Introduction
tumori solidi diffondere in tre modi principali: invasione diretta, diffusione linfatica e diffusione hematogenic. Tuttavia, c'è un quarto mezzo di diffusione del cancro che viene spesso ignorata, diffusione lungo i nervi. Cancerose invasione neurale (CNI) è un percorso ben noto di diffusione del cancro, in particolare nei tumori della testa e del collo, della prostata 1 2, 3 e del pancreas. 4-8 CNI si verifica in più del 80% degli individui con adenocarcinoma del pancreas, portando per tumore retroperitoneale diffondersi attraverso i nervi celiaca gangliari. Queste cellule tumorali neurotropic hanno una capacità unica di migrare unidirezionalmente lungo i nervi verso il sistema nervoso centrale (CNS). 9 Questa scoperta suggerisce che il microambiente perineurale può essere sfruttato da cellule tumorali, fornendo fattori che favoriscono la crescita maligna.
Uno dei pochi modelli in vitro per la ricerca CNI è gangli delle radici dorsali (DRG) / modello di cellula tumorale. Questo modEL è spesso usato per studiare l'interazione paracrino tra cellule tumorali stroma e neurali. 10-18 In questo modello, mouse o linee cellulari tumorali umane sono cresciuti in matrice extracellulare (ECM) adiacente a preparazioni di DRG colta appena dissociato.
In questo articolo il video mostra l'applicazione in vitro CNI in adenocarcinoma del dotto pancreatico.
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Protocol
Quattro a sei settimane di età femminile C57BL / topi CJ (Harlan, Gerusalemme, Israele) sono stati utilizzati nell'esperimento secondo l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento delle specifiche Laboratory Animal Care. Tutte le procedure sperimentali sono state fatte secondo Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso e il Dipartimento di Agricoltura regolamenti.
1. La raccolta del midollo spinale
- Euthanize il mouse utilizzando una camera di CO 2. Evitare dislocazione cervicale in quanto potrebbe causare danni alle radici gangliari a causa di forze di taglio. Da qui in poi, eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili.
- Bagnare animale verso il basso con il 70% di etanolo. Questo passaggio è importante per la sterilizzazione e per prevenire i capelli da trascinare attraverso gli organi interni.
- Lasciare il mouse per asciugare da etanolo. Evitare qualsiasi contatto di etanolo con gli organi interni a causa di neurotossicità.
- Dopo essiccamento del mouse, posizionate utilizzando perni in posizione prona(faccia in giù). Posizionare i perni su ogni degli arti posteriori e arti anteriori.
- Utilizzando pinze, fare una incisione mediana che si estende cranio-caudale dal collo posteriore alla colonna lombare. Successivamente, sollevare lembi dermici bilateralmente con pinze ed esporre il tessuto sottocutaneo.
- Palpare cranio del mouse fino al bivio craniocervicale. Utilizzando le forbici perpendicolari per l'animale, tagliare i muscoli cervicali e della colonna vertebrale a livello della giunzione cranio-cervicale (il 7 ° vertebre cervicali), con pinze pesanti. Sezionare la colonna vertebrale caudale e accise della colonna vertebrale con una pinza pesanti fino a raggiungere il livello lombare (posteriori livello degli arti).
- Eseguire un transezione caudale completa a livello della colonna lombare (la 5 ° vertebra lombare) con pinze pesanti.
- Arrotolare il mouse sopra (faccia in su). Non vi è alcuna necessità di coprire l'incisione dal DRG viene estratto dai livelli vertebrali inferiori e non cervicale.
- Tagliare sulla linea mediana dal collo all'addome, ritrarre ilpelle lateralmente e poi tagliato per aprire il peritoneo.
- Rimuovere gli organi interni all'interno del peritoneo (fegato, milza, pancreas, stomaco e intestino) in blocco. Quindi, rimuovere gli organi retroperitoneali (vale a dire, i reni e pancreas). Cranialmente, aprire la parete toracica.
- Utilizzando pinze e una lama chirurgica, tagliare le nervature, lasciando 5 mm di costole bilateralmente distanza dalla colonna vertebrale. A questo punto, la colonna vertebrale è separata dal resto del corpo.
- Lavare la colonna vertebrale, dal sangue freddo (4 ° C) fosfato fresco salina tamponata (PBS) due volte.
2. Isolare la gangli dorsali (DRG)
- Utilizzare uno stereomicroscopio con 4X ingrandimento.
- Posizionare la colonna vertebrale su una piattaforma assorbente non non aderente (Telfa / nylon). Posizionare la faccia colonna vertebrale fino allo stesso orientamento cranio-caudale.
- Rimuovere tutti i muscoli della colonna vertebrale e del tessuto connettivo. Utilizzare le costole come punto di riferimento per i nervi, come hannolasciare la colonna vertebrale. Costole anche proteggono i nervi dagli strumenti chirurgici. Il DRG si trova alle cervicali, toraciche e lombari siti delle vertebre.
- Successivamente, utilizzando forbici tagliare il corpo vertebrale sulla linea mediana ed espongono il midollo spinale e le radici DRG delicatamente retrazione laterale del corpo vertebrale.
- Nello spazio intercostale, seguire il nervo periferico medialmente lungo il laterale costola al DRG.
- Identificare il DRG. Sembra che il tuorlo d' 'uovo fritto' sdraiato sul nervo.
- Tagliare il distale nervi intercostali al DRG lasciando 2-3 mm di distale nervo gangli, da utilizzare per la retrazione. Questa "coda" sarà rimosso dopo la raccolta.
- Afferrare il nervo con pinze. Stringendo il corpo DRG stesso causerà danni alle cellule neurali e deve essere evitato.
- Avvicinatevi al DRG prossimalmente lungo il suo attaccamento al midollo spinale, attraverso il suo anteriore e radici posteriori.
- Applicare delicata retrazione al DRG tirando la efferenti nervo (nervo intercostale moncone) lateralmente, e tagliare l'anteriore e radici posteriori vicino al DRG.
- Mantenere il DRG in una Petri piastra da 35 mm riempita fresco, ghiaccio DMEM freddo supplementato con 10% di siero fetale di vitello (FCS), 1% di penicillina-streptomicina, aminoacidi non essenziali 1% e 1% di sodio piruvato.
3. L'impianto nella capsula di Petri
- Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio con punte pre-raffreddato pipette per evitare ECM solidificazione.
- Sotto uno stereomicroscopio a 2-4x ingrandimento, mettere da 35 mm di vetro di Petri fondo piatto su una griglia di carta.
IMPORTANTE: Lavorare sul ghiaccio al fine di mantenere l'ECM allo stato liquido. Creare un punto diametro di 1 mm (circa 20 ml) di fattore di crescita impoverito ECM al centro della griglia. - Sotto visualizzazione diretta, posizionare il DRG al centro dello spot ECM vicino al fondo del piatto.
Nota: Le cellule tumorali utilizzati in questo protocollo sono murini cellule tumorali pancreatiche (KPC) ha istituito ilhed da campioni tumorali appena isolate da topi KPC come descritto altrove 19. - Celle di raccolta 40.000 tumorali provenienti da culture confluenti, lavarli una volta con PBS, e li risospendere in 40 ml ECM sul ghiaccio.
- Sotto la visualizzazione diretta della griglia utilizzando un micron misura stereomicroscopio 500 in ogni direzione dalla DRG. A questo punto seme lentamente 10.000 cellule / ml 10 ECM. Utilizzare una punta preraffreddato 2-10 ml per iniettare le cellule vicino al fondo piatto, evitando la loro diffusione nella matrice o distacco della matrice. (Figura 1).
- Lasciare il piatto all'interno di una cappa a flusso laminare per 10-15 min a solidificare. Evitare ECM essiccazione.
- Aggiungere lentamente DMEM, preparata come precedentemente accennato, contro la parete laterale della piastra. Aggiungere abbastanza medio per coprire l'ECM (circa 2 ml).
- Mettere il piatto di nuovo per l'incubatore a 37 ° C.
- Sostituire il mezzo con terreno fresco il giorno seguente.
- Sostituire la media ogni 2 giorni. </ Li>
4. Acquisizione dati, Time-lapse di videomicroscopia
- Il giorno 7 dopo l'impianto, prendere il piatto per la microscopia lasso di tempo. Si noti che alcune cellule potrebbero richiedere l'acquisizione in precedenza a causa della migrazione più veloce.
- Durante l'imaging dal vivo, la capsula in un ambiente chiuso ad una temperatura media di 37 ± 0,1 ° C e 5% CO 2.
- Registrare le celle utilizzando un accoppiamento di carica fotocamera dispositivo posto sul microscopio.
- Prendere immagini digitalizzate ogni 10 minuti per un massimo di 72 ore a seguire locomozione cella da tre a sei celle diverse.
- Sostituire media dopo 24 ore.
- Eseguire acquisizione e analisi dei dati semplice utilizzando il software microscopio.
Analisi 5. I dati
- Per applicazioni più avanzate (ad esempio, il monitoraggio delle cellule in 2D o 3D) utilizzare software specializzati (come Imaris 4D). Nota: Questo software determina le coordinate XY di una cella aqualsiasi dato tempo, insieme con la distanza dall'origine, e la velocità di movimento.
- Calcolare la velocità media misurando il percorso fra posizioni successive in intervalli di 10 min. Calcolare la migrazione Index Forward (FMI), che è la distanza della parte anteriore cella dal neuriti e descrive il movimento unidirezionale delle celle verso il DRG.
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Representative Results
Utilizzando immagini di microscopia video, il DRG può essere visto germogliare neuriti 5-7 giorni dopo l'impianto, mentre le cellule tumorali migrare lontano dalle loro colonie verso il DRG. Con il 7 ° giorno dopo l'impianto, le cellule tumorali vengono a contatto con neuriti (Figura 2).
L'indice di migrazione Forward delle cellule tumorali pancreatiche utilizzati nel protocollo è di 3-4 volte superiore a quella di altre linee cellulari (QLL2, B16F) (Figura 3a). Figura 3b presenta una X rappresentativo e coordinata Y grafico raffigurante la migrazione di una cellula tumorale KPC in contatto con il nervo; time-lapse analisi videomicroscopia ha mostrato differenze nel movimento in avanti, ma non la velocità tra le cellule KPC e le cellule non invadere (Figura 3c-d).
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Figura 1:. Schematica illustrazione del protocollo Passi Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Cancer Cell Invasion Lungo i neuroni del DRG (a) DRG (in alto) e le cellule tumorali (in basso) il giorno 0 dopo la semina (ingrandimento 5X). (B) DRG e il cancro delle cellule il giorno 7 dopo la semina (ingrandimento 5X). Cellule (c), il cancro migrano lungo la DRG neurone (frecce). Tutte le barre rappresentano 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Dorsale della radice gangliari (DRG) Neuroni Indurre CNI (a) indice di Nerve l'invasione delle cellule tumorali, le cellule MiaPaCa2 KPC, QLL2, e le cellule NIH3T3. (B) Una coordinata grafico che rappresenta il percorso di migrazione di una cellula tumorale KPC in contatto con il nervo (rosso) e cellule QLL2 (viola). Le coordinate X e Y sono mostrate. (N = 12-20 in ciascun gruppo). (C) Analisi della distanza dall'origine di migrazione di cellule tumorali QLL2 con contatto assonale e cellule (d) cancro KPC (n = 20). La direzione della migrazione era costantemente verso il ganglio nervoso. I valori P in (a) sono stati calcolati con il test t di Student a due code. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo articolo presenta un modello in vitro che ricapitola il microambiente tumorale nella nicchia neurale, il modello DRG. Il video mostra tutte le fasi a partire da riconoscere punti di riferimento anatomici come il DRG nel topo, la sua estrazione, e, infine, la sua coltura in ECM. è presentato anche co-coltura DRG a fianco con le cellule tumorali. Non ci sono altri modelli in vitro per la ricerca invasione perineurale descritti in letteratura rendendo questo modello indispensabile per studiare la nicchia microambiente perineurale in vitro.
Il protocollo presentato nel video ha due fasi critiche. In primo luogo, si deve prestare attenzione quando si afferra il nervo adiacente al corpo DRG (passo 2,7 nel protocollo). Cogliere o pizzicare il DRG potrebbe causare irreversibili danni meccanici o ischemico al DRG impedendole di crescere e germogliare quando seminato nella scatola di Petri. Il secondo passo fondamentale è l'impiantodelle cellule tumorali nella capsula di Petri all'interno della ECM. E 'importante per seminare le cellule lentamente e con cautela, per evitare la fluttuazione delle cellule e la loro diffusione sul piatto Petri. Lo scopo del fissaggio è di localizzare le cellule in un unico luogo, per facilitare il loro movimento di inseguimento (distanza e direzione).
Una volta stabilito il modello microambiente può essere modificato secondo l'ipotesi testato. Per esempio, aggiungendo una terza coltura cellulare per la piastra di Petri (per esempio, le cellule non cancerose) consente al ricercatore di confrontare le capacità di migrazione neurotropic di cellule differenti. Inoltre, il ricercatore può applicare condizioni diverse (ad esempio, temperatura, umidità, fattori solubili, ecc) ed esaminare il loro effetto sulla capacità delle cellule invasione.
Il modello DRG consente al ricercatore di studiare l'interazione tra le cellule tumorali e nervi. E 'anche usato per esperimenti nel lasso di tempo che morfologicacambiamenti nella nicchia perineurale sono dimostrate in modo temporale. Inoltre, le cellule neuroinvasive possono essere sottoposti a diversi trattamenti e il loro effetto sulla interazione con neuriti dei gangli possono essere valutate.
Non ogni linea cellulare è adatto per il modello DRG. Essi dovrebbero essere le cellule tumorali con la capacità intrinseca di invadere attraverso nervi e di degradare ECM. Inoltre, notare che ogni tipo di cellula tumorale ha diverse caratteristiche di invasione e quindi il tempo ci si aspetta le cellule a entrare in contatto con i neuriti DRG varia. Ad esempio, le cellule KPC abbiamo usato necessità circa 7 giorni di invadere attraverso la ECM verso il DRG mentre le cellule MiaPaca (cellule di adenocarcinoma pancreatico umano) solo bisogno di 72-96 ore per fare quel contatto.
Una limitazione di questo modello include la possibile incompatibilità con cellule umane. Grazie all'uso delle DRG mouse, l'interazione proteina-proteina topo-umano non può sempre essere dimostrata quando hule cellule tumorali uomo sono utilizzati. Ogni volta che la pianificazione di utilizzare questo modello con le due specie diverse, l'omologia della proteina in esame dovrebbe essere testato e se c'è alta omologia si suppone che il test per essere adatto per valutare le interazioni proteina-proteina. Così, si dovrebbe tener presente che il saggio DRG come proposto in questo protocollo rappresenta il microambiente neurale comprese altre cellule, non solo i neuroni (cioè, cellule di Schwann, fibroblasti, macrofagi, ecc). Quindi, specifiche popolazioni cellulari non possono essere testati specificamente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
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