Introduction
Les tumeurs solides diffusent de trois façons principales: invasion directe, la propagation lymphatique, et la propagation hématogène. Cependant, il y a un quatrième moyen de propagation du cancer qui est souvent négligées, la diffusion le long des nerfs. Cancerous invasion neural (CNI) est un itinéraire bien connu de la propagation du cancer, en particulier dans les cancers de la tête et du cou, 1 prostate 2, 3 et du pancréas. 4-8 CNI se produit dans plus de 80% des individus avec adénocarcinome pancréatique, conduisant à la tumeur rétropéritonéale se propager à travers les nerfs coeliaque ganglionnaires. Ces cellules cancéreuses neurotrope ont une capacité unique à migrer vers unidirectionnellement le long des nerfs du système nerveux central (SNC). 9 Cette constatation suggère que le microenvironnement périneural peut être exploitée par des cellules cancéreuses, en fournissant des facteurs qui favorisent la croissance maligne.
L' un des rares modèles in vitro pour la recherche CNI est le ganglion de la racine dorsale (DRG) / modèle de cellules cancéreuses. Ce model est fréquemment utilisé pour étudier l'interaction paracrine entre les cellules stromales et les cancers de neurones. 10-18 Dans ce modèle, les souris ou les lignées de cellules cancéreuses humaines sont cultivées dans une matrice extracellulaire (ECM) adjacent à la préparation de DRG en culture fraîchement dissociées.
Cet article vidéo montre l'application de CNI vitro dans des adénocarcinomes canalaires pancréatiques.
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Protocol
Quatre à six semaines d'âge C57BL femelle / souris CJ (Harlan, Jérusalem, Israël) ont été utilisés dans l'expérience selon l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des spécifications Laboratory Animal Care. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec Institutional Animal Care et l'utilisation Comité et le Département de la réglementation de l'agriculture.
1. récolte la moelle épinière
- Euthanize la souris à l' aide d' une chambre de CO 2. Évitez la dislocation cervicale car elle pourrait causer des dommages aux racines ganglionnaires dues aux forces de cisaillement. A partir de là, effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles.
- Faire tremper l'animal vers le bas avec 70% d'éthanol. Cette étape est importante pour la stérilisation et pour empêcher les cheveux de glisser à travers les organes internes.
- Laissez la souris pour sécher l'éthanol. Empêcher tout contact de l'éthanol avec les organes internes dus à la neurotoxicité.
- Après séchage de la souris, la position à l'aide d'épingles dans la position couchée(face cachée). Placez les broches sur chaque hindlimb et forelimb.
- En utilisant des pinces, faire une incision médiane étendant craniocaudally du cou postérieur à la colonne lombaire. Ensuite, soulever des rabats dermiques bilatéralement en utilisant une pince et d'exposer le tissu sous-cutané.
- Palper le crâne de la souris jusqu'à la jonction cranio. Avec des ciseaux perpendiculaires à l'animal, couper à travers les muscles cervicaux et la colonne vertébrale à la jonction cranio (le 7 ème vertèbre cervicale), en utilisant des pinces lourdes. Disséquer la colonne vertébrale caudale et exciser la colonne vertébrale avec des pinces lourdes jusqu'à atteindre le niveau lombaire (postérieur au niveau des membres).
- Effectuer une transection caudale complète au niveau du rachis lombaire (5 e lombaire vertèbres) en utilisant des pinces lourdes.
- Passez la souris sur (face). Il n'y a pas besoin de couvrir l'incision puisque la DRG est extraite des niveaux vertébraux inférieur et non pas du col.
- Couper à la ligne médiane du cou à l'abdomen, rétracter lepeau latéralement et ensuite coupé pour ouvrir le péritoine.
- Retirez les organes internes à l' intérieur du péritoine (foie, rate, du pancréas, de l' estomac et l' intestin grêle) en bloc. Ensuite, retirez les organes rétropéritonéaux (c. -à , les reins et le pancréas). Céphalique, ouvrez la paroi thoracique.
- En utilisant des pinces et une lame chirurgicale, couper les côtes, en laissant 5 mm de côtes bilatéralement loin de la colonne vertébrale. A ce stade, la colonne vertébrale est séparée du reste du corps.
- Laver la colonne vertébrale à partir du sang de froid (4 ° C) phosphate frais saline tamponnée (PBS) à deux reprises.
2. Isoler les ganglions rachidiens (DRG)
- Utilisez un stéréomicroscope avec grossissement 4X.
- Positionner la colonne vertébrale sur une plate-forme non absorbante non adhérente (Telfa / nylon). Placez la face de la colonne vertébrale à la même orientation cranio-caudale.
- Retirez tous les muscles de la colonne vertébrale et les tissus conjonctifs. Utilisez les nervures comme un point de repère pour les nerfs comme ilsquitter la colonne vertébrale. Ribs protègent également les nerfs des outils chirurgicaux. Le DRG est situé au, thoraciques et lombaires sites cervicales des vertèbres.
- Ensuite, à l'aide de ciseaux coupent le corps vertébral dans la ligne médiane et d'exposer la moelle épinière et les racines DRG par la rétraction latérale douce du corps vertébral.
- Dans l'espace intercostal, suivre le nerf périphérique médiale le long de la nervure latérale du DRG.
- Identifier le DRG. Il semble que le jaune d' 'œuf frit' couché sur le nerf.
- Couper le nerf intercostal distale du DRG laissant 2-3 mm de nerf distal aux ganglions, pour être utilisé aux fins de rachat. Cette "queue" sera supprimé après la récolte.
- Saisir le nerf en utilisant une pince. Pincer le corps DRG lui-même causer des dommages aux cellules neurales et doit être évitée.
- L'approche de la DRG proximalement le long de son attachement à la moelle épinière, par son antérieur et racines postérieures.
- Appliquer la rétraction douce à la DRG en tirant l'efférentes nerf (nerf intercostal souche) latéralement, et couper la partie antérieure et postérieure racines près de la DRG.
- Gardez le DRG dans une boîte de Pétri 35 mm rempli de fraîcheur, de la glace DMEM froid additionné de 10% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine, 1% d'acides aminés non essentiels, et 1% pyruvate de sodium.
3. Implantation dans la boîte de Pétri
- Effectuez les étapes suivantes sur la glace à l'aide des conseils pré-refroidi pipettes pour empêcher ECM solidification.
- En vertu d'un stéréomicroscope à 2-4x grossissement, placez un verre plat de Pétri en bas de 35 mm sur une grille de papier.
IMPORTANT: Les travaux sur la glace afin de maintenir l'ECM à l'état liquide. Créer un spot de 1 mm de diamètre (environ 20 ul) de l'ECM du facteur de croissance appauvri au centre de la grille. - Sous la visualisation directe, placez le DRG au centre de la tache d'ECM à proximité du fond du plat.
Note: Les cellules cancéreuses utilisées dans ce protocole sont les cellules cancéreuses pancréatiques murins (KPC) established à partir d' échantillons de tumeurs fraîchement isolés de souris CPK comme décrit ailleurs 19. - cellules de récolte 40.000 cancéreuses provenant de cultures confluentes, les laver une fois avec PBS, et les remettre en suspension dans 40 ul ECM sur la glace.
- Sous la visualisation directe de la grille en utilisant une mesure de um stéréomicroscope 500 à chaque direction du DRG. À ce stade ensemencer lentement 10.000 cellules / 10 ECM ul. Utiliser un embout prérefroidi 2-10 ul d'injecter les cellules proches du fond plat, en évitant leur propagation dans la matrice ou le détachement de la matrice. (Figure 1).
- Laissez le plat dans une hotte à flux laminaire pendant 10-15 min à se solidifier. Évitez le séchage de l'ECM.
- ajouter lentement du DMEM, préparé comme indiqué plus haut, contre la paroi latérale de la plaque. Ajouter assez moyen pour couvrir l'ECM (environ 2 ml).
- Mettre le plat de retour à l'incubateur à 37 ° C.
- Remplacer le milieu avec un milieu frais le lendemain.
- Remplacez le support tous les 2 jours. </ Li>
4. Acquisition de données, Time-lapse vidéomicroscopie
- Au jour 7 après l'implantation, prendre le plat pour la microscopie de laps de temps. Notez que certaines cellules peuvent nécessiter l'acquisition plus tôt en raison de la migration plus rapide.
- Au cours de l'imagerie en direct, placez le plat dans un environnement fermé à une température moyenne de 37 ± 0,1 ° C et 5% de CO 2.
- Enregistrer les cellules en utilisant une caméra à dispositif à couplage de charge placé sur le microscope.
- Prendre des images numérisées toutes les 10 minutes jusqu'à 72 heures pour suivre la locomotion cellulaire de trois à six cellules différentes.
- Remplacer milieu après 24 h.
- Effectuer l'acquisition de données et d'analyse simple à l'aide du logiciel de microscope.
Analyse 5. Données
- Pour des applications plus avancées ( par exemple, le suivi des cellules en 2D ou 3D) utilisent des logiciels spécialisés (tels que Imaris 4D). Remarque: Ce logiciel détermine les coordonnées xy d'une cellule àun moment donné, ainsi que la distance entre l'origine et la vitesse du mouvement.
- Calculer la vitesse moyenne, en mesurant la distance entre les positions suivantes Voyage dans des intervalles de 10 min. Calculer l'indice de migration vers l'avant (FMI) qui est la distance entre l'avant de la cellule à partir de la neurite et décrit le mouvement unidirectionnel des cellules vers le DRG.
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Representative Results
En utilisant la microscopie vidéo d'imagerie, DRG peut être vu bourgeonnement des neurites 5-7 jours après l'implantation, tandis que les cellules cancéreuses de migrer hors de leurs colonies vers le DRG. Par la 7 ème jour après l'implantation, les cellules cancéreuses viennent en contact avec les neurites (figure 2).
L'indice de migration vers l' avant des cellules cancéreuses pancréatiques utilisées dans le protocole est de 3-4 fois supérieure à celle d'autres lignées cellulaires (QLL2, B16F) (figure 3a). La figure 3b présente un représentant de coordonnées X et Y graphique illustrant le chemin de migration d'une cellule cancéreuse CPK en contact avec le nerf; analyse de vidéomicroscopie time-lapse a montré des différences dans le mouvement vers l' avant , mais pas la vitesse entre les cellules du CPK et les cellules non-invasion (Figure 3c-d).
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Figure 1:. Illustration schématique des étapes du protocole S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Cancer Cell Invasion Le long de la Neurones de la DRG (a) DRG ( en haut) et les cellules cancéreuses (en bas) au jour 0 après ensemencement (grossissement 5X). (B) DRG et le cancer des cellules au jour 7 après le semis (grossissement 5X). Les cellules (c) Cancer migrent le long des neurones DRG (flèches). Toutes les barres représentent 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Ganglion de racine dorsale (DRG) Neurones Induire CNI (a) l' indice d'invasion Nerve des cellules cancéreuses, les cellules MiaPaCa2 CPK, QLL2, et les cellules NIH3T3. (B) Une coordonnée graphique représentant le chemin de migration d'une cellule cancéreuse KPC en contact avec le nerf (rouge) et de la cellule QLL2 (violet). Les coordonnées Y et X sont présentés. (N = 12 à 20 dans chaque groupe). (C) Analyse de la distance à l' origine de la migration des cellules cancéreuses au contact QLL2 axonale et des cellules (d) un cancer du CPK (n = 20). La direction de la migration était constamment vers le ganglion nerveux. Les valeurs de P dans (a) ont été calculés par deux faces test t de Student. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cet article présente un modèle in vitro qui récapitule le microenvironnement cancéreuse dans la niche de neurones, le modèle de DRG. La vidéo montre toutes les étapes à partir de la reconnaissance des repères anatomiques tels que le DRG chez la souris, son extraction et, finalement, la mise en culture dans l'ECM. Co-culture DRG aux côtés des cellules cancéreuses est également présenté. Il n'y a pas d' autres modèles pour la recherche en vitro d'invasion périneural décrits dans la littérature qui rend ce modèle essentiel pour l' étude de la niche microenvironnement périneural in vitro.
Le protocole présenté dans la vidéo comporte deux étapes essentielles. Tout d'abord, il faut prendre soin en saisissant le nerf adjacent au corps de DRG (étape 2.7 dans le protocole). Saisissant ou pincer le DRG pourrait causer des dommages mécaniques ou ischémique irréversible du DRG empêchant de se développer et la germination quand ensemencées dans la boîte de Pétri. La seconde étape critique est l'implantationdes cellules cancéreuses dans la boîte de Pétri à l'intérieur de l'ECM. Il est important de semer les cellules lentement et avec précaution, afin d'éviter le flottement des cellules et leur propagation sur la boîte de Pétri. Le but de l'implantation est de localiser les cellules en un seul endroit, afin de faciliter le suivi de leur mouvement (distance et direction).
Une fois que le modèle établi microenvironnement peut être modifiée en fonction de l'hypothèse testée. Par exemple, l'ajout d'une culture de cellules troisième à la boîte de Petri (par exemple, des cellules non cancéreuses) permet au chercheur de comparer les capacités de migration neurotrophique de cellules différentes. En outre, le chercheur peut appliquer différentes conditions ( par exemple, la température, l' humidité, les facteurs solubles, etc.) et d' examiner leur effet sur la capacité des cellules d'invasion.
Le modèle de DRG permet au chercheur d'étudier l'interaction entre les cellules cancéreuses et les nerfs. Il est également utilisé pour des expériences de laps de temps dans lequel morphologiquedes changements dans la niche périneural sont démontrées de façon temporelle. En outre, les cellules neuro-invasive peuvent être soumis à divers traitements et leur effet sur l'interaction avec les neurites des ganglions peuvent être évaluées.
Non chaque lignée cellulaire est adapté pour le modèle de DRG. Ils doivent être des cellules cancéreuses avec la capacité intrinsèque d'envahir à travers le nerf et à dégrader l'ECM. En outre, notez que chaque type de cellule cancéreuse a des caractéristiques différentes de l'invasion et de sorte que le temps, les cellules devraient prendre contact avec les neurites DRG varient. Par exemple, les cellules du CPK, nous avons utilisé nécessité environ 7 jours pour envahir par l'ECM vers le DRG tandis que les cellules MiaPaCa (cellules d'adénocarcinome pancréatique humain) ont besoin seulement 72-96 h pour faire ce contact.
Une limitation de ce modèle comprend l'éventuelle incompatibilité avec des cellules humaines. En raison de son utilisation de DRG de souris, l'interaction protéine-protéine de souris-humain ne peut pas toujours être mise en évidence lorsque hules cellules cancéreuses de l'homme sont utilisés. Chaque fois que l'intention d'utiliser ce modèle avec les deux espèces différentes, l'homologie de la protéine examinée doit être testée, et s'il y a une forte homologie avec le dosage est censé être adapté pour évaluer les interactions protéine-protéine. De plus, il faut garder à l' esprit que le test DRG tel que proposé dans ce protocole représente le microenvironnement neuronal y compris d' autres cellules, non seulement les neurones (ie, les cellules de Schwann, les fibroblastes, les macrophages, etc.). Ainsi, les populations de cellules spécifiques ne peuvent pas être testés spécifiquement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
