Introduction
직접 침윤, 림프 확산 및 hematogenic 확산 : 고체 종양은 세 가지 방법으로 전파. 그러나, 자주 신경을 따라, 보급을 무시 암 확산의 제 4 수단이있다. 암성 신경 침윤 (CNI)는 특히 두경부 1 전립선 2, 3 및 췌장 암의 암 확산의 공지의 경로이다. 4-8 CNI 선도 췌장 선암 개인의 80 % 이상에서 발생 복강 신경절 신경을 통해 확산 복막 종양. 이러한 neurotropic 암 세포는 중추 신경계 (CNS) 방향으로 신경을 따라 일방향으로 이주 할 수있는 독특한 능력을 가지고있다. (9)이 결과는 신경초 미세이 악성 성장을 지원하는 인자를 제공하는, 암 세포에 의해 이용 될 수 있다는 것을 시사한다.
CNI 연구를위한 몇 체외 모델 중 하나는 후근 신경절 (DRG) / 암 세포 모델입니다. 이 모드엘 자주 갓 해리 배양 DRG의 준비에 인접한 세포 외 기질 (ECM)에서 재배되는이 모델, 마우스 또는 인간의 암 세포 라인에 신경 기질 암 세포 사이. 10-18 분비의 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다.
이 비디오 기사는 췌장 도관 선암에서 체외 CNI의 응용 프로그램을 보여줍니다.
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Protocol
6 주 된 여성 C57BL / CJ 마우스에 네살 (할란은, 예루살렘, 이스라엘) 평가 및 실험 동물 관리 사양의 인증을위한 협회에 따르면 실험에 사용 하였다. 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 농업 규정의 부에 따라 수행 하였다.
1. 수확 척수
- 공동이 챔버를 사용하여 마우스를 안락사. 이 전단력에 의한 신경절 뿌리에 손상을 줄 수 있습니다로 자궁 전위를 피하십시오. 여기부터, 멸균 조건에서 모든 단계를 수행합니다.
- 70 % 에탄올로 동물을 담근다. 이 단계는 살균 및 내부 기관을 통해 끌어으로부터 모발을 방지하는 것이 중요하다.
- 에탄올 건조 마우스를 둡니다. 신경 독성에 의한 내부 장기와 에탄올의 접촉을 방지합니다.
- 마우스를 건조시킨 후,하기 쉬운 위치에 핀을 사용하여 위치(면 아래로). 각각의 뒷다리와 앞다리의 핀을 배치합니다.
- 집게를 사용하여 요추의 후방 목 craniocaudally 연장하는 중간 선 절개를합니다. 다음, 집게를 사용 양자 피부 플랩을 올리고 피하 조직을 노출.
- craniocervical 접합에 도달 할 때까지 마우스 두개골을 만져. 무거운 집게를 사용하여 craniocervical 접합 (7 번째 경추)에서 자궁 근육과 척추를 잘라 동물, 수직 가위를 사용하여. 꼬리 쪽 척추를 해부 및 요추 수준 (뒷다리 레벨)에 도달 할 때까지 무거운 집게로 척추를 절제.
- 무거운 집게를 사용하여 요추 수준 (5 번째 요추 척추)에서 완벽한 꼬리 절개를 수행합니다.
- (직시) 마우스를 롤오버. DRG는 자궁을 하부 척추 레벨에서 추출되어 있지 않기 때문에 절개를 커버 할 필요는 없다.
- 복부에 목의 중간 선에서 삭감의 철회피부는 측면 후 복막을 엽니 다 잘라.
- 일괄 복막 내부의 내부 장기 (간, 비장, 췌장, 위, 그리고 소장)를 제거합니다. 다음으로, 복막 기관 (즉, 신장 및 췌장)를 제거합니다. 두개쪽으로는 가슴 벽을 엽니 다.
- 집게 및 수술 블레이드를 사용하여, 양자 떨어져 척추에서 갈비의 5mm를 떠나, 갈비뼈를 잘라. 이때, 척추가 몸의 나머지로부터 분리된다.
- 두 번 감기 (4 °에 C) 신선한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 혈액의 척추을 씻으십시오.
2. 격리를 등쪽 뿌리 신경절 (DRG)
- 4 배의 배율을 가진 실체 현미경을 사용합니다.
- 비 부착 비 흡수 플랫폼 (Telfa / 나일론)에 척추를 놓습니다. 같은 부교감-꼬리 방향에서 척추의 얼굴을 놓습니다.
- 모든 척추 근육과 결합 조직을 제거합니다. 그들은 같은 신경 랜드 마크로서 리브를 사용하여척추를 둡니다. 리브는 수술 도구에서 신경을 보호합니다. DRG는 척추의 경추, 흉추, 요추 사이트에 있습니다.
- 다음으로, 사용 가위는 중간 선에서 척추 몸을 절감하고 척추 신체의 부드러운 측면 후퇴하여 척수 및 DRG 뿌리를 노출합니다.
- 늑간 공간에서, DRG에 리브 측면을 따라 내측 주변 신경을 따르십시오.
- DRG를 확인합니다. 그것은 신경에 누워 '기름에 튀긴 된 계란'의 노른자처럼 보인다.
- 신경절에 신경 말단의 2-3mm 떠나 DRG에 늑간 신경 말단을 잘라 후퇴에 사용합니다. 이 "꼬리"수확 후 제거됩니다.
- 집게를 사용하여 신경을 잡고. DRG 본체 자체를 곤란하게하는 신경 세포 손상의 원인이됩니다 피해야한다.
- 그 전방 및 후방 뿌리를 통해, 근위 척수에 첨부 파일을 따라 DRG 접근.
- EF의를 당겨 DRG에 부드러운 철회를 적용ferent 신경 (늑간 신경 루터) 측면 및 DRG에 가까운 전방 및 후방 뿌리를 잘라.
- 10 % 소 태아 혈청 (FCS)이 보충 된 신선한 빙냉 DMEM, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 % 비 필수 아미노산, 1 % 나트륨 피루 베이트로 가득 35mm 페트리 접시에서 DRG 유지.
페트리 접시 3. 주입
- ECM의 응고를 방지하기 위해 사전 냉각 피펫 팁을 사용하여 얼음에 다음 단계를 수행합니다.
- 2-4X 배율의 실체 현미경에서 종이 그리드에 35mm의 유리 바닥 배양 접시를 놓습니다.
중요 : 액체 상태의 ECM을 유지하기 위해 얼음 작업. 격자의 중심에서 성장 인자 제거 된 ECM을 1mm 직경의 스폿 (약 20 μL)을 만든다. - 직접 시각화 하에서, 접시의 바닥에 가까운 ECM 스폿의 중심에 DRG를 배치했다.
주 :이 프로토콜에서 사용하는 암 세포는 뮤린 췌장암 세포 (KPC) establis다른 곳에서 19 설명 된대로 KPC 쥐에서 갓 격리 된 종양 표본에서을 hed. - 융합 문화에서 수확 40,000 암 세포는 PBS로 한번 씻어, 얼음에 40 μL의 ECM에서 그들을 재현 탁.
- DRG에서 각 방향에서 입체 측정 500 μm의를 사용하여 그리드의 직접 시각화에서. 이 시점에서 천천히 10,000 세포 / 10 ㎕의 ECM을 시드. 행렬의 행렬 또는 분리 자신의 확산을 방지 접시 바닥에 가까운 세포를 주입하는 2-10 μl의 예비 냉각 팁을 사용합니다. (그림 1).
- 응고하기 10 ~ 15 분 동안 층류 후드 내에서 접시를 남겨주세요. ECM 건조하지 마십시오.
- 천천히 플레이트의 측벽에 대하여, 앞서 언급 한 바와 같이 제조 된 DMEM을 추가한다. 전자 재료 (약 2 ㎖)에 충분한 매체를 추가합니다.
- 37 ° C에서 다시 인큐베이터에 접시를 넣습니다.
- 다음 날에 신선한 매체와 매체를 교체합니다.
- 2 일마다 배지를 교체합니다. </ 리>
4. 데이터 수집, 시간 경과 Videomicroscopy
- 이식 후 7 일째에, 시간 경과 현미경을위한 요리를 취할. 특정 세포로 인해 빠르게 마이그레이션 이전에 획득을 필요로 할 수 있습니다.
- 라이브 이미징 동안 37 ± 0.1 ° C, 5 % CO 2의 평균 온도에서 폐쇄 된 환경에서 접시를 놓습니다.
- 현미경에 배치 된 전하 결합 소자 카메라를 사용하여 셀을 기록한다.
- 3 ~ 6 가지 세포에서 세포 운동을 수행하는 72 시간까지에 대한 디지털화 된 이미지마다 10 분 가져 가라.
- 24 시간 후 배지를 교체합니다.
- 데이터 수집 및 현미경 소프트웨어를 이용하여 간단한 분석을 수행한다.
5. 데이터 분석
- 고급 응용 프로그램 (즉, 2D 또는 3D 세포 추적) (예 : Imaris 4D 등) 전문 소프트웨어를 사용하십시오. 참고 :이 소프트웨어에서 셀의 XY 좌표를 결정한다모든 움직임의 원점으로부터의 거리, 및 속도와 함께, 시간 지정.
- 10 분 간격으로 연속적인 위치 사이의 주행 거리를 측정하여 평균 속도를 계산한다. 신경 돌기의 셀 전면의 거리이며 DRG 향한 세포의 방향성 움직임을 설명하는 전달 마이그레이션 지수 (FMI)를 계산한다.
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Representative Results
비디오 현미경 영상을 사용하여, DRG는 암세포가 DRG에 대한 그들의 콜로니로부터 멀리 이주 동안 주입 후 신경 돌기 5-7 일간 발아 알 수있다. 이식 후 7 일째에 의해, 암 세포는 신경 돌기 (도 2)와 접촉.
이 프로토콜에서 사용되는 췌장암 세포의 전방 이동 지수는 다른 세포주 (QLL2, B16F) (도 3a)보다 배 이상 3-4이다.도 3B는 대표적인 X 제시 도표와 Y는 이동 경로를 나타내는 그래프 좌표 신경 접하는 KPC 암 세포; 저속 videomicroscopy 분석은 KPC 세포 및 비 침략 세포 (도 3C-D) 사이의 전방 이동의 차이가 아니라 속도를 보여 주었다.
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그림 1 :. 프로토콜 단계의 도식 그림 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. DRG의 뉴런을 따라 암 세포 침략의 (a) DRG (위) 및 (5 배 확대)를 파종 후 0 일에 암 세포 (아래). (b)는 DRG와 (5 배 확대)를 파종 후 암 7 일에 세포를. (c) 종양 세포는 DRG 신경 세포 (화살표)을 따라 이동한다. 모든 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 등쪽 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런은 CNI를 유도 (가) MiaPaCa2 암 세포, KPC 세포, QLL2 및 NIH3T3 세포의 신경 침공 인덱스입니다. (b) 상기 신경 (적색)과 QLL2 셀 (보라색)에 접하는 KPC 암세포의 이동 경로를 나타내는 그래프 좌표. 는 Y와 X 좌표가 표시됩니다. (N = 각 그룹에서 12-20). 축삭 접촉 및 (d) KPC 암세포 (N = 20)와 QLL2 암세포 마이그레이션의 원점으로부터의 거리 (c) 분석. 이주의 방향이 신경 신경절을 향해 끊임없이이었다. (a)는 양면 학생 t 테스트에 의해 계산되었다에서 P 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에서는 신경 틈새에서 암의 미세 환경의 DRG 모델을 되풀이되었습니다 체외 모델을 제시한다. 비디오는 같은 마우스에서 DRG, 그 추출 및 ECM의 마지막으로, 그 배양으로 해부학 적 랜드 마크를 인식에서 시작하여 모든 단계를 보여줍니다. 공동 배양 암세포 나란히 DRG 또한 제공된다. 체외에서 신경초 틈새 미세 환경 연구를위한이 모델은 필수적 만드는 문헌에 기재된 체외 신경초 침윤 연구를위한 다른 모델이 없습니다.
비디오에 제시된 프로토콜은 두 가지 중요한 단계가 있습니다. DRG 본체 (프로토콜의 단계 2.7)에 인접한 신경을 파악 첫째,주의를 기울여야합니다. 파악 또는 DRG 곤란하면 DRG에 돌이킬 수없는 기계적 또는 허혈성 손상이 성장하고 페트리 접시에 시드 때 돋아에서 방지 될 수 있습니다. 두번째 중요한 단계이다 주입전자 재료 내부의 페트리 접시에 암세포. 천천히 그리고 신중하게 세포를 배정하는 세포의 부동과 페트리 접시 위에 자신의 확산을 방지하는 것이 중요하다. 주입의 목적은 이동 (거리와 방향)을 추적하기 용이 한 곳에 세포 지역화한다.
확립되면 모델 미세는 가설 테스트에 따라 변경 될 수있다. 예를 들어, 페트리 접시 (예를 들어, 비 - 암세포)에 제 세포 배양 물을 첨가하여 다른 세포의 neurotropic 마이그레이션 기능을 비교하는 연구를 가능하게한다. 또한, 연구원은 서로 다른 조건 (즉, 온도, 습도, 수용성 요소 등)을 적용하고 세포의 침윤 능력에 미치는 영향을 검사 할 수 있습니다.
DRG 모델은 암 세포와 신경 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 연구를 가능하게한다. 또한 시간 경과 실험에 사용되는 형태의신경초 틈새 시장의 변화는 시간적인 방식으로 입증된다. 또한, neuroinvasive 세포는 다양한 치료를 실시 할 수 있고, 신경의 신경 돌기과의 상호 작용에 대한 영향이 평가 될 수있다.
아니 모든 세포주는 DRG 모델에 적합하다. 그들은 신경을 통해 침입하고 ECM을 저하 고유 능력을 가진 암세포해야합니다. 또한, 각각의 암 세포 유형이 상이한 내습 특성을 가지며, 따라서 시간이 셀이 DRG 신경 돌기가 변화와 접촉 예정 참고. 예를 들어, KPC 세포가 우리가 접촉하도록 단지 72-96 시간이 필요 MiaPaca 세포 (인간 췌장 선암 세포) 반면 DRG 향해 ECM 통해 침입하는 약 7 일 필요가 사용된다.
이 모델의 한계는 인간의 세포와 가능한 호환성을 포함한다. DRG 인해 마우스의 사용에있어서의 마우스 - 인간 단백질 - 단백질 상호 작용을 항상 증명 될 수없는 경우 후인간 암 세포가 사용된다. 두 가지 종 모델을 사용하고자 할 때마다 검사 단백질의 상 동성을 테스트해야 높은 상 동성이있는 경우, 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 평가하기에 적합한 것으로 가정한다. 뿐만 아니라,이 프로토콜에 제안 된대로 DRG 분석은 다른 세포뿐만 아니라 신경 세포 (즉, 슈반 세포, 섬유 아 세포, 대 식세포 등)을 포함하는 신경 미세 환경을 나타내는 명심해야한다. 따라서, 특정 세포 집단을 구체적 시험 될 수 없다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
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