Introduction
直接浸润，淋巴扩散和传播血源性：固体肿瘤的三种主要方式传播。然而，有癌症扩散的第四手段是经常忽视，传播沿着神经。癌神经侵袭（CNI）是癌症扩散的一个公知的途径，尤其是在头部和颈部，1前列腺2，第3和胰腺的癌症。4-8 CNI与胰腺癌的个体的80％以上发生，导致到腹膜后肿瘤，通过腹腔神经节的神经传播。这些神经营养癌细胞具有沿着朝向中枢神经系统（CNS）的神经单向迁移的独特能力。9这一发现表明，在神经周围的微环境可以由癌细胞被利用，提供支持恶性生长因子。
为数不多的体外模型CNI研究的是背根神经节（DRG）/肿瘤细胞模型。这个mod埃尔经常用于研究神经基质和癌细胞10-18之间。旁分泌相互作用在该模型中，小鼠或人肿瘤细胞株中相邻新鲜分离培养的DRG的制剂外基质（ECM）中生长。
此视频介绍了在体外CNI在胰腺导管腺癌中的应用。
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Protocol
四到六周大的雌性C57BL / CJ小鼠（Harlan，耶路撒冷，以色列）在实验中根据协会评估和实验动物管理规范评审使用。所有实验程序均按照机构动物护理和使用委员会和农业法规部完成。
1.收获脊髓
- 安乐死使用CO 2室中的小鼠。避免颈椎脱位，因为它可能会导致因剪切力根神经节破坏。从这里开始，执行无菌条件下的所有步骤。
- 浸泡动物向下，用70％的乙醇。这个步骤是用于杀菌和防止头发从通过内器官拖动重要。
- 离开鼠标乙醇干燥。防止乙醇与因神经毒性的内脏有任何接触。
- 干燥后鼠标，在俯卧位使用引脚放置它（面朝下）。将每个后肢和前肢的针脚。
- 使用镊子，使从后颈部到腰椎craniocaudally延伸的中线切口。其次，提高真皮皮瓣两侧使用镊子，揭露皮下组织。
- 触诊鼠标头骨直至到达颅颈交界区。使用垂直于动物通过颈椎部肌肉和脊椎在颅颈交界区（ 第 7颈椎）切剪刀，采用重钳。尾部解剖脊椎和消费重钳脊柱直到达到腰椎水平（后肢级）。
- 在使用重型钳腰椎水平（ 第 5腰椎）执行一个完整的尾部横切。
- 将鼠标移到（面朝上）。没有必要覆盖切口自DRG选自低级椎骨水平抽取，而不是颈椎。
- 从颈部到腹部正中线砍掉，收回皮肤侧向然后切打开腹膜。
- 整块除去腹膜内的内部器官（肝，脾，胰，胃和肠）。接下来，取出腹膜后脏器（ 如肾脏和胰腺）。颅，打开胸壁。
- 使用镊子和手术刀片，切开肋，留下肋5毫米从脊柱双边远。在这一点上，脊柱是从身体的其余部分隔开。
- 用冷的（4℃）新鲜磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗两次，从血液中的脊柱。
2.隔离背根神经节（DRG）
- 使用具有放大4倍立体显微镜。
- 上的非贴壁非吸收性平台（Telfa /尼龙）脊椎的位置。脊柱面朝上在同一头尾定向位置。
- 卸下所有脊柱的肌肉和结缔组织。使用肋骨作为神经，因为他们具有里程碑意义离开脊椎。排骨也保护神经从外科手术工具。背根神经节位于颈椎，胸椎，腰椎的椎骨的位点。
- 接着，使用剪刀切割椎体在中线和椎体的温和横向缩回暴露脊髓和背根神经节的根。
- 在肋间，按照周围神经内侧沿肋部横向到DRG。
- 识别DRG。它看起来像'荷包蛋'躺在神经的蛋黄。
- 切肋间神经远离DRG离去2-3毫米神经远端的向神经节，以用于回缩。这个“尾巴”，将收获之后去除。
- 使用镊子抓住神经。捏DRG体本身会引起神经细胞损伤和应当避免。
- 接近DRG沿其附着到脊髓近侧，通过其前部和后部的根。
- 通过拉动EF适用于温和回缩到DRG同的神经（肋间神经断端）横向，并切断前部和后部根部靠近DRG。
- 保持DRG在35毫米的培养皿中装有补充有10％胎牛血清（FCS）的新鲜，冰冷的DMEM，1％青霉素 - 链霉素，1％非必需氨基酸和1％丙酮酸钠。
3.植入培养皿
- 使用预冷枪头，以防止ECM凝固执行冰下一个步骤。
- 根据在2-4X放大立体显微镜，放在一个纸格35毫米的玻璃底培养皿。
重要提示：为了保持ECM液态冰的工作。在网格的中心创建生长因子耗尽的ECM的1mm直径的点（约20微升）。 - 在直视下，将DRG在ECM点靠近盘底部的中心。
注：本协议所使用的癌细胞的小鼠胰腺癌细胞（KPC）establis如其他地方19说明从小鼠KPC新鲜分离的肿瘤标本建置。 - 收获40000癌细胞融合的培养，用PBS洗他们一次，并在冰40微升ECM重悬。
- 下，使用立体显微镜量度500微米在从DRG每个方向上的网格的直接可视化。此时慢慢种子10,000个细胞/ 10微升的ECM。使用2-10微升预冷尖端注入靠近培养皿底部的细胞，从而避免在基质的基质或脱离其蔓延。 （ 图1）。
- 发表层流罩内的菜10-15分钟固化。避免ECM干燥。
- 慢慢加入DMEM，如前所述制备，对板的侧壁。添加足够的介质，以覆盖的ECM（约2毫升）中。
- 把盘返回到培养箱中于37℃。
- 替换于次日新鲜培养基中。
- 更换培养基，每2天。</ LI>
4.数据采集，定时电视显微镜
- 在植入后第7天，采取时间的推移显微镜菜。请注意，某些细胞可能会更早需要获取由于更快的迁移。
- 在实时成像，放置在一个封闭环境中的培养皿，在37±0.1℃和5％的CO 2的平均温度。
- 通过使用放置在显微镜电荷耦合器件照相机记录的细胞。
- 取数字化图象，每10分钟达72小时，从三个到六个不同的细胞遵循细胞运动。
- 24小时后更换培养基。
- 进行数据采集和使用显微镜软件简单的分析。
5.数据分析
- 对于更高级的应用程序（ 即 ，在二维或三维细胞跟踪）使用专门的软件（如了Imaris 4D）。注意：该软件在决定了小区的XY坐标任何给定的时间，用自原点运动的距离和速度沿。
- 通过测量在10分钟的间隔后续位置之间的行驶距离计算平均流速。计算前向迁移指数（FMI），它是细胞前从突起的距离，并描述朝向DRG细胞的单向运动。
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Representative Results
使用视频显微成像，在DRG可以看出植入后轴突发芽5-7天，而癌细胞他们对DRG殖民地迁移了。通过在植入后第 7天，肿瘤细胞来与所述突起（ 图2）接触。
在协议中使用的胰腺癌细胞的前向迁移指数为3-4倍比其它细胞系（QLL2，B16F）（ 图3a）更高。 图3b给出一个代表X和Y坐标图，描绘了迁移路径在与神经接触KPC癌细胞;时间推移电视显微镜分析显示KPC细胞和非侵入细胞（ 图3c-d）中之间在向前运动的差别，但不速度。
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图1：在协议步骤的示意图 ，请点击此处查看该图的放大版本。
图2：癌细胞侵袭沿着DRG的神经元 （ 一 ）DRG（顶部）和癌细胞（底部）在第0天播种（5X倍率）后。 （ 二 ）DRG和播种（放大5倍）癌症后第7天的细胞。 （ 三 ）癌细胞沿神经DRG（箭头）迁移。所有酒吧代表50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：背根神经节（DRG）神经元诱导CNI（ 一 ）的MiaPaCa2癌细胞，KPC细胞，QLL2和NIH3T3细胞的神经侵袭索引。 （ 二 ）坐标描述与神经（红色）和QLL2细胞（紫色）接触的KPC癌细胞的迁移路径图。 Y和X坐标被示出。 （每组12-20中）。从QLL2癌细胞迁移与轴突接触和（d）KPC癌细胞（N = 20）的原产地的距离（ 三 ）分析。迁移的方向是不断向着神经节中（一）由双面学生t检验计算的P值。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本文给出了一个概括的神经利基癌微环境中，DRG模型的体外模型。视频演示从识别解剖标志诸如在小鼠的背根神经节，其提取，最后，它在细胞外基质培养开始的所有步骤。共培养与癌细胞的DRG旁边还提出。有制作用于体外研究神经周围生态位微此模型必需在文献中描述没有其他模型体外神经浸润研究。
在视频中介绍的协议有两个关键步骤。首先，抓邻近DRG体（步骤2.7中的协议）的神经时应该小心。抓或捏DRG可能会导致对DRG不可逆转机械或局部缺血损伤防止它成长，并在培养皿接种时发芽。第二个关键步骤是注入的癌细胞在ECM内的培养皿。种子细胞缓慢和小心，以避免细胞的浮动和它们在培养皿中传播是很重要的。植入的目的是本地化的细胞在一个地方，以便于跟踪其移动（距离和方向）。
一旦建立了模型微环境可根据测试的假说进行修改。例如，添加第三细胞培养的培养皿（例如，非癌性细胞）使研究者能够比较不同细胞的嗜神经迁移功能。此外，研究人员可以应用不同的条件（ 即 ，温度，湿度，可溶性因子等 ），并检查其对细胞侵袭能力的效果。
在DRG模型使研究者研究癌细胞和神经之间的相互作用。它也可用于时间推移实验，其中形态学在神经周围利基变化体现在一个时间的方式。此外，neuroinvasive细胞可经受各种处理和它们对与神经节的神经突的相互作用效果进行评估。
不是每一个细胞系适用于DRG模型。他们应该是肿瘤细胞通过神经侵入并降解细胞外基质的内在能力。此外，请注意，每个癌细胞类型具有不同的入侵等特点的时候，预计细胞进行接触与DRG轴突而变化。例如，我们所用的KPC细胞需要约7天通过朝向DRG而MIAPACA细胞（人胰腺癌细胞）的细胞外基质侵入只需要72-96小时，从而使该接触。
这种模式的局限性包括与人体细胞可能不兼容。由于其使用小鼠背根神经节，在小鼠 - 人的蛋白质 - 蛋白质相互作用不能总是被证明当胡使用的人癌细胞。每当计划使用该模型与两个不同的种类，检查蛋白质的同源性应测试，如果有高同源性的测定法被认为是合适的，用于评估蛋白质 - 蛋白质相互作用。还有，应该记住的是，如在该协议中提出的DRG测定表示神经微环境，包括其他细胞，不仅神经元（ 即 ，雪旺氏细胞，成纤维细胞，巨噬细胞等 ）。因此，特定细胞群不能被专门测试。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
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