלים מתרבות. אנחנו, לעומת זאת, נמצאו כי 25 מ"מ LME אין השפעה על כדאיות astrocyte או הפצה.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה משתמש בריכוז מסוים של LME לחסל מיקרוגלים מתרבויות מועשרים נוירון של CGCs סלקטיבי. זה מייצג גישה ניסויית חזקה כדי לקבוע את ההשפעה של מיקרוגליה על נוירונים בתנאים שונים, וממשיך לספק נתונים חשובים לחוקרים חוקרים את התפקיד של neuroinflammation בהפרעות נוירולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
