Introduction
直接浸潤、リンパ節転移、および造血スプレッド:固形腫瘍は、主に次の3通りの方法で広めます。しかし、頻繁に神経に沿って、普及を無視して、がんの広がりの第4の手段があります。癌性神経浸潤(CNI)は、特に頭頸部の癌において、前立腺1 2、3及び膵臓癌の広がりの周知の経路である。4-8 CNIは、先頭、膵臓腺癌を有する個体の80%以上で起こります後腹膜腫瘍を腹腔神経節神経を介して広がります。これらの神経向性癌細胞は、中枢神経系(CNS)に向かって神経に沿って一方向に移行するためのユニークな能力を有する。9この知見は、神経周囲の微小環境は、腫瘍細胞によって利用され得ることを示唆している悪性の増殖を支持する因子を提供します。
CNIの研究のためのいくつかのin vitroモデルの一つは、後根神経節(DRG)/癌細胞モデルです。このモッズELが頻繁に神経間質細胞と癌細胞との間のパラクリン相互作用を研究するために使用される。10-18このモデルでは、マウスまたはヒトの癌細胞株は、新たに解離し、培養DRG調製物に隣接する細胞外マトリックス(ECM)中で増殖させます。
このビデオの記事では、膵管腺癌におけるインビトロCNIのアプリケーションを示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
6週齢の雌C57BL / CJマウス(ハーラン、エルサレム、イスラエル)の四は、実験動物管理仕様の評価と認定のための協会によると、実験に使用しました。全ての実験手順は、施設内動物管理使用委員会と農業の規制の部門に合わせて行われました。
1.収穫脊髄
- CO 2チャンバーを用いて、マウスを安楽死させます。それが剪断力に起因する神経節根を損傷する可能性がありますように頸椎脱臼を避けてください。ここで上からは、無菌状態下にあるすべての手順を実行します。
- 70%エタノールで動物を下に浸します。このステップは、殺菌のためと内臓を通じてドラッグから髪を防止するために重要です。
- エタノールから乾燥するためにマウスを残します。神経毒性に起因する内臓とエタノールの任意の接触を防ぎます。
- マウスを乾燥させた後、腹臥位でピンを使用して、それを配置(下向き)。各後肢および前肢のピンを配置します。
- 鉗子を使用して、腰椎の後方の首からcraniocaudally伸びる正中切開を行います。次に、ピンセットを用いて、左右の皮膚フラップを上げ、皮下組織を露出させます。
- 頭頸接合部に到達するまで、マウスの頭蓋骨を触診します。重い鉗子を使用して、頭頸接合部( 第 7頸椎)で子宮頸部筋肉や背骨を切断動物に対して垂直なハサミを使用して。尾側脊椎を解剖し、腰椎レベル(後肢レベル)に到達するまで、重い鉗子で背骨を切り出します。
- 重い鉗子を使用して、腰椎レベル( 第 5腰椎)での完全な尾切断を実行します。
- (フェイスアップ)、マウスをロールオーバー。 DRGは、子宮頸部の下側の椎骨レベルから抽出されていないため、切開部をカバーする必要はありません。
- 撤回、腹部に首から正中線で切り倒し皮膚は横方向にしてから腹膜を開くためにカット。
- 一括腹膜内部の内臓(肝臓、脾臓、膵臓、胃、および腸)を取り外します。次に、後腹膜臓器( すなわち 、腎臓、膵臓)を削除。頭蓋は、胸壁を開きます。
- 鉗子や外科用メスを使用して、左右対称に離れて脊柱からリブの5ミリメートルを残して、リブをカット。この時点で、脊柱は、身体の残りの部分から分離されています。
- 二回の冷(4°C)新鮮なリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で血液から脊柱を洗ってください。
2.分離後根神経節(DRG)
- 4Xの倍率で実体顕微鏡を使用してください。
- 非接着性の非吸収プラットフォーム(Telfa /ナイロン)での背骨の位置を決めます。同じ頭尾の向きで脊椎表向きに置きます。
- 任意の脊椎筋肉や結合組織を除去します。彼らのような神経のためのランドマークとしてリブを使用してください背骨を残します。リブはまた、手術器具から神経を保護します。 DRGは、椎骨の頚椎、胸椎、腰椎のサイトに置かれています。
- 次に、はさみを使用すると、正中線で椎体をカットし、椎体の穏やかな横方向の後退により、脊髄およびDRGの根を公開します。
- 肋間空間では、DRGに横リブに沿って内側に末梢神経に従ってください。
- DRGを識別します。これは、神経の上に横たわる「目玉焼き」の黄身のように見えます。
- 神経節に神経遠位2-3ミリ残しDRGに肋間神経末端をカットし、後退のために使用されます。この「テール」は、収穫後に削除されます。
- ピンセットを用いて神経をつかみます。 DRG本体自体をつまんすると、神経細胞の損傷を引き起こし、避けるべきです。
- その前方および後方根を経由して、脊髄への取り付けに沿って近位にDRGに近づきます。
- EFを引っ張ることによって、DRGに穏やかな後退を適用しますferent神経(肋間神経切り株)は、横方向、およびDRGに近い前方および後方根をカット。
- 10%ウシ胎児血清(FCS)を補充した新鮮な氷冷DMEM、1%ペニシリン - ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸ナトリウムを充填した35 mmのペトリ皿にDRGを保ちます。
ペトリ皿に3注入
- ECMの凝固を防ぐために、予め冷却したピペットチップを使用して、氷の上で次の手順を実行します。
- 2〜4倍の倍率で実体顕微鏡下では、紙のグリッド上の35ミリメートルのガラスボトムシャーレを置きます。
重要:液体状態にECMを維持するために氷の上で作業してください。グリッドの中心に成長因子枯渇ECMの1ミリメートルの直径のスポット(約20μl)を作成します。 - 直接可視化の下では、皿の底に近いECMスポットの中心にDRGを配置します。
注意:このプロトコルで使用される癌細胞であるマウスの膵臓癌細胞(KPC)establis他の場所で19説明したようにKPCマウスから新たに単離された腫瘍標本からHED。 - コンフルエント培養物から収穫40,000癌細胞は、PBSで一度洗って、そして氷上で40μlのECMで再懸濁します。
- DRGから各方向に500μmで実体顕微鏡の尺度を使用して、グリッドの直接可視化の下で。この時点で、ゆっくりと10,000細胞/10μlのECMをシード。行列の行列や剥離を自分の広がりを避け、皿底に近い細胞を注入するために2-10μlの予冷チップを使用してください。 ( 図1)。
- 固化する10〜15分間層流フード内で皿を残します。 ECMの乾燥を避けます。
- ゆっくりとプレートの側壁に対して、前述したように調製し、DMEMを追加します。 ECM(約2ml)をカバーするのに十分なメディアを追加します。
- バック37℃のインキュベーターに皿を置きます。
- 次の日に新鮮な培地で培地を交換してください。
- 2日ごとに培地を交換してください。</李>
4.データ収集、タイムラプスビデオ顕微鏡
- 移植後7日目に、タイムラプス顕微鏡用の皿を取ります。特定の細胞が原因で高速に移行する以前の取得を必要とするかもしれないことに注意してください。
- ライブイメージングの間、37±0.1℃、5%CO 2の平均温度で閉じた環境で皿を置きます。
- 顕微鏡上に配置された電荷結合素子カメラを用いて細胞を記録します。
- 3〜6個の異なる細胞から細胞移動を追跡するために最大72時間、デジタル画像ごとに10分を取ります。
- 24時間後に培地を交換してください。
- 顕微鏡ソフトウェアを使用してデータ収集及び単純な分析を行います。
5.データ解析
- より高度なアプリケーション(2Dまたは3Dで、すなわち 、細胞トラッキング)について(そのようなIMARIS 4Dなど)特殊なソフトウェアを使用しています。注:このソフトウェアは、セルのxy座標を決定任意のは、運動の原点からの距離、および速度とともに、時間を与えられました。
- 10分間隔で、その後の位置の間の移動距離を測定することによって、平均速度を計算します。神経突起からの細胞フロントの距離であり、DRGに向かって細胞の一方向の動きを説明するフォワード移行指数(FMI)を計算します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ビデオ顕微鏡画像を使用して、DRGは、癌細胞がDRGに向かってそれらのコロニーから離れて移行中に注入した後、神経突起を5~7日間発芽分かります。移植後7日目では、癌細胞は神経突起( 図2)と接触します。
プロトコルで使用される膵臓癌細胞の前方移動指数は、他の細胞株(QLL2、B16F)( 図3A)よりも3~4倍高い。 図3bは、代表的なXを示し、Yは、移動経路を示す、グラフ座標神経と接触しているKPC癌細胞の。タイムラプスビデオ顕微鏡分析は、KPC細胞と非浸潤細胞( 図3c-d)の間の前進に違いはなく、速度を示しました。
グレ1 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
図1:プロトコル手順の概略図 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2:DRGのニューロンに沿って、癌細胞の浸潤 (a)は DRG(上)と(5X倍率)を播種した後0日目に癌細胞(下)。 (b)は 、7日目にDRGと癌細胞(5×倍率)を播種した後。 (C)癌細胞をDRGニューロン(矢印)に沿って移動します。すべてのバーは50μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3:後根神経節(DRG)ニューロンは、CNIを誘導する (a)は、MiaPaCa2癌細胞、KPC細胞、QLL2、およびNIH3T3細胞の神経浸潤指数。 (B)A神経(赤)とQLL2細胞(紫色)と接触KPC癌細胞の移動経路を示すグラフ座標。 YとX座標が示されています。 (各群n = 12-20)。 (c)の軸索の接点と、(d)KPC癌細胞(N = 20)でQLL2癌細胞の移行の原点からの距離の分析。移動の方向は、神経節に向かって常にあった。(a)の中のP値は、両側スチューデントt検定により計算した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この記事では、神経ニッチ、DRGモデルにおける癌微小環境を再現するin vitroモデルを提示します。ビデオは、マウスにおけるDRG、その抽出、およびECMで最終的に、その培養として、解剖学的ランドマークを認識することから始めて、すべての手順を示しています。共培養癌細胞と一緒にDRGにも提示されています。 in vitroでの神経周囲ニッチ微小環境を研究するためのこのモデルが不可欠作り、文献に記載のin vitro神経周囲の浸潤の研究のための他のモデルはありません。
ビデオで提示プロトコルは、2つの重要なステップがあります。 DRG本体(プロトコールのステップ2.7)に隣接する神経を把握する際にまず、注意が必要です。 DRGの把握やピンチすると、成長してシャーレに播種したときに発芽するのを防止するDRGに不可逆的、機械的または虚血性損傷を引き起こす可能性があります。第二の重要なステップは、移植ですECM内部のペトリ皿中の癌細胞の。ゆっくりと慎重に細胞を播種するためにセルのフローティングとペトリ皿の上に自分の拡散を避けることが重要です。注入の目的は、一つの場所に細胞をローカライズするために彼らの動き(距離と方向)の追跡を容易にすることです。
いったん確立されたモデルの微小環境は、試験した仮説に応じて変更することができます。例えば、ペトリ皿(例えば、非癌性細胞)に第三の細胞培養物を添加して、異なる細胞の神経向性移行能力を比較する研究を可能にします。さらに、研究者は、異なる条件( すなわち 、温度、湿度、可溶性因子、 等 ) を適用し、細胞の浸潤能に及ぼす影響を調べることができます。
DRGモデルは、癌細胞と神経の間の相互作用を研究する研究者を可能にします。また、時間経過実験のために使用される形態学的で神経周囲ニッチの変化は一時的な流行で実証されています。さらに、神経浸潤細胞は、様々な処理を施すことができ、神経節の神経突起との相互作用に及ぼす影響を評価することができます。
必ずしもすべての細胞株は、DRGモデルに適しています。彼らは神経を通って侵入すると、ECMを分解するために固有の能力を有する癌細胞である必要があります。さらに、それぞれの癌細胞型が異なる侵入特性を有するので、細胞をDRG神経突起と接触することが予想される時間が変化することに注意してください。例えば、我々が使用しKPC細胞はMiaPaca細胞(ヒト膵臓腺癌細胞)は、その連絡先を作るためにのみ72〜96時間を必要とするのに対し、DRGに向かってECMを介して侵入し、約7日間必要です。
このモデルの制限は、ヒトの細胞で可能な非互換性を備えています。マウスのDRGの使用のために、マウス - ヒトのタンパク質 - タンパク質相互作用を必ずしも示すことができないときにHU人間の癌細胞が使用されます。 2つの異なる種で、このモデルを使用することを計画するときはいつでも、検査タンパク質の相同性は、試験されるべきであり、高い相同性がある場合、このアッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用を評価するために適切であると考えられます。同様に、それはこのプロトコルで提案されているように、DRGアッセイは、他の細胞だけでなく、神経細胞( すなわち 、シュワン細胞、線維芽細胞、マクロファージなど )を含む神経微小環境を表すことに留意すべきです。したがって、特定の細胞集団を特異的に試験することができません。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Operating microscope | Leica | M205 | |
Time Lapse System | Zeiss | ||
Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
70% ethanol | Sigma | ||
Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
FCS | Rhenium | 10108165 | |
Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).