Introduction
doğrudan işgali, lenfatik yayılım ve hematojenik yayılma: solid tümörler üç ana şekilde yaymak. Ancak, sık sık sinirler boyunca, yayılmasını dikkate alınmaz kanser yayılmış bir dördüncü araç yoktur. Kanserli nöral invazyon (CNI) özellikle baş ve boyun, 1 prostat 2, 3 ve pankreas kanserlerinde, kanser yayılmış iyi bilinen bir yoldur. 4-8 CNI lider, pankreas adenokarsinomu olan bireylerin% 80'den fazla oluşur çölyak ganglion sinirler yoluyla yayılan retroperitoneal tümör. Bu nörotropik kanser hücreleri, merkezi sinir sistemi (MSS) doğru sinirler boyunca tek yönlü göç için eşsiz bir yeteneği var. 9 Bu bulgu perinöral mikroçevresinin malign büyümeyi destekleyen faktörleri sağlayarak, kanser hücreleri tarafından istismar edilebileceğini göstermektedir.
CNI araştırma için birkaç tane in vitro model bir arka kök gangliyon (DRG) / Kanser hücresi modelidir. bu modEl sık taze ayrışmış kültürlenmiş DRG preparasyonlar bitişik hücre dışı matris (ECM) yetiştirilen bu model, fare ya da insan kanser hücre çizgileri nöral stroma ve kanser hücreleri arasında. 10-18 parakrin etkileşimi incelemek için kullanılır.
Bu video makalede pankreas duktal adenokarsinom in vitro CNI uygulamasını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Altı haftalık dişi C57BL / CJ fareler de dört (Harlan, Kudüs, İsrail) Değerlendirme ve Laboratuar Hayvan Bakımı spesifikasyonları Akreditasyon Derneği göre deneyde kullanıldı. Tüm deney prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Tarım düzenlemeler Bölümü uyarınca yapılmıştır.
1. Hasat Omurilik
- CO 2 odasının kullanarak fare Euthanize. o kesme kuvvetlerine bağlı ganglion köklerine zarar verebilir servikal dislokasyon kaçının. Buradan itibaren, steril koşullar altında tüm adımları gerçekleştirmek.
- % 70 etanol ile hayvan aşağı ıslatın. Bu adım, Sterilizasyon ve iç organlar içinden sürükleyerek saç önlemek için önemlidir.
- etanol kurumaya fareyi bırakın. nörotoksisite nedeniyle iç organları ile etanol herhangi bir temas önleyin.
- Fareyi kurutulduktan sonra, yüzüstü pozisyonda işaretçilerine kullanarak konumlandırmak(yüz aşağı). Her hindlimb ve ön ayakları üzerinde işaretçilerine yerleştirin.
- forseps kullanarak, lomber, posterior boyun craniocaudally uzanan bir orta hat kesi yapmak. Sonraki, forseps kullanarak iki taraflı dermal flep yükseltmek ve deri altı doku maruz kalmaktadır.
- kraniyoservikal kavşak ulaşıncaya kadar fare kafatası palpe ediniz. Ağır forseps kullanarak, Kraniyoservikal kavşağı (7. servikal vertebra) servikal kas ve omurga kesti hayvana, dik makas kullanma. kaudal omurga incelemek ve lomber seviyesi (arka bacaklarda seviyesi) ulaşana kadar ağır forseps ile omurga tüketim.
- Ağır forseps kullanarak lomber seviyede (5. bel omuru) bir tam kuyruk kesiye gerçekleştirin.
- (Yüz yukarı) fareyi üzerine yuvarlayın. DRG servikal vertebra düşük seviyelerde elde olmadığı ve insizyon kaplanmasına gerek yoktur.
- Karın boyun orta hatta kısmak geriCilt yanal ve sonra periton açmak için kesti.
- En blok periton içine iç organları (karaciğer, dalak, pankreas, mide ve bağırsak) sökün. Sonraki retroperitoneal organlar (örneğin, böbrekler ve pankreas) çıkarın. Cranially, göğüs duvarı açın.
- forseps ve cerrahi bıçak kullanarak, bilateral uzak vertebral kolonun gelen kaburga 5 mm bırakarak, kaburga kesti. Bu noktada, omurga gövdesinin geri kalanından ayrılır.
- iki kez soğuk (4 ° C), taze fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile kandan vertebral kolon yıkayın.
2. Yalıtımlı Dorsal Kök Gangliyon (DRG)
- 4X büyütme ile Stereomikroskopta kullanın.
- bir yapışmayan emici olmayan bir platformda (Telfa / naylon) üzerine omurga yerleştirin. Aynı kranyokaudal yönelim de omurga yüzü yukarı yerleştirin.
- herhangi bir omurga kasları ve bağ dokusu çıkarın. onlar da sinirler için bir dönüm noktası olarak kaburga kullanınomurga bırakın. Kaburga da cerrahi aletler sinirleri korur. DRG omurların servikal, torakal ve lomber sitelerinde yer almaktadır.
- Sonraki kullanarak makas orta hatta omur gövdesi kesme ve omur gövdesinin hafif yanal geri çekilmesi ile omurilik ve DRG kökleri maruz kalmaktadır.
- interkostal aralıkta, DRG için kaburga yanal boyunca medial periferik sinir izleyin.
- DRG tanımlayın. Bu sinir yatan 'kızarmış yumurta' sarısı gibi görünüyor.
- ganglionlar sinir distalinde 2-3 mm bırakarak DRG için interkostal sinir distalinde Kes, geri çekme için kullanılır. Bu "kuyruk" hasattan sonra silinecektir.
- forseps kullanarak sinir kavrayın. DRG vücudu kendisi kısma nöral hücre hasarına neden olur ve kaçınılmalıdır.
- onun anterior ve posterior kökler vasıtasıyla, proksimale omurilik onun eki boyunca DRG yaklaşın.
- ef çekerek DRG nazik geri çekme uygulaferent sinir (interkostal sinir güdük) yanal ve DRG yakın ön ve arka kökleri kesmek.
- % 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş taze buz DMEM,% 1 penisilin-streptomisin,% 1 temel olmayan amino asitler ve% 1 sodyum piruvat ile dolu bir 35 mm Petri kabı DRG tutun.
Petri Dish 3. İmplantasyonu
- ECM katılaşma önlemek için önceden soğutulmuş pipet uçları kullanılarak buz üzerinde sonraki adımları gerçekleştirin.
- 2-4x büyütme bir stereomikroskop altında, bir kağıt ızgara üzerinde 35 mm cam alt petri yerleştirin.
ÖNEMLİ: sıvı halde ECM tutmak için buz üzerinde çalışma. ızgarasının merkezinde büyüme faktörü-tükenmiş ECM'nin 1 mm çapında bir nokta (yaklaşık 20 ul) oluşturur. - direk görüş altında, çanak dibine yakın ECM nokta merkezine DRG yerleştirin.
Not: Bu protokolde kullanılan kanser hücreleri fare pankreas kanseri hücreleri (KPC) establisbaşka yerde 19 açıklandığı gibi KPC farelerden alınan taze izole tümör örneklerinden hed. - birleşik kültürlerinden hasat 40.000 kanser hücreleri, bir kez PBS ile yıkayın ve buz üzerinde 40 ul ECM bunları tekrar süspansiyon.
- DRG her yönde bir stereomikroskopta ölçüsü 500 mikron kullanarak ızgara direk görüş altında. Bu noktada yavaş 10.000 hücre / 10 ul ECM tohum. matris matris veya ayrılma onların yayılmasını önlemek, çanak dibine yakın hücreleri enjekte etmek için bir 2-10 ul soğutulmuş ucu kullanın. (Şekil 1).
- katılaşmaya 10-15 dakika boyunca, bir laminar akış başlığı içinde çanak bırakın. ECM kurumayı önlemek.
- Yavaş yavaş plakanın yan duvarına karşı, daha önce belirtildiği gibi hazırlandı, DMEM ekleyin. ECM (yaklaşık 2 ml) karşılamak için yeterli orta ekleyin.
- 37 ° C'de geri inkübatör çanak koyun.
- ertesi gün taze ortam ile orta değiştirin.
- 2 günde orta yerine. </ Li>
4. Veri Toplama, Time-lapse videomikroskopi
- implantasyonu sonrası 7. gününde, zaman atlamalı mikroskopi için çanak almak. Bazı hücreler nedeniyle hızlı göç önceki satın alma gerektirebilir unutmayın.
- Canlı görüntüleme sırasında, 37 ± 0.1 ° C ve% 5 CO2 ortalama sıcaklıkta kapalı bir ortamda koyunuz.
- mikroskop üzerine yerleştirilen bir şarj akuplaj düzenli kamera kullanarak hücreleri kaydedin.
- üç ila altı farklı hücrelerin hücre lokomosyon takip 72 saat kadar için dijital görüntüleri her 10 dakika sürer.
- 24 saat sonra orta değiştirin.
- veri toplama ve mikroskop yazılımı kullanılarak basit analiz gerçekleştirin.
5. Veri Analizi
- Daha gelişmiş uygulamalar (örneğin, 2D veya 3D hücre izleme) (örneğin Imaris 4D gibi) özel yazılım kullanın. Not: Bu yazılım bir hücrenin xy koordinatları belirlerherhangi bir hareket kökenli mesafe ve hızı ile birlikte, zaman verilir.
- 10 dakika aralıklarla sonraki konumlar arasındaki seyahat mesafe ölçülerek ortalama hız hesaplayın. akson hücre ön mesafedir ve DRG doğru hücrelerin tek yönlü hareketini açıklar İleri Göç İndeksi (ATK) hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Video mikroskopi görüntüleme kullanılarak, DRG kanser hücrelerinin DRG karşı olan kolonilerden uzak göç ederken implantasyon sonrası neurites 5-7 gün çimlenme görülebilir. Implantasyonu sonrası 7. gün, kanser hücreleri neurites (Şekil 2) ile temas.
Protokolünde kullanılan pankreas kanser hücrelerinin ileri geçiş göstergesi, diğer hücre hatları (QLL2, B16F) (Şekil 3a) ki kat daha yüksek 3-4. 3b Örnek X sunulur Şekil ve Y, geçiş yolu gösteren, grafik koordinat sinir ile temas halinde KMG kanser hücresi; Time-lapse videomikroskopi analizi KPC hücreleri ve olmayan işgalci hücreleri (Şekil 3c-d) arasında ileri hareketinde farklılıkları değil hız gösterdi.
şekil 1 "src =" / files / ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
Şekil 1:. Protokol Adımlar şematik İllüstrasyon bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. DRG nöronlarında boyunca kanser hücresi yayılımını tamamen (a) DRG (üst) ve (5X büyütmede) tohumlama sonra 0. günde kanser hücrelerinin (alt). (B) DRG ve (5X büyütme) tohumlama sonra kanser 7. gününde hücreler. (C) Kanser hücreleri DRG nöron (oklar) boyunca göç eder. Tüm barlar 50 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Dorsal kök ganglion (DRG) nöronları CNI Uyarmaktadır, (a) MiaPaCa2 kanser hücrelerinin, KMG hücreleri QLL2 ve NIH3T3 hücrelerinin sinir yayılmasıyla dizini. (B) bir sinirin (kırmızı) ve QLL2 hücresi (mor) ile temas halindeki bir KMG kanser hücresinin geçiş yolu gösteren grafik koordine ederler. Y ve X koordinatları gösterilir. (N = her grupta 12-20). Aksonal temas ve (d) KMG kanser hücreleri (N = 20) ile QLL2 kanser hücrelerinin göç kökenli mesafe (c) Elde edilen analiz. Göç yönü sinir ganglion doğru sürekli oldu. (A) iki taraflı Student t testi ile hesaplanmıştır P değerleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale sinir niş kanserli mikro, DRG modeli özetlediği in vitro bir model sunuyor. Video bu tür fare DRG, onun çıkarılması ve ECM nihayet, onun kültürleme olarak anatomik işaretlerini tanıma başlayarak tüm adımları gösterir. Eş-kültür kanser hücreleri ile beraber DRG da sunulmaktadır. In vitro perinöral niş mikro çalışmak için bu model gerekli hale literatürde tarif edilen in vitro perinöral invazyon araştırma için başka bir model vardır.
video sunulan protokol iki kritik adımlar vardır. DRG gövdesine (protokolünde adım 2.7) bitişik sinir açgözlü İlk olarak, dikkatli olunmalıdır. Açgözlü veya DRG kıstırma DRG geri dönüşümsüz mekanik veya iskemik hasar büyüyen ve Petri kabındaki numaralı seribaşı zaman çimlenme engelleyen neden olabilir. İkinci kritik bir adım implantasyon olduğunuECM içindeki Petri kabındaki kanser hücrelerinin. Yavaş ve dikkatli hücreleri tohum hücrelerinin yüzen ve Petri kabı üzerindeki yayılmasını önlemek için önemlidir. implantasyon amacı kendi hareketini (mesafe ve yön) izleme kolaylaştırmak için, tek bir yerde hücreleri lokalize etmektir.
Kurulan kez modeli mikroçevresinin test hipotezine göre modifiye edilebilir. Örneğin, petri kabı (örneğin, kanserli olmayan hücre) için üçüncü bir hücre kültürü ilave farklı hücre nörotropik geçiş yeteneklerini karşılaştırmak için araştırmacı sağlar. Ayrıca, araştırmacı farklı koşullar (yani, sıcaklık, nem, çözünür faktörler, vb) uygulamak ve hücre işgali yeteneği üzerindeki etkisini inceleyebilirsiniz.
DRG modeli kanser hücreleri ve sinirler arasındaki etkileşimi incelemek için araştırmacı sağlar. Ayrıca, zaman atlamalı deneyleri için kullanılan morfolojik olarakperinöral niş içinde değişiklikler geçici moda gösterilmiştir. Ayrıca, neuroinvasive hücreleri çeşitli muamelelere tabi olabilir ve gangliyonların nöritleri olan etkileşimi üzerindeki etkisi değerlendirilebilir.
Her hücre hattı DRG modeli için uygundur. Onlar sinir yoluyla işgal etmeye ve ECM aşağılamak içsel yeteneği ile kanser hücreleri olmalıdır. Ayrıca, her kanser hücre tipi farklı işgali özelliklere sahiptir ve bu yüzden zaman hücreleri DRG neurites değişir ile temas kurmaya bekleniyor unutmayın. Örneğin, KPC hücreleri o kişiyi yapmak için sadece 72-96 saat gerekir MiaPaCa hücreleri (insan pankreas kanseri hücrelerinin) ise DRG doğru ECM yoluyla işgal etmeye yaklaşık 7 gün ihtiyacı kullanılır.
Bu modelin bir sınırlama insan hücreleri ile mümkün uyumsuzluk bulunmaktadır. Nedeniyle fare DRG kullanımına, fare-insan protein-protein etkileşim her zaman ortaya edilemediği durumlarda huAdam, kanser hücreleri kullanılır. iki farklı türlerin, bu model kullanmak için planlama zaman, incelenen protein homoloji test edilmelidir ve yüksek homoloji varsa deney, protein-protein etkileşimleri değerlendirmek için uygun olduğu düşünülmektedir. Yanı sıra, bu protokolde önerildiği gibi DRG deneyi diğer hücrelere değil, sadece nöronların (yani, Schwann hücreleri, fibroblastlar, makrofajlar, vb) dahil olmak üzere nöral mikroçevresinin temsil ettiği akılda tutulmalıdır. Bu nedenle, belirli bir hücre popülasyonları, özellikle test edilemez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
