Introduction
Solide tumoren te verspreiden op drie manieren: direct invasie, lymfatische uitgespreid, en hematogenic verspreiden. Er is echter een vierde middel van verspreiding van kanker die vaak wordt genegeerd, verspreid langs zenuwen. Kankerachtige neurale invasie (CNI) is een bekende wijze van verspreiding van kanker, met name in kanker van het hoofd en nek, prostaat 1 2, 3 en pancreas. 4-8 CNI bij meer dan 80% van de personen met pancreas adenocarcinoom, leidend naar retroperitoneale tumor verspreiden via coeliakie ganglion zenuwen. Deze neurotrope kankercellen een unieke mogelijkheid om unidirectioneel migreren langs zenuwen naar het centrale zenuwstelsel (CNS). 9 Deze bevinding suggereert dat de perineurale micro kan worden benut door kankercellen, die factoren die kwaadaardige groei.
Een van de weinige in vitro modellen voor CNI onderzoek is de dorsale wortel ganglia (DRG) / kankercel model. deze model wordt vaak gebruikt voor het bestuderen van de interactie tussen neuronale paracriene stroma en kankercellen. 10-18 In dit model, muizen- of humane kankercellijnen worden gekweekt in de extracellulaire matrix (ECM) nabij bereidingen van vers gekweekte gedissocieerde DRG.
Deze video artikel toont de toepassing van de in vitro CNI in de pancreas ductaal adenocarcinoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vier tot zes weken oude vrouwelijke C57BL / CJ muizen (Harlan, Jeruzalem, Israël) werden gebruikt in het experiment volgens de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care specificaties. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite en het ministerie van Landbouw regelgeving.
1. Het oogsten van de Spinal Cord
- Euthanaseren de muis met behulp van een CO 2 kamer. Voorkomen cervicale dislocatie omdat schade aan de wortel ganglion door afschuifkrachten kunnen veroorzaken. Vanaf hier, het uitvoeren van alle stappen onder steriele omstandigheden.
- Geniet dier af met 70% ethanol. Deze stap is belangrijk voor sterilisatie en voor het haar voorkomen slepen door de inwendige organen.
- Laat de muis om te drogen uit ethanol. Voorkom elk contact van ethanol met de inwendige organen als gevolg van neurotoxiciteit.
- Na het drogen van de muis, plaatst u met behulp van pinnen in buikligging(Naar beneden). Plaats de pennen op elk achterbeen en voorpoot.
- Behulp van een tang, maak een middellijn incisie craniocaudally uitstrekt vanaf het achterste hals aan de lumbale wervelkolom. Vervolgens verhogen huid flappen bilateraal met behulp van pincet en bloot onderhuidse weefsel.
- Betasten muis schedel tot aan de craniocervicaal kruising. Met een schaar loodrecht op het dier, dwars door de cervicale wervelkolom spieren en de craniocervicaal knooppunt (de 7de halswervels) met gebruikmaking van zware tang. Ontleden de wervelkolom caudaal en Accijnzen van de wervelkolom met zware tang tot het bereiken van de lumbale niveau (achterpoten niveau).
- Voer een volledige staartvin doorsnijding van de lumbale wervelkolom niveau (de 5 de lendenwervels) het gebruik van zware tang.
- Rol de muis over (naar boven). Er is geen noodzaak om de incisie te dekken omdat de DRG van lagere vertebrale niveaus wordt gewonnen en niet de baarmoederhals.
- Bezuinigen op de middellijn van de nek tot de buik, trek dehuid zijwaarts en vervolgens gesneden om de buikvlies openen.
- Verwijder de inwendige organen in het buikvlies (lever, milt, pancreas, maag en darm) en bloc. Verwijder vervolgens de retroperitoneale organen (dat wil zeggen, nieren en pancreas). Craniaal, opent de borstwand.
- Met behulp van een tang en een chirurgisch mes, snijd de ribben, waardoor 5 mm ribben bilateraal uit de buurt van de wervelkolom. Op dit punt wordt de wervelkolom gescheiden van de rest van het lichaam.
- Was de wervelkolom van bloed met koude (4 ° C) verse fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal.
2. Het isoleren van de ganglia (DRG)
- Gebruik een stereomicroscoop met 4x vergroting.
- Plaats de rug op een niet-hechtende niet-absorberende platform (Telfa / nylon). Plaats de wervelkolom gezicht op hetzelfde cranio-caudale oriëntatie.
- Verwijder eventuele spinale spieren en bindweefsel. Gebruik de ribben als een mijlpaal voor de zenuwen als zelaat de wervelkolom. Ribs de zenuwen tegen de chirurgische instrumenten. De DRG liggen in de cervicale, thoracale en lumbale gebieden van de wervels.
- Vervolgens met een schaar gesneden het wervellichaam in de middellijn en bloot het ruggenmerg en DRG wortels door voorzichtig zijdelings terugtrekken van het wervellichaam.
- In de intercostale ruimte, volg dan de perifere zenuw mediaal langs de rib lateraal van de DRG.
- Identificeer de DRG. Het lijkt erop dat de dooier van 'spiegelei' liggend op de zenuw.
- Snijd de intercostale zenuwen distaal van de DRG verlaten 2-3 mm zenuw distaal van de ganglia, worden gebruikt voor het terugtrekken. Deze "tail" zullen worden verwijderd na de oogst.
- Pak de zenuw behulp van een tang. Afklemmen van de DRG lichaam zelf zal zenuwcel beschadigen en moet worden vermeden.
- Benader de DRG proximaal langs zijn gehechtheid aan het ruggenmerg, via zijn voorste en achterste wortels.
- Zachtjes terugtrekken naar de DRG door aan de eflende zenuw (intercostale zenuw stomp) lateraal, en snijd de voorste en achterste wortels dicht bij de DRG.
- Houd de DRG in een 35 mm petrischaal gevuld met verse ijskoude DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren, en 1% natriumpyruvaat.
3. Implantatie in de petrischaal
- Voer de volgende stappen op het ijs met behulp van pre-gekoeld pipet tips om ECM stolling te voorkomen.
- Onder een stereomicroscoop bij 2-4x vergroting, plaats een 35 mm glazen bodem petrischaal op een papier raster.
BELANGRIJK: Werken op het ijs om de ECM in vloeibare toestand te houden. Een 1 mm diameter spot (ongeveer 20 pl) van groeifactor verarmd ECM in het midden van het raster. - Onder directe visualisatie, plaatst de DRG in het midden van de ECM plek dicht bij de bodem van de schaal.
Opmerking: De kankercellen die in dit protocol zijn muizen alvleesklierkanker cellen (KPC) established van vers geïsoleerde tumor specimens van KPC muizen elders 19 beschreven. - Oogst 40.000 kanker cellen uit confluente culturen, was ze een keer met PBS en resuspendeer ze in 40 ul ECM op ijs.
- Onder directe visualisatie van het net met een stereomicroscoop maatregel 500 urn in elke richting van de DRG. Op dit punt langzaam zaad 10.000 cellen / 10 ul ECM. Gebruik een 2-10 ul voorgekoeld tip aan de cellen nabij de schotel bodem injecteren, voorkomen de verspreiding in de matrix of losraken van de matrix. (Figuur 1).
- Laat de schotel in een laminaire stroming kap gedurende 10-15 minuten stollen. Vermijd ECM drogen.
- Voeg langzaam DMEM, bereid zoals eerder vermeld, tegen de zijwand van de plaat. Voeg genoeg medium aan de ECM (ongeveer 2 ml) te dekken.
- Zet de schaal terug in de incubator bij 37 ° C.
- Vervang het medium door vers medium op de volgende dag.
- Vervang het medium elke 2 dagen. </ Li>
4. Data Acquisition, Time-lapse videomicroscopie
- Op dag 7 na de implantatie, neem de schotel voor time-lapse microscopie. Merk op dat bepaalde cellen overname zou kunnen vereisen minder vanwege de snellere migratie.
- Tijdens de live imaging, zet de schaal in een gesloten omgeving bij een gemiddelde temperatuur van 37 ± 0,1 ° C en 5% CO2.
- Noteer de cellen met behulp van een ladingsgekoppelde inrichting camera geplaatst op de microscoop.
- Neem gedigitaliseerde beelden elke 10 minuten gedurende maximaal 72 uur naar cel beweging volgen drie tot zes verschillende cellen.
- Vervang medium na 24 uur.
- Voer data-acquisitie en eenvoudige analyse met behulp van de microscoop software.
5. Data Analysis
- Voor meer geavanceerde toepassingen (dwz cell tracking in 2D of 3D) kan gespecialiseerde software (zoals Imaris 4D). Opmerking: Deze software bepaalt de xy-coördinaten van een cel opelk moment, samen met de afstand van de oorsprong en bewegingssnelheid.
- Bereken de gemiddelde snelheid door het meten van de vluchttijd tussen opeenvolgende posities 10 min intervallen. Bereken de Forward Migration Index (FMI) welke de afstand van de voorkant van de cel neurieten en beschrijft de unidirectionele beweging van de cellen naar de DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van video-microscopie beeldvorming, kan de DRG te zien kiemen neurieten 5-7 dagen na de implantatie, terwijl de kankercellen weg te migreren van hun kolonies in de richting van de DRG. Door de 7e dag na de implantatie van de kankercellen in contact komen met de neurieten (figuur 2).
Het doorgeven van de index migratie pancreaskanker cellen die in het protocol is 3-4 maal hoger dan die van andere cellijnen (QLL2, B16F) (Figuur 3a). Figuur 3b toont een representatieve X- en Y-coördinaat grafiek, die de migratie KPC van een kankercel in contact met de zenuw; time-lapse videomicroscopie analyse toonde aan verschillen in de voorwaartse beweging, maar niet de snelheid tussen de KPC cellen en niet-binnendringende cellen (Figuur 3c-d).
guur 1 "src =" / files / ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Schematische weergave van het Protocol Steps Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Cancer Cell Invasion Langs de neuronen van de DRG (a) DRG (boven) en kankercellen (onder) op dag 0 na zaaien (5x vergroting). (B) DRG en kankercellen op dag 7 na het zaaien (5x vergroting). Cellen (c) Cancer migreren langs de DRG neuronen (pijlen). Alle bars vertegenwoordigen 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Dorsale wortel ganglion (DRG) Neuronen Laten CNI (a) Nerve invasie index van MiaPaCa2 kankercellen, KPC cellen, QLL2 en NIH3T3 cellen. (B) Een coördineren grafiek die de migratie pad van een KPC kankercel in contact met de zenuw (rood) en QLL2 cel (paars). De Y- en X-coördinaten worden getoond. (N = 12-20 in elke groep). (C) Analyse van de afstand tot oorsprong migrerende QLL2 kankercellen axonale contact en (d) KPC kankercellen (n = 20). De richting van de migratie was constant in de richting van de zenuw ganglion. P-waarden in (a) werden berekend door tweezijdige Student t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel geeft een in vitro model dat de kankercellen micromilieu in de neurale nis, DRG model recapituleert. De video toont alle stappen vanaf herkennen anatomische oriëntatiepunten zoals de DRG in de muis, de extractie en tenslotte de kweken in ECM. Co-kweken van DRG samen met kankercellen gepresenteerd. Er zijn geen andere modellen in vitro perineurale invasie onderzoek in de literatuur beschreven waardoor dit model essentieel voor het bestuderen van perineurale micro niche in vitro.
Het protocol gepresenteerd in de video heeft twee kritische stappen. In de eerste plaats moet erop worden gelet bij het grijpen van de zenuw naast de DRG lichaam (stap 2.7 in het protocol). Grijpen of knijpen de DRG kan leiden tot onherstelbare mechanische of ischemische beschadiging van de DRG te voorkomen dat het groeit en kiemen wanneer gezaaid in de petrischaal. De tweede belangrijke stap is de implantatievan de kankercellen in de petrischaal in de ECM. Het is belangrijk om de cellen langzaam en voorzichtig zaad, het zweven van cellen en de verspreiding via petrischaal voorkomen. Het doel van de implantatie om de cellen te lokaliseren op een plaats ter vergemakkelijking bijhouden van hun beweging (afstand en richting).
Eenmaal gevestigd model micro kan worden aangepast aan de geteste hypothese. Bijvoorbeeld, het toevoegen van een derde cel cultuur petrischaal (bijvoorbeeld niet-kankercellen) kan de onderzoeker de neurotrope migratie capaciteiten van verschillende cellen te vergelijken. Bovendien kan de onderzoeker verschillende omstandigheden (bijvoorbeeld temperatuur, vochtigheid, oplosbare factoren, etc.) toe te passen en te onderzoeken het effect op de cellen invasie vermogen.
DRG model kan de onderzoeker de interactie tussen kankercellen en nervus. Het wordt ook gebruikt voor tijdsverloop experimenten waarin morfologischeveranderingen in de perineurale niche worden aangetoond in een tijdelijke wijze. Bovendien kan de neuro-invasieve cellen worden onderworpen aan verschillende behandelingen en hun effect op de interactie met neurieten van de ganglia kan worden beoordeeld.
Niet elke cellijn is geschikt voor de DRG model. Ze moeten kankercellen het intrinsieke vermogen om binnen te dringen door de zenuw en ECM breken. Bovendien merken dat elk type kankercel invasie heeft verschillende eigenschappen en dus de tijd de cellen wordt verwacht om contact te maken met de DRG neurieten varieert. Bijvoorbeeld, de KPC cellen die we gebruiken behoefte ongeveer 7 dagen de tijd om binnen te dringen via de ECM in de richting van de DRG terwijl MiaPaCa cellen (menselijke pancreas adenocarcinoom cellen) hoeft alleen maar 72-96 uur om dat contact te maken.
Een beperking van dit model het eventuele onverenigbaarheid met menselijke cellen. Door het gebruik van de muis DRG, de muis-humane eiwit-eiwit interactie kan niet altijd worden aangetoond wanneer human kanker cellen worden gebruikt. Wanneer plan om dit model te gebruiken met twee verschillende soorten dient de homologie van het onderzochte eiwit worden getest en indien er een hoge homologie de assay zou geschikt voor het evalueren van eiwit-eiwitinteracties worden. Eveneens, moet er rekening mee gehouden dat de DRG assay zoals voorgesteld in dit protocol is de neurale micro op alle cellen, niet alleen neuronen (bijv Schwann-cellen, fibroblasten, macrofagen, etc.). Derhalve specifieke celpopulaties niet specifiek onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
