Introduction
גידולים מוצקים להפיץ בשלוש דרכים עיקריות: פלישה ישירה, ממרח הלימפה, והתפשטות hematogenic. עם זאת, יש אמצעי הרביעי של התפשטות סרטן זה התעלם לעתים קרובות, הפצה לאורך עצבים. פלישה עצבית סרטנית (CNI) היא מסלול ידוע של התפשטות הסרטן, במיוחד סרטן של הראש והצוואר, 1 הערמונית 2, 3 ולבלב. CNI 4-8 מתרחש בלמעלה מ 80% של אנשים עם אדנוקרצינומה של לבלב, מוביל כדי גידול retroperitoneal התפשט עצבי גנגליון צליאק. יש תאים סרטניים neurotropic אלה יכולת ייחודית להעביר בכיוון אחד לאורך עצבים כלפי מערכת העצבים המרכזית (CNS). 9 ממצא זה מצביע על כך microenvironment perineural יכול להיות מנוצלת על ידי תאי סרטן, מתן הגורמים התומכים גידול ממאיר.
אחד הדגמים כמה במבחנה למחקר CNI הוא הגרעינים השורש הגבי (DRG) / דגם תאים סרטניים. mod זהאל משמש לעתים קרובות כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי paracrine stroma והסרטן עצביים. 10-18 במודל זה, עכבר או שורות תאים סרטניים אנושיות גדלות תאי מטריקס (ECM) סמכו הכנות של DRG המתורבת טרי ניתק.
מאמר וידאו זה מציג את היישום של במבחנה CNI ב אדנוקרצינומה ductal הלבלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ארבע עד C57BL נקבה שישה בן-שבוע / CJ עכברים (הרלן, ירושלים, ישראל) שימשו בניסוי פי האגודה הערכה וההסמכה של מפרטים טיפול בבעלי חיים מעבדה. כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה השתמש ומח' תקנות חקלאות.
1. קציר חוט השדרה
- להרדים את העכבר באמצעות תא 2 CO. הימנע נקע בצוואר הרחם כיוון שהוא עלול לגרום נזק שורשי גנגליון בשל כוחות גזירה. מכאן ואילך, לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים.
- משרים את חיה עם 70% אתנול. שלב זה חשוב עבור עיקור למניעת השיער מגרירת דרך האיברים הפנימיים.
- השאירו את העכבר להתייבש מן אתנול. מנע כל מגע של אתנול עם האיברים הפנימיים בשל רעילות עצבית.
- לאחר ייבוש העכבר, מקם אותו באמצעות סיכות אפרקדן(פנים למטה). מניחים את הפינים שעל כל hindlimb ו forelimb.
- בעזרת מלקחיים, לעשות חתך קו אמצע הארכת craniocaudally מהצוואר האחורי של הגב התחתון. לאחר מכן, להעלות דשי עורי באמצעות מלקחיים בילטרלי ולחשוף הרקמה התת עורית.
- למשש גולגולת עכבר עד שמגיע לצומת craniocervical. בעזרת מספריים בניצב החיה, בקעה את שרירי צוואר רחם עמוד שדרה בצומת craniocervical (חוליות צוואר הרחם -7), באמצעות מלקחיים כבדים. לנתח את עמוד שדרת caudally, ולהסיר את עמוד השדרה עם מלקחיים כבדים עד שהגיע לרמת המותני (רמת גפיים אחורית).
- בצע חיתוך רוחב זנב מלא ברמת עמוד השדרה המותני (חוליות 5 th) באמצעות מלקחיים כבדים.
- מגלגלים את העכבר מעל (עם הפנים כלפי מעלה). אין צורך לכסות את החתך מאז DRG מופק רמות שדרה תחתונות ולא צוואר הרחם.
- צמצמו על קו האמצע מהצוואר אל הבטן, לחזור בועור רוחבי ואז לחתוך כדי לפתוח את הצפק.
- הסר את האיברים הפנימיים בתוך הצפק (כבד, טחול, לבלב, קיבה ומעי) כמקשה אחת. לאחר מכן, להסיר את איברי retroperitoneal (כלומר, כליות ולבלב). Cranially, לפתוח את בית החזה.
- בעזרת מלקחיים להב כירורגי, לחתוך את הצלעות, משאיר 5 מ"מ של צלעות בילטרלי משם מעמוד השדרה. בשלב זה, עמוד השדרה מופרד משאר הגוף.
- שטפו את עמוד השדרה מדם עם בופר פוספט טרי קר (4 ° C) (PBS) פעמיים.
2. בידוד השורש הגבה גרעינים (DRG)
- השתמש stereomicroscope עם הגדלה 4X.
- מקם את עמוד השדרה על פלטפורמה קולטת הלא לא חסידה (Telfa / ניילון). מקם את הפנים עמוד השדרה למעלה על האוריינטציה סקראל הזנב אותו.
- הסר את כל שרירי עמוד שדרה ורקמות חיבור. השתמש צלעות כציון דרך לעצבים כפי שהםלעזוב את עמוד השדרה. צלעות גם להגן על העצבים מן הכלים כירורגיים. DRG ממוקמים בחלק הצווארי, החזי, ואתרי המותני של החוליות.
- לאחר מכן, מספריים באמצעות לחתוך את הגוף בחוליות קו האמצע ולחשוף את חוט השדרה ושורשי DRG ידי הכחשה לרוחב עדינה של הגוף בחוליות.
- במרחב צלע, בצע את העצבים ההיקפיים מדיאלית לאורך לרוחב צלע אל DRG.
- זהה את DRG. זה נראה כמו חלמון של 'ביצת עין' שוכב על העצב.
- חותכים את דיסטלי עצב צלעי אל DRG עוזב 2-3 מ"מ של דיסטלי החוצפה הגרעינים, לשמש הכחשה. זה "זנב" יוסר לאחר הקטיף.
- אחוז העצב באמצעות מלקחיים. צביטת הגוף DRG עצמו יגרום נזק לתאים עצביים יש להימנע.
- מתקרב DRG proximally יחד התקשרותו אל חוט השדרה, באמצעות הקדמי שלה ושורשים אחוריים.
- החל הכחשה עדינה על DRG ידי משייכת EFעצב ferent (גדם עצב צלעי) רוחבי, וחתך את הקדמי ואת האחורי שורשים הקרוב DRG.
- שמור את DRG בצלחת פטרי 35 מ"מ מלא DMEM טרי קר, קרח בתוספת 10% נסיוב עגל עוברית (FCS), 1%, סטרפטומיצין פניצילין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, ו פירובט סודיום 1%.
3. השרשה בצלחת פטרי
- בצע את הצעדים הבאים על הקרח באמצעות פיפטה טיפים מראש מקורר כדי למנוע התמצקות ECM.
- תחת סטראו בהגדלה 2-4X, מניחים צלחת פטרי תחתית זכוכית 35 מ"מ על רשת נייר.
חשוב: עבודה על קרח כדי לשמור על ECM במצב נוזלי. צור נקודה בקוטר 1 מ"מ (כ 20 μl) של ECM מדולדל גורם הגדילה במרכז הרשת. - תחת להדמיה ישירה, למקם את DRG במרכז המקום ECM קרוב לתחתית של המנה.
הערה: התאים הסרטניים בשימוש בפרוטוקול זה הם תאים סרטניים בעכברי לבלב (KPC) establisהד מ דגימות הגידול מבודדים טרי מעכברים KPC כמתואר במקום אחר 19. - קציר תאים 40,000 סרטן מתרבויות ומחוברות, לשטוף אותם פעם אחת עם PBS, resuspend אותם 40 ECM μl על הקרח.
- תחת ראיה ישירה של הרשת באמצעות מיקרומטר סטראו מידה 500 בכל כיוון מן DRG. בשלב זה לאט זרע 10,000 תאים / 10 μl ECM. השתמש טיפ 2-10 μl precooled להזריק את התאים קרובים לתחתית הצלחת, הימנעות ההתפשטות שלהם במטריצה או הניתוק של מטריקס. (איור 1).
- משאיר את הכלי בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית במשך 10-15 דקות כדי לחזק. הימנע ייבוש ECM.
- לאט לאט להוסיף DMEM, שהוכן כאמור, על הקיר הצדדי של הצלחת. הוסף מספיק בינוני כדי לכסות את ECM (כ 2 מ"ל).
- שים את הצלחת בחזרה אל האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
- חלף בינוני עם בינוני טרי ביום הבא.
- החלף את המדיום כל 2 ימים. </ Li>
4. רכישת נתונים, זמן לשגות Videomicroscopy
- ביום 7 לאחר ההשתלה, לקחת את הצלחת עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות. שים לב תאים מסוימים עשויים לחייב רכישה מוקדם יותר בגלל הגירה מהר.
- במהלך ההדמיה לחיות, במקום צלחת בסביבה סגורה בטמפרטורה ממוצעת של 37 ± 0.1 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- רשום את התאים באמצעות מצלמת המכשיר מצמידים תשלום מושם על המיקרוסקופ.
- קח תמונות דיגיטציה כל 10 דקות עד 72 שעות כדי לעקוב אחרי תנועת תא בין שלושה לשישה תאים שונים.
- חלף בינוני לאחר 24 שעות.
- בצע רכישת נתונים וניתוח פשוט באמצעות תוכנת מיקרוסקופ.
ניתוח 5. נתונים
- עבור יישומים מתקדמים יותר (כלומר, מעקב תא 2D או 3D) להשתמש בתוכנה מיוחדת (כגון Imaris 4D). הערה: תוכנה זו קובעת את קואורדינטות XY של תאבכל רגע נתון, יחד עם המרחק ממקור, ומהירות תנועה.
- לחשב את המהירות הממוצעת על ידי מדידת מרחק הנסיעה בין עמדות שלאחר מכן ב 10 מרווחי דקות. חישוב מדד ההגירה הקדמי (FMI) המהווה את המרחק של חזית התא מן neurite ומתאר את התנועה חד כיווני של התאים כלפי DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לדימות באמצעות מיקרוסקופיה וידאו, DRG ניתן לראות הנבטה neurites 5-7 ימים לאחר ההשתלה בעוד תאים סרטניים נודדות הרחק ממושבות שלהם כלפי DRG. עד היום ה -7 לאחר ההשתלה, התאים הסרטניים לבוא במגע עם neurites (איור 2).
מדד ההגירה קדימה של תאי סרטן הלבלב השתמשו בפרוטוקול הוא 3-4 לקפל גבוה יותר מזה של שורות תאים אחרים (QLL2, B16F) (איור 3 א). איור 3 ב מציג X נציג ו- Y לתאם גרף, המתאר את נתיב הגירה של תא סרטני KPC במגע עם העצב; ניתוח videomicroscopy זמן לשגות הראה הבדלים בתנועה קדימה אבל לא מהיר בין תאי KPC ותאים שאינם פולש (איור 3 ג-ד).
איור 1 "src =" / files / ftp_upload / 52,990 / 52990fig1.jpg "/>
איור 1:. איור סכמטי של הפרוטוקול אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. תא סרטני הפלישה לאורך נוירונים של DRG (א) DRG (למעלה) תאים סרטניים (למטה) ביום 0 לאחר זריעה (הגדלה 5X). (ב) DRG וסרטן תאי ביום 7 לאחר הזריעה (גדלת 5X). (ג) תאים סרטניים נודדים לאורך הנוירון DRG (חיצים). כל הברים מייצגים 50 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בתוך-page = "1"> 
איור 3:. השורש הגבי גנגליון (DRG) נוירונים להשרות CNI (א) מדד הפלישה העצבים של תאים סרטניים MiaPaCa2, תאים KPC, QLL2, ותאי NIH3T3. (ב) לתאם גרף המתאר את נתיב הגירה של תא סרטני KPC במגע עם העצב (אדום) ותא QLL2 (סגול). קואורדינטות Y ו- X מוצגות. (N = 12-20 בכל קבוצה). (ג) ניתוח של המרחק ממקור של תאים נודדים סרטן QLL2 עם קשר אקסונלית ו- (ד) תאים סרטניים KPC (n = 20). הכיוון של גירה היה כל זמן לעבר גנגליון העצב. ערכי P ב (א) חושבו על ידי מבחן t דו-צדדי סטודנטים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג מודל במבחנה כי שחזר במייקרו-הסביבה של הסרטני בגומחה העצבית, מודל DRG. הסרטון מדגים את כל השלבים החל מהכרה ציוני דרך אנטומיים כגון DRG בתוך העכבר, החילוץ שלה, ולבסוף, culturing שלה ECM. שיתוף culturing DRG לצד עם תאים סרטניים מוצג גם. אין מודלים אחרים עבור במבחנת מחקר פלישת perineural המתוארים בספרות ביצוע מודל זה חיוני ללימוד במייקרו-הסביבה של נישת perineural במבחנה.
הפרוטוקול המובא בסרטון יש שני שלבים קריטיים. ראשית, יש לנקוט זהירות בעת אחיזה עצב סמוכים לגוף DRG (שלב 2.7 בפרוטוקול). אחיזה או צובט את DRG עלול לגרום נזק מכני או איסכמי בלתי הפיך DRG ומונע ממנו גדל ומצמיח כאשר זורעים בצלחת פטרי. השלב הקריטי השני הוא ההשתלהשל התאים הסרטניים בצלחת פטרי בתוך ECM. חשוב לזרוע את התאים לאט ובזהירות, כדי למנוע ניוד תאי והתפשטותם על צלחת פטרי. מטרת ההשתלה היא למקם את התא במקום אחד, כדי להקל על מעקב תנועתם (מרחק וכיוון).
מרגע היווצרותם microenvironment המודל ניתן לשנות על פי ההיפותזה שנבחנה. למשל, הוספת תרבית תאים שלישית כדי בצלחת פטרי (למשל, תאים לא סרטניים) מאפשרת לחוקר להשוות את יכולות גירת neurotropic של תאים שונים. יתר על כן, החוקר יכול להחיל תנאים שונים (כלומר, טמפרטורה, לחות, גורמים מסיסים, וכו ') ולבחון את השפיע על יכולת פלישת תאים.
מודל DRG מאפשר לחוקר לחקור את האינטראקציה בין תאים סרטניים ועצבים. כמו כן הוא משמש עבור ניסויים זמן לשגות שבו מורפולוגייםשינויי נישת perineural מודגמים בצורה זמנית. יתר על כן, התאים neuroinvasive יכולה להיות נתונה טיפולים שונים והשפעתם על האינטראקציה עם neurites של הגרעינים ניתן להעריך.
לא כל שורת תאים מתאימה למודל DRG. הם צריכים להיות תאים סרטניים עם היכולת הפנימית לפלוש דרך עצב להשפיל ECM. יתר על כן, יש לציין כי כל סוג תא הסרטן יש מאפייני פלישה שונים ולכן זמן התאים צפויים ליצור קשר עם neurites DRG משתנה. לדוגמה, התאים KPC השתמשנו צורך כ -7 ימים לפלוש דרך ECM כלפי DRG ואילו תאים MiaPaca (תאי אדנוקרצינומה של הלבלב האנושי) צריך רק 72-96 שעות כדי ליצור קשר זה.
הגבלה של מודל זה כוללת את בעיית אי תאימות האפשרית עם תאים אנושיים. בשל השימוש שהיא עושה DRG עכבר, האינטראקציה בין חלבונים אנושיים ועכבר לא יכול תמיד להיות הפגינו כאשר huתאים סרטניים אדם משמשים. בכל פעם מתכנן להשתמש במודל זה עם שני המינים השונים, ההומולוגיה של חלבון הבחן צריכה להיבדק ואם יש הומולוגיה גבוהה assay הוא אמורה להיות מתאים להערכת אינטראקציות בין חלבונים. וכן, זה צריך לזכור כי assay DRG כפי שהוצע בפרוטוקול זה מייצג את המיקרו-הסביבה העצבית כולל תאים אחרים, לא רק נוירונים (כלומר, תאי שוואן, פיברובלסטים, מקרופאגים, וכו '). לפיכך, אוכלוסיות תאים ספציפיים לא ניתן לבדוק באופן ספציפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
