Introduction
Солидные опухоли распространение в трех основных направлениях: прямого вторжения, лимфатический распространение, и гематогенный спред. Тем не менее, есть четвертое средство распространения рака, который часто игнорировали, распространение по нервам. Раковые нейронная инвазия (НКП) является хорошо известным путем распространения рака, особенно при раке головы и шеи, 1 простаты 2, 3 и поджелудочной железы. 4-8 НКП происходит в более чем 80% пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы, что приводит к забрюшинной опухоли распространяются через целиакия ганглиев нервов. Эти раковые клетки нейротропные обладают уникальной способностью мигрировать однонаправленно вдоль нервов по направлению к центральной нервной системе (ЦНС). 9 Эти данные свидетельствуют о том , что периневральная микросреда может быть использована раковыми клетками, обеспечивая факторы , которые поддерживают рост злокачественных.
Одна из немногих моделей в пробирке для исследования CNI является ганглии задних корешков (DRG) / модель раковых клеток. Этот модэль часто используется для изучения паракринной взаимодействия между нейронными стромы и раковых клеток. 10-18 В этой модели мыши или линий раковых клеток человека выращивают в внеклеточного матрикса (ЕСМ) , примыкающей к препаратам свеже диссоциированного культивируемых DRG.
Это видео статье показано применение в пробирке CNI в поджелудочной протоковой аденокарциномы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
От четырех до шести недельных самок C57BL / CJ мышей (Харлан, Иерусалим, Израиль) были использованы в эксперименте по данным Ассоциации по оценке и аккредитации спецификаций лабораторных животных. Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с институциональными уходу и использованию животных комитета и Департамента сельского хозяйства правил.
1. Сбор спинного мозга
- Эвтаназии мыши , используя CO 2 камеры. Избегайте шейки дислокации, как это может привести к повреждению корней ганглиев за счет сил сдвига. С этого момента, выполните все шаги в стерильных условиях.
- Замочите животное вниз с 70% -ным этанолом. Этот шаг важен для стерилизации и для предотвращения волос от перетаскиванием через внутренние органы.
- Оставьте мышь, чтобы высохнуть из этанола. Не допускать контакта этанола с внутренними органами за счет нейротоксичности.
- После сушки мышью, поместите его с помощью булавки в положении лежа(лицом вниз). Поместите штифты на каждой задней конечности и передних конечностей.
- Использование щипцов, сделайте срединный разрез, проходящий краниокаудально от задней шеи до поясничного отдела позвоночника. Затем поднять дермальные закрылки на двусторонней основе с помощью пинцета и подвергать подкожные ткани.
- не Пропальпируйте мыши череп до достижения краниоцервикального перехода. Используя ножницы , перпендикулярные к животному, прорезать шейных мышц и позвоночника на краниоцервикальной стыке (7 - й шейные позвонки), используя тяжелые щипцов. Рассеките позвоночник каудально и не акцизным позвоночника с тяжелыми щипцов до достижения уровня поясничного (задние конечности на уровне).
- Выполните полную хвостового рассечение на уровне поясничного отдела позвоночника (5 - го поясничных позвонков) с использованием тяжелых щипцов.
- Раскатайте курсор (лицевой стороной вверх). Там нет необходимости, чтобы покрыть надрез, так как КСГ извлекается из низших позвоночных уровней и не шейном.
- Сократите по срединной линии от шеи до живота, втянитекожа в боковом направлении, а затем разрезать, чтобы открыть брюшину.
- Удалить внутренние органы внутри брюшной полости (печень, селезенка, поджелудочная железа, желудок и кишечник) гуртом. Затем удалите забрюшинного органов (например, почек и поджелудочной железы). Краниально, откройте стенки грудной клетки.
- Использование щипцов и хирургическим скальпелем, вырезать ребра, оставляя 5 мм ребер на двусторонней основе от позвоночного столба. На данный момент, позвоночный столб отделена от остальной части тела.
- Промыть позвоночником от крови холодным (4 ° C) свежей фосфатным буферным раствором (PBS) дважды.
2. изолируя спинальных ганглиях (DRG)
- Используйте стереомикроскопа с 4-кратным увеличением.
- Расположите позвоночник на неприлипающими, не поглощающим платформы (Telfa / нейлон). Расположите позвоночник лицевой стороной вверх в то же кранио-каудальном ориентации.
- Удалите все мышцы позвоночника и соединительной ткани. Использование ребра в качестве ориентира для нервов, поскольку ониоставить позвоночник. Ребра также защищают нервы от хирургических инструментов. DRG расположены в шейном, грудном и поясничном участках позвонков.
- Далее, с помощью ножниц разрезать тело позвонка по средней линии и подвергать спинного мозга и DRG корни путем осторожного бокового втягивания тела позвонка.
- В межреберье, следуют периферических нервов медиально вдоль ребра сбоку от DRG.
- Определить DRG. Похоже, что желток "яичницы" лежал на нерв.
- Обрежьте межреберные нерва дистальнее DRG, оставляя 2-3 мм нерва дистальнее ганглия, который будет использоваться для обратного хода. Этот "хвост" будут удалены после сбора урожая.
- Возьмитесь нерва с помощью щипцов. Сдавливание само тело DRG будет вызывать нервное повреждение клеток и его следует избегать.
- Подойдите к DRG проксимально вдоль его прикрепления к спинному мозгу, через его передней и задних корешков.
- Слегка втягивание к DRG, потянув ЭФгой нерва (межреберная нерва пень) в поперечном направлении, и разрезают передней и задней корни близко к DRG.
- Держите DRG в 35 мм чашке Петри заполнены свежей, ледяной DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллина-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот, и 1% пирувата натрия.
3. Имплантация в чашке Петри
- Выполните следующие шаги на льду с использованием предварительно охлажденный наконечники пипеток, чтобы предотвратить затвердевание ECM.
- Под стереомикроскопа при увеличении 2-4x, место 35 мм со стеклянным дном чашку Петри на бумажной сетке.
ВАЖНО: Работа на льду, чтобы держать ECM в жидком состоянии. Создание пятна 1 мм диаметра (приблизительно 20 мкл) фактора роста обедненного ЕСМ в центре сетки. - Под непосредственной визуализации, поместите DRG в центре ECM место близко к нижней части блюда.
Примечание: Раковые клетки, используемые в настоящем протоколе представляют собой мышиные клетки рака поджелудочной железы (КЗК) establisхед из свежеизолированных образцов опухолей мышей КЗК , как описано в другом месте 19. - Урожай 40000 раковые клетки из сливающихся культур, промойте их один раз PBS, и ресуспендируют их в 40 мкл ECM на льду.
- Под непосредственной визуализации сетки с использованием стереомикроскопа мера 500 мкм в каждом направлении от DRG. В этот момент медленно семян 10000 клеток / 10 мкл ЕСМ. Используйте 2-10 мкл предварительно охлажденного наконечника, чтобы впрыскивать клетки, близкие к посудомоечную дна, избегая их распространение в матрице или отсоединении матрицы. (Рисунок 1).
- Оставьте чашу внутри колпака с ламинарным потоком в течение 10-15 мин, чтобы затвердеть. Избегайте ECM сушки.
- Медленно добавить DMEM, полученный, как было упомянуто выше, по отношению к боковой стенке плиты. Добавьте достаточно транспортировки среды ЕСМ (около 2 мл).
- Поместите блюдо обратно в инкубатор при 37 ° С.
- Замените носитель свежей средой на следующий день.
- Замените среду каждые 2 дня. </ Li>
4. Сбор данных, Покадровый видеомикроскопии
- На 7-й день после имплантации, возьмите блюдо для времени покадровой микроскопии. Обратите внимание, что некоторые клетки могут потребовать приобретения ранее из-за более быстрой миграции.
- Во время живого изображения, поместите блюдо в закрытой среде при средней температуре 37 ± 0,1 ° С и 5% CO 2.
- Запись клеток с помощью камеры устройства с зарядовой связью размещенный на микроскопе.
- Возьмите оцифрованных изображений каждые 10 мин до 72 ч, чтобы следовать клеток локомоцию от трех до шести различных клеток.
- Заменить среду после 24 часов.
- Выполнять сбор данных и простой анализ с помощью программного обеспечения микроскопа.
5. Анализ данных
- Для более продвинутых приложений (например, отслеживание клеток в 2D или 3D) использовать специализированное программное обеспечение (например, Imaris 4D). Примечание: Эта программа определяет ху координаты ячейки влюбой данный момент времени, а также с расстоянием от координат и скорости движения.
- Вычислить среднюю скорость, измеряя расстояние перемещения между последовательными позициями с интервалом 10 мин. Расчет переднего указателя миграции (FMI), который является расстояние от передней ячейки от нейритов и описывает однонаправленное движение клеток по направлению к DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование изображений микроскопии видео, DRG можно увидеть прорастание нейритов 5-7 дней после имплантации в то время как раковые клетки мигрируют от своих колоний по направлению к DRG. К 7 - й день после имплантации, раковые клетки вступают в контакт с невриты (рисунок 2).
Форвард индекс миграции панкреатических раковых клеток , используемых в протоколе 3-4 раза выше , чем у других клеточных линий (QLL2, B16F) (рис 3а). На рисунке 3b представляет представитель Х и Y координат , график, изображающий путь миграции раковой клетки KPC в контакте с нерва; Анализ видеомикроскопии покадровой показал различия в движении вперед , но не скорость между клетками KPC и не-вторжения в клетки (рис 3в-D).
1 цифра "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Схематическое изображение Шаги протокола Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Cancer Cell , нашествие Вдоль нейронах DRG (а) DRG (верхняя часть ) и раковые клетки (внизу) в 0 день после посева (5x - кратное увеличение). (Б) DRG и рак клеток на 7 -й день после посева (5x - кратное увеличение). Клетки (с) Раковые мигрируют вдоль DRG нейроне (стрелки). Все столбцы представляют 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Спинной ганглий корень (DRG) Нейроны индуцируют CNI (а) Нервные нашествие индекс раковых клеток MiaPaCa2, КЗК клетки, QLL2 и клетки NIH3T3. (Б) Координатный график , отражающий путь миграции раковой клетки KPC в контакте с нерва (красный) и QLL2 клетки (фиолетовый). Y- и X координаты показаны. (П = в каждой группе 12-20). (С) Анализ расстояния от происхождения миграции раковых клеток QLL2 с аксонов контактом и (г) раковых клеток KPC (n = 20). Направление миграции постоянно к нервным ганглии. Значения Р в (а) были рассчитаны с помощью двустороннего критерия Стьюдента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье представлены модель в пробирке , которая резюмирует раковую микросреду в нервной нише, модель DRG. Видео демонстрирует все этапы, начиная от признания анатомических ориентиров, таких как DRG у мышей, его добычи и, наконец, его культивируют в ECM. Совместное культивирование DRG наряду с раковыми клетками также представлена. Там нет других моделей в пробирке исследования периневральная вторжения , описанные в литературе , что делает эту модель необходимо для изучения периневральная нишу микросреду в пробирке.
Протокол, представленные в видео, имеет два важных шагов. Во-первых, следует соблюдать осторожность при схватив нерв рядом с телом DRG (шаг 2.7 в протоколе). Щипцы или зажимая DRG может привести к необратимым механическим или ишемического повреждения DRG предотвращая его выращивания и проращивания, когда высевают в чашку Петри. Вторым важным шагом является имплантацияраковых клеток в чашке Петри внутри ECM. Важно, чтобы семя клетки медленно и осторожно, чтобы избежать Плавучая клеток и их распространение по чашке Петри. Целью имплантации является локализовать клетки в одном месте, чтобы облегчить отслеживание их движения (расстояние и направление).
После того, как создана модель микросреда может быть изменена в соответствии с тестируемой гипотезы. Например, добавление третьей культуры клеток в чашке Петри (например, незлокачественных клеток) позволяет исследователю Сравним возможности нейротропные миграции различных клеток. Кроме того, исследователь может применять различные условия (например, температура, влажность, растворимые факторы и т.д.) и изучить их влияние на способность клеток вторжения.
Модель DRG позволяет исследователю изучить взаимодействие между раковыми клетками и нервов. Он также используется для Промежуток времени экспериментов, в которых морфологическоеизменения в периневральным нише демонстрируются во временной моде. Кроме того, Нейроинвазивные клетки могут быть подвергнуты различным обработкам и их влияние на взаимодействие с невритов ганглиев могут быть оценены.
Не каждая клеточная линия подходит для модели DRG. Они должны быть раковые клетки с внутренней способностью вторгнуться через нерва и разлагать ECM. Кроме того, обратите внимание, что каждый тип клеток рака имеет различные характеристики инвазию и поэтому время клетки, как ожидается, вступать в контакт с невриты DRG изменяется. Например, клетки КЗК мы использовали потребность около 7 дней, чтобы вторгнуться через ECM по направлению к DRG, тогда как клетки MiaPaCa (панкреатических клеток аденокарциномы человека) требуется только 72-96 ч, чтобы сделать этот контакт.
Ограничением этой модели включает в себя возможную несовместимость с человеческими клетками. Благодаря использованию DRG мыши, взаимодействие белок-белок, мышь-человек не всегда может быть продемонстрирована, когда Huиспользуются раковые клетки человека. Всякий раз, когда планируют использовать эту модель с двумя разными видами, гомологии исследуемого белка должны быть проверены и, если существует высокая степень гомологии анализ должен быть пригоден для оценки белок-белковых взаимодействий. Кроме того, он должен иметь в виду , что анализ DRG , как предложено в этом протоколе представляет собой нейронную микросреду в том числе другие клетки, а не только нейронов (т.е. шванновских клетки, фибробласты, макрофаги и т.д.). Следовательно, специфические клеточные популяции не могут быть протестированы специально.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
