Introduction
tumores sólidos divulgação de três maneiras principais: invasão direta, disseminação linfática e disseminação hematogênica. No entanto, há um quarto meio de disseminação do câncer que é frequentemente ignoradas, disseminação ao longo dos nervos. Invasão cancerosa neural (CNI) é um percurso bem conhecido de disseminação do cancro, especialmente em tipos de cancro da cabeça e do pescoço, um de próstata 2, 3 e pâncreas. 4-8 CNI ocorre em mais de 80% dos indivíduos com adenocarcinoma do pâncreas, levando a tumor retroperitonial espalhar através dos nervos gânglio celíaco. Estas células cancerosas neurotrópico têm uma capacidade única para migrar unidireccionalmente ao longo dos nervos em relação ao sistema nervoso central (SNC). 9 Esta descoberta sugere que o microambiente perineural pode ser explorada por células cancerosas, proporcionando factores que suportam o crescimento maligno.
Um dos poucos modelos in vitro para a pesquisa CNI é o gânglio da raiz dorsal (DRG) / modelo de células de cancro. este modEL é frequentemente utilizado para estudar a interacção entre as células do estroma parácrina e cancerosas neurais. 10-18 Neste modelo, rato ou linhas celulares de cancro humano são cultivadas em matriz extracelular (ECM) adjacente às preparações de DRG dissociados cultivadas de fresco.
Este artigo vídeo mostra a aplicação do in vitro CNI em adenocarcinoma ductal pancreático.
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Protocol
Quatro a seis semanas de idade C57BL feminino / camundongos CJ (Harlan, Jerusalém, Israel) foram usados no experimento de acordo com a Associação de Avaliação e Acreditação de especificações Laboratory Animal Care. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Animal Care Institucional e Comitê de Uso e do Departamento de Agricultura regulamentos.
1. colheita da Medula Espinhal
- Euthanize o rato usando uma câmara de CO 2. Evite deslocamento cervical, uma vez que pode causar danos às raízes ganglionares devido a forças de cisalhamento. Daqui em diante, executar todas as etapas sob condições estéreis.
- Mergulhe animal para baixo, com 70% de etanol. Esta etapa é importante para a esterilização e para a prevenção do cabelo de arrastando através dos órgãos internos.
- Deixar o mouse para secar a partir do etanol. Evitar qualquer contacto de etanol com os órgãos internos, devido à neurotoxicidade.
- Após a secagem do rato, posicioná-lo utilizando os pinos na posição prona(Face para baixo). Coloque os pinos de cada membro posterior e membro anterior.
- Usando fórceps, fazer uma incisão na linha média que se estende a partir do gargalo craniocaudal posterior à coluna lombar. Em seguida, levante retalhos cutâneos bilateralmente usando uma pinça e expor o tecido subcutâneo.
- Palpar crânio mouse até chegar a junção crânio-cervical. Com uma tesoura perpendiculares ao animal, cortar os músculos cervicais e coluna na junção craniocervical (7ª vértebras cervicais), usando uma pinça pesados. Dissecar a espinha caudal e extirpar a coluna com uma pinça pesados até atingir o nível lombar (traseira nível membros).
- Executar uma transecção caudal completa ao nível da coluna lombar (5ª vértebras lombares) usando uma pinça pesados.
- Passe o mouse sobre (voltada para cima). Não há necessidade de cobrir a incisão desde o DRG é extraído a partir de níveis vertebrais mais baixos e não o colo do útero.
- Cortadas na linha média do pescoço até o abdômen, retrair opele lateralmente e, em seguida, cortado para abrir o peritoneu.
- Remover os órgãos internos no interior do peritoneu (fígado, baço, pâncreas, estômago, intestino) e em bloco. Em seguida, remover os órgãos retroperitoneais (ou seja, rins e pâncreas). Cranial, abra a parede torácica.
- Usando fórceps e uma lâmina cirúrgica, cortar as nervuras, deixando 5 mm de nervuras bilateralmente longe da coluna vertebral. Neste ponto, a coluna vertebral é separada do resto do corpo.
- Lava-se a coluna vertebral de sangue com frio (4 ° C) fresco salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes.
2. Isolar o Root Ganglia dorsal (DRG)
- Use um estereomicroscópio com uma ampliação de 4X.
- Posicionar a coluna vertebral em uma plataforma absorvente non non-aderente (Telfa / nylon). Posicione espinha enfrentam-se na mesma orientação crânio-caudal.
- Remova todos os músculos da coluna vertebral e do tecido conjuntivo. Use as costelas como um marco para os nervos como elesdeixar a coluna vertebral. Costelas também protegem os nervos dos instrumentos cirúrgicos. O DRG estão localizados nas regiões cervical, torácica, lombar e locais das vértebras.
- Em seguida, usando uma tesoura cortou o corpo vertebral na linha média e expor a espinal medula e raízes DRG por retracção suave de lateral do corpo vertebral.
- No espaço intercostal, siga o nervo periférico medial ao longo da nervura lateral, para o DRG.
- Identificar o DRG. Parece que a gema de "ovo frito" deitado no nervo.
- Cortar o distai do nervo intercostal para o DRG deixando 2-3 mm de nervo distal à gânglios, a ser utilizado para a retracção. Esta "cauda" será removido após a colheita.
- Segure o nervo usando uma pinça. Comprimindo o próprio corpo DRG irá causar danos às células neurais e deve ser evitada.
- Aproxime-se do DRG proximal ao longo do seu apego à medula espinhal, através da sua anterior e raízes posteriores.
- Aplicar retração suave para a DRG puxando a efnervo dife- (coto do nervo intercostal) lateralmente, e cortar o anterior e raízes posteriores perto do DRG.
- Manter o DRG em uma placa de Petri de 35 milímetros preenchido com DMEM fresco, arrefecido em gelo suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina, aminoácidos não essenciais a 1%, e 1% de piruvato de sódio.
3. Implantação na placa de Petri
- Execute os próximos passos no gelo utilizando pontas de pipeta pré-resfriado para evitar a ECM solidificação.
- Sob um microscópio estereoscópico no 2-4X ampliação, coloque um copo placa de petri fundo 35 mm numa grade de papel.
Importante: Trabalho em gelo, a fim de manter o ECM no estado líquido. Criar um ponto de diâmetro de 1 mm (aproximadamente 20 ul) de crescimento ECM empobrecido-fator no centro da grade. - Sob visualização directa, colocar o DRG no centro do ponto de ECM perto do fundo do prato.
Nota: As células cancerosas utilizados neste protocolo são células de câncer pancreático murino (KPC) establisele tinha a partir de amostras de tumor isoladas de fresco de ratinhos KPC como descrito noutro local 19. - células de cancro da colheita a partir de culturas confluentes de 40.000, lavá-los uma vez com PBS, e ressuspender-los em 40 ul de ECM em gelo.
- Sob visualização directa da rede usando um microscópio estereoscópico mm medida 500 em cada direção a partir do DRG. Neste ponto lentamente semear células 10.000 / 10 ul ECM. Use uma ponta pr�arrefecida 2-10 ul para injetar as células próximas ao fundo do prato, evitando a sua propagação na matriz ou descolamento da matriz. (Figura 1).
- Deixe o prato dentro de uma câmara de fluxo laminar para 10-15 minutos para solidificar. Evitar a secagem ECM.
- Lentamente adicionar DMEM, preparado tal como mencionado anteriormente, contra a parede lateral da placa. Adicionar meio suficiente para cobrir o ECM (cerca de 2 mL).
- Coloque o prato de volta na incubadora a 37 ° C.
- Substituir o meio com meio fresco no dia seguinte.
- Substituir o meio a cada 2 dias. </ Li>
4. Aquisição de Dados, Time-lapse Videomicroscopia
- No dia 7 após a implantação, levar o prato para a microscopia de lapso de tempo. Note-se que certas células pode exigir a aquisição anteriormente devido à migração mais rápida.
- Durante a imagens ao vivo, colocar o prato num ambiente fechado, a uma temperatura média de 37 ± 0,1 ° C e 5% de CO 2.
- Gravar as células utilizando uma câmara de carga acoplado dispositivo colocado sobre o microscópio.
- Aqui imagens digitalizadas a cada 10 min até 72 h, para seguir a locomoção celular de três a seis células diferentes.
- Substituir médio após 24 horas.
- Executar aquisição de dados e análise simples usando o software microscópio.
Análise 5. Os dados
- Para aplicações mais avançadas (ou seja, rastreamento de celular em 2D ou 3D) usar softwares especializados (como Imaris 4D). Nota: Este software determina as coordenadas xy de uma célula emqualquer momento dado, juntamente com a distância desde a origem, e a velocidade de movimento.
- Calcula-se a velocidade média através da medição da distância de deslocamento entre as posições subsequentes em intervalos de 10 min. Calcular o Índice de migração para a frente (IMF), que é a distância da frente da célula a partir da neurite e descreve o movimento unidireccional das células para o DRG.
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Representative Results
Usando imagens de microscopia de vídeo, o DRG pode ser visto brotando neurites 5-7 dias após o implante, enquanto as células cancerosas migrar longe de suas colônias em direção ao DRG. No 7 ° dia após a implantação, as células cancerosas entrem em contacto com as neurites (Figura 2).
O índice de migração para a frente das células de cancro do pâncreas utilizados no protocolo é 3-4 vezes mais elevada do que a de outras linhas de células (QLL2, B16F) (Figura 3a). A Figura 3B apresenta um representante X e Y gráfico de coordenadas, que descreve o caminho de migração de uma célula de cancro KPC em contacto com o nervo; análise videomicroscopia time-lapse mostrou diferenças no movimento para a frente, mas não de velocidade entre as células KPC e células não-invasoras (Figura 3C-D).
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Figura 1:. Schematic Ilustração das etapas do protocolo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Cancer Cell Invasion Ao longo do Neurônios do DRG (a) DRG (topo) e as células cancerosas (inferior) no dia 0 após a semeadura (5X). (B) DRG e câncer de células no dia 7 após a semeadura (5X). Células (c) O câncer de migrar ao longo do neurônio DRG (setas). Todas as barras representam 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Gânglio da raiz dorsal (DRG) neurônios Induzir CNI (a) índice de Nerve invasão das células cancerosas MiaPaCa2, células KPC, QLL2 e células NIH3T3. (B) Uma coordenada gráfico que descreve o caminho de migração de uma célula cancerosa KPC em contato com o nervo (vermelho) e de células QLL2 (roxo). As coordenadas Y e X são mostrados. (N = 12-20 em cada grupo). (C) Análise da distância desde a origem de migrar células cancerosas QLL2 contacto com células axonal e (d) do cancro KPC (n = 20). A direção da migração estava constantemente em direção ao gânglio nervoso. Os valores de P em (a) foram calculados pelo teste t de Student dos dois lados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo apresenta um modelo in vitro que recapitula o microambiente canceroso no nicho neural, o modelo DRG. O vídeo demonstra todos os passos a partir de reconhecer marcos anatômicos, tais como o DRG no ratinho, a sua extracção e, finalmente, a sua cultura em ECM. Co-cultura de DRG juntamente com as células cancerosas, também é apresentado. Não há outros modelos para a investigação in vitro de invasão perineural descritos na literatura tornando este modelo essencial para estudar o nicho perineural microambiente in vitro.
O protocolo apresentado no vídeo tem dois passos críticos. Em primeiro lugar, deve ser tomado cuidado ao segurar o nervo adjacente ao corpo DRG (passo 2.7 no protocolo). Agarrar ou beliscar a DRG pode causar danos mecânicos ou isquêmica irreversível ao DRG impedindo-o de crescer e brotar quando semeadas em placa de Petri. O segundo passo essencial é a implantaçãodas células cancerosas na placa de Petri dentro do ECM. É importante para semear as células lentamente e com cuidado, para evitar a flutuação das células e sua propagação através da placa de Petri. O objectivo do implante é localizar as células em um lugar, para facilitar o seu movimento de acompanhamento (distância e direcção).
Uma vez estabelecido o modelo microambiente pode ser modificado de acordo com a hipótese testada. Por exemplo, a adição de uma cultura de células para a terceira placa de Petri (por exemplo, células não-cancerosas) permite ao investigador para comparar as capacidades de migração neurotrópica de células diferentes. Além disso, o pesquisador pode aplicar diferentes condições (ou seja, temperatura, umidade, fatores solúveis, etc.) e examinar o seu efeito sobre a capacidade das células de invasão.
O modelo DRG permite ao pesquisador a estudar a interacção entre as células e os nervos de câncer. Ele também é usado para experimentos lapso de tempo em que morfológicaalterações no nicho perineural são demonstrados de uma maneira temporal. Além disso, as células neuroinvasive pode ser submetido a vários tratamentos e o seu efeito sobre a interacção com neurites de gânglios pode ser avaliada.
Nem todo linha celular é adequada para o modelo de DRG. Eles devem ser células cancerosas com a capacidade intrínseca de invadir através do nervo e a degradar ECM. Além disso, note que cada tipo de célula cancerosa tem características diferentes de invasão e assim o tempo se espera que as células para fazer contato com as neurites DRG varia. Por exemplo, as células KPC usamos necessidade cerca de 7 dias para invadir através da ECM para o DRG enquanto que as células MiaPaCa (células de adenocarcinoma pancreático humano) precisam apenas 72-96 horas para fazer esse contacto.
Uma limitação deste modelo inclui a possível incompatibilidade com células humanas. Devido ao seu uso de DRG de rato, a interacção proteína-proteína de ratinho-humano pode nem sempre ser demonstrado quando Hucélulas cancerosas homem são utilizados. Sempre que a planear utilizar este modelo com as duas espécies diferentes, a homologia da proteína examinada deve ser testada e, se existe uma elevada homologia que o ensaio é suposto ser adequados para avaliar as interacções proteína-proteína. Assim, deve ter em mente que o ensaio de DRG, tal como proposto no presente protocolo representa o microambiente neural, incluindo outras células, não apenas os neurónios (isto é, células de Schwann, fibroblastos, macrófagos, etc.). Assim, as populações de células específicas que não podem ser testados especificamente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
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