Introduction
Solide tumorer formidler på tre måder: direkte invasion, lymfe spredning, og hematogenic spredning. Men der er en fjerde middel til kræft spredes, der ofte bort, formidling langs nerverne. Kræft neural invasion (CNI) er en velkendt rute kræftspredning, især i cancere i hoved og hals, 1 prostata 2, 3 og bugspytkirtel. 4-8 CNI forekommer i mere end 80% af personer med pancreas adenocarcinom, der fører til retroperitoneal tumor spredes gennem cøliaki ganglion nerver. Disse neurotropisk cancerceller har en enestående evne til at migrere ensrettet langs nerver mod centralnervesystemet (CNS). 9. Dette fund tyder på, at perineurale mikromiljø kan udnyttes af cancerceller, hvilket giver faktorer, der understøtter malign vækst.
En af de få in vitro-modeller til CNI forskning er dorsalrodsganglier (DRG) / kræftcelle model. Denne model anvendes ofte til undersøgelse af parakrin interaktion mellem neurale stroma og cancerceller. 10-18 I denne model mus eller humane cancercellelinjer dyrkes i ekstracellulær matrix (ECM) i nærheden præparater af frisk dissocierede dyrket DRG.
Denne video artikel viser anvendelsen af in vitro CNI i pancreas duktalt adenokarcinom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fire til seks uger gammel kvinde C57BL / CJ-mus (Harlan, Jerusalem, Israel) blev anvendt i forsøget ifølge Sammenslutningen for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care specifikationer. Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg og Institut for Landbrug regler.
1. Høst Rygmarven
- Aflive musen under anvendelse af en CO 2 kammer. Undgå cervikal dislokation, da det kan forårsage skade på ganglion rødder grundet forskydningskræfter. Herfra på, udføre alle trin under sterile forhold.
- Soak dyr ned med 70% ethanol. Dette trin er vigtigt for sterilisering og til at forhindre hår fra at trække gennem de indre organer.
- Efterlad musen til at tørre fra ethanol. Undgå enhver kontakt af ethanol med de indre organer på grund af neurotoksicitet.
- Efter tørring af musen, placere det ved hjælp af stifter i bugleje(Ansigtet nedad). Placer benene på hver bagben og forben.
- Med pincet, lave en midtlinjeincision strækker craniocaudally fra den bageste hals til lændehvirvelsøjlen. Dernæst hæve dermale flapper bilateralt med pincet og eksponere subkutane væv.
- Palpere mus kraniet indtil den når craniocervical krydset. Med en saks vinkelret på dyret, skære gennem de cervikale muskler og rygsøjlen på craniocervical motorvej (7 th halshvirvler), med tunge pincet. Dissekere rygsøjlen kaudalt og punktafgifter rygsøjlen med tunge pincet indtil den når lumbal niveau (hind lemmer niveau).
- Udfør en komplet caudale overskæring ved columna lumbalis niveau (det 5. lændehvirvel) med tunge pincet.
- Rul musen over (forsiden opad). Der er ikke behov for at dække snittet siden DRG ekstraheres fra lavere vertebrale niveauer og ikke livmoderhalsen.
- Skær ned på midterlinjen fra halsen til maven, trækkehud sideværts og derefter skæres for at åbne bughinden.
- Fjern de indre organer inde i bughinden (lever, milt, pancreas, mave, tarm og) en bloc. Dernæst fjerner de retroperitoneale organer (dvs., nyrer og bugspytkirtel). Kranialt åbne brystvæggen.
- Ved hjælp af pincet og en kirurgisk kniv, skar ribbenene, efterlader 5 mm ribben bilateralt væk fra rygsøjlen. På dette tidspunkt, er rygsøjlen adskilt fra resten af kroppen.
- Vask rygsøjlen fra blod med kold (4 ° C) frisk phosphatpufret saltvand (PBS) to gange.
2. Isolering dorsalrodsganglier (DRG)
- Brug et stereomikroskop med 4X forstørrelse.
- Placer rygsøjlen på et ikke-klæbende non absorberende platform (Telfa / nylon). Placer ryggen opad på samme kranio-caudale orientering.
- Fjern eventuelle spinal muskler og bindevæv. Brug ribbenene som et vartegn for nerver, som deforlade rygsøjlen. Ribs også beskytte nerverne fra de kirurgiske værktøjer. DRG er placeret ved de cervikale, thorax og lumbale lokaliteter af hvirvlerne.
- Dernæst med en saks klippe hvirvellegemet i midterlinjen og blotlægge rygmarven og DRG rødder ved forsigtig lateral tilbagetrækning af hvirvellegemet.
- I interkostale mellemrum, følge den perifere nerve medialt langs ribben lateralt i forhold til DRG.
- Identificer DRG. Det ligner blommen af 'spejlæg' liggende på nerven.
- Skær intercostal nerve distalt for DRG forlader 2-3 mm af nerve distalt for ganglier, som skal anvendes til tilbagetrækning. Denne "hale" vil blive fjernet efter høst.
- Tag fat i nerven med pincet. Klemme DRG kroppen selv vil forårsage neural celle skader og bør undgås.
- Approach DRG proksimalt langs dens tilknytning til rygmarven via sin forreste og bageste rødder.
- Påfør blid tilbagetrækning til DRG ved at trække efskellige nerve (interkostale nerve stump) sideværts, og skære den forreste og bageste rødder tæt på DRG.
- Opbevar DRG i en 35 mm petriskål fyldt med frisk, iskold DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% natriumpyruvat.
3. Implantation i petriskålen
- Udfør de næste skridt på is ved hjælp af pre-afkølet pipettespidser at forhindre ECM størkning.
- Under et stereomikroskop ved 2-4X forstørrelse, placere en 35 mm glasbund petriskål på et papir gitter.
VIGTIGT: Arbejdet med is for at holde ECM i flydende tilstand. Opret en diameter spot 1 mm (ca. 20 ul) af vækstfaktor-forarmet ECM ved midten af gitteret. - Under direkte visualisering, placere DRG i centrum for ECM stedet tæt på bunden af skålen.
Bemærk: De kræftceller, der anvendes i denne protokol er murine bugspytkirtelkræftceller (KPC) established fra frisk isolerede tumor prøver fra KPC mus som beskrevet andetsteds 19. - Harvest 40.000 kræftceller fra sammenflydende kulturer, vaske dem en gang med PBS, og resuspender dem i 40 pi ECM på is.
- Under direkte visualisering af gitteret ved hjælp af et stereomikroskop foranstaltning 500 um ved hver retning fra DRG. På dette tidspunkt langsomt frø 10.000 celler / 10 pi ECM. Brug en 2-10 pi forafkølet tip at injicere cellerne tæt på skålen bunden, undgå deres spredning i matrixen eller løsrivelse af matrixen. (Figur 1).
- Efterlad skålen i en laminær strømning i 10-15 min for at størkne. Undgå ECM tørring.
- Tilsæt langsomt DMEM, fremstillet som tidligere nævnt, mod sidevæggen af pladen. Tilsæt så medium til at dække ECM (ca. 2 ml).
- Sæt fadet tilbage til inkubatoren ved 37 ° C.
- Udskifte mediet med frisk medium på den følgende dag.
- Udskift medium hver 2 dage. </ Li>
4. dataopsamling, Time-lapse Videomicroscopy
- På dag 7 efter implantation, tage parabol for tidsforskydningen mikroskopi. Bemærk, at visse celler kan kræve overtagelse tidligere på grund af hurtigere migration.
- Under den direkte billedvisning, placere fadet i et lukket miljø på en gennemsnitlig temperatur på 37 ± 0,1 ° C og 5% CO2.
- Optag cellerne ved anvendelse af en ladningskoblet kamera placeret på mikroskopet.
- Tag digitaliserede billeder hver 10 min i op til 72 timer for at følge celle bevægelse fra tre til seks forskellige celler.
- Udskift medium efter 24 timer.
- Udfør dataindsamlings- og simpel analyse ved anvendelse mikroskopet software.
5. Data Analysis
- For mere avancerede applikationer (dvs. celle sporing i 2D eller 3D) bruger specialiseret software (såsom Imaris 4D). Bemærk: Denne software afgør xy koordinaterne for en celle påethvert givet tidspunkt, sammen med afstanden fra oprindelsen og hastighed af bevægelse.
- Beregne middelværdien hastighed ved at måle rejseafstand mellem efterfølgende positioner i 10 minutters intervaller. Beregn Forward Migration Index (FMI), som er afstanden fra cellens foran fra neurit og beskriver den ensrettede bevægelse af cellerne mod DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug video mikroskopi billedbehandling, kan DRG ses spiring neuritter 5-7 dage efter implantation, mens kræftcellerne migrere væk fra deres kolonier mod DRG. Ved den 7. dag efter implantationen, cancercellerne kommer i kontakt med neuritter (figur 2).
Fremad migration indeks over bugspytkirtelkræftceller anvendes i protokollen er 3-4 gange højere end for andre cellelinjer (QLL2, B16F) (figur 3a). Figur 3b viser en repræsentativ X og Y koordinat graf, der afbilder migreringsvej af en KPC cancercelle i kontakt med nerve; Time-lapse videomicroscopy analyse viste forskelle i den fremadgående bevægelse, men ikke hastighed mellem KPC-celler og ikke-invaderende celler (figur 3c-d).
gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 52.990 / 52990fig1.jpg "/>
Figur 1:. Skematisk illustration af protokollens Steps Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Cancercelleinvasion Langs Neuroner af DRG (a) DRG (øverst) og cancerceller (nederst) på dag 0 efter podning (5X forstørrelse). (B) DRG og kræft celler på dag 7 efter podning (5X forstørrelse). (C) Kræftceller migrerer langs DRG neuron (pile). Alle søjler repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Dorsal rodganglie (DRG) Neuroner Fremkald CNI (a) Nerve invasion indeks MiaPaCa2 cancerceller, KPC celler, QLL2 og NIH3T3 celler. (B) Et koordinatsystem graf, som viser migreringsvej af en KPC cancercelle i kontakt med nerve (rød) og QLL2 celle (lilla). Y og X-koordinater er vist. (N = 12-20 i hver gruppe). (C) Analyse af afstand fra oprindelsen af migrere QLL2 cancerceller med axonal kontakt og (d) KPC kræftceller (n = 20). Retningen af migration var konstant mod nerve ganglion. P-værdier i (a) blev beregnet ved tosidet Student t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel præsenterer en in vitro model, der rekapitulerer kræft mikromiljø i det neurale niche, DRG-modellen. Videoen viser alle trin fra at anerkende anatomiske landmærker såsom DRG i musen, dens udvinding, og endelig dens dyrkning i ECM. Co-dyrkning DRG sammen med kræftceller præsenteres også. Der er ingen andre modeller for in vitro perineural invasion forskning beskrevet i litteraturen gør denne model essentiel for at studere den perineurale niche microenvironment in vitro.
Protokollen præsenteret i videoen har to kritiske trin. Først bør der sørges når der gribes fat nerven tilstødende til DRG legeme (trin 2.7 i protokollen). Gribe eller klemme DRG kan forårsage irreversibel mekanisk eller iskæmisk skade på DRG forhindre det i at vokse og spiring når podet i petriskålen. Det andet kritiske trin er implantationaf kræftceller i petriskålen inde i ECM. Det er vigtigt at pode cellerne langsomt og med forsigtighed for at undgå flydende af celler og deres spredning over petriskålen. Formålet med implantation er at lokalisere cellerne på ét sted, for at lette sporing deres bevægelse (afstand og retning).
Når de er etableret model mikromiljø kan ændres i henhold til den testede hypotese. For eksempel at tilføje en tredje cellekultur til petriskålen (fx ikke-cancerceller) giver forskeren at sammenligne neurotropisk migration kapaciteter af forskellige celler. Desuden kan forskeren anvende forskellige betingelser (dvs. temperatur, fugtighed, opløselige faktorer, etc.) og undersøge deres effekt på celler invasion evne.
DRG-modellen gør det muligt for forskeren at studere samspillet mellem kræftceller og nerver. Det er også bruges til tidsindstilling forsøg, hvor morfologiskændringer i perineurale niche er påvist i en tidsmæssig måde. Endvidere kan neuroinvasive celler underkastes forskellige behandlinger og kan vurderes deres virkning på interaktionen med neuritter af ganglier.
Ikke alle cellelinie er egnet til DRG-modellen. De bør være cancerceller med den iboende evne til at invadere gennem nerve og at nedbryde ECM. Desuden bemærkes, at hver kræft celletype har forskellige invasion egenskaber og så den tid cellerne forventes at komme i kontakt med de DRG neuritter varierer. For eksempel, KPC celler vi brugte behov omkring 7 dage til at invadere gennem ECM mod DRG hvorimod MiaPaCa celler (humane pancreas adenocarcinom celler) behøver kun 72-96 timer at gøre denne kontakt.
En begrænsning ved denne model omfatter eventuelle uforenelighed med humane celler. På grund af sin brug af musen DRG, muse-humane protein-protein-interaktion kan ikke altid påvises når humand cancerceller anvendes. Når planlægger at bruge denne model med de to forskellige arter, bør homologien af den undersøgte protein skal testes, og hvis der er høj homologi assayet formodes at være egnede til evaluering af protein-protein interaktioner. I tillæg skal det erindres, at DRG-assayet som foreslået i denne protokol repræsenterer neurale mikromiljø herunder andre celler, ikke kun neuroner (dvs. Schwann-celler, fibroblaster, makrofager, etc.). Derfor kan specifikke cellepopulationer ikke testes specifikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
