Introduction
الأورام الصلبة تنشر في ثلاث طرق رئيسية: الغزو المباشر، وانتشار اللمفاوي، وانتشار دموية المنشأ. ومع ذلك، هناك وسيلة الرابعة من انتشار السرطان الذي كثيرا ما تهمل، ونشر على طول الأعصاب. سرطاني الغزو العصبي (سى) هو الطريق المعروف من انتشار السرطان، وخاصة في سرطانات الرأس والعنق، 1 البروستاتا 2 و 3 و البنكرياس. يحدث 4-8 CNI في أكثر من 80٪ من الأفراد يعانون من غدية البنكرياس، مما يؤدي لورم خلف الصفاق ينتشر عن طريق الأعصاب الاضطرابات الهضمية العقدية. هذه الخلايا السرطانية موجه للعصب لديها قدرة فريدة على الهجرة باتجاه وعلى طول الأعصاب تجاه النظام العصبي المركزي (CNS). 9 تشير هذه النتائج الى أن المكروية حول العصب يمكن استغلالها من قبل الخلايا السرطانية، وتوفير العوامل التي تدعم نمو خبيث.
واحدة من عدد قليل في المختبر نماذج للأبحاث سى هو العقد الجذرية الظهرية (DRG) / نموذج الخلايا السرطانية. هذا وزارة الدفاعكثيرا ما يستخدم ايل لدراسة التفاعل بين الخلايا نظير الصماوي سدى وسرطان العصبية. 10-18 وفي هذا النموذج، والماوس أو خطوط الخلايا السرطانية البشرية تزرع في المصفوفة خارج الخلية (ECM) المتاخمة لاستعدادات DRG مثقف فصلها حديثا.
يوضح هذا المقال الفيديو تطبيق في المختبر CNI في غدية الأقنية البنكرياس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أربع إلى الإناث C57BL عمره ستة أسابيع / CJ الفئران (هارلان، القدس، إسرائيل) استخدمت في التجربة وفقا للجمعية للتقويم والاعتماد من المواصفات مختبر رعاية الحيوان. وقد أجريت جميع الإجراءات التجريبية وفقا للرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وإدارة أنظمة الزراعة.
1. حصاد الحبل الشوكي
- الموت ببطء الماوس باستخدام غرفة CO 2. تجنب التفكك عنق الرحم كما أنه قد يسبب الضرر لجذور العقدة بسبب قوى القص. من هنا، نفذ كل الخطوات تحت ظروف معقمة.
- نقع الحيوانية إلى أسفل مع الايثانول 70٪. هذه الخطوة مهمة لتعقيم ولمنع الشعر من سحب من خلال أجهزة الداخلية.
- ترك الماوس لتجف من الإيثانول. منع أي اتصال من الإيثانول مع الأجهزة الداخلية بسبب العصبية.
- بعد تجفيف الماوس، وضعه باستخدام دبابيس في موقف المعرضة(الوجه لأسفل). وضع العلامات على كل hindlimb وforelimb.
- باستخدام الملقط، وجعل شق خط الوسط تمتد craniocaudally من الرقبة الخلفي للعمود الفقري القطني. وبعد ذلك، رفع اللوحات الجلد ثنائيا باستخدام ملقط وفضح الأنسجة تحت الجلد.
- جس الجمجمة الماوس حتى وصلت إلى مفترق craniocervical. باستخدام مقص عمودي على الحيوان، وقطع طريق عضلات عنق الرحم والعمود الفقري عند تقاطع craniocervical (7 تشرين الفقرات العنقية)، وذلك باستخدام ملقط الثقيلة. تشريح العمود الفقري caudally واستئصال العمود الفقري مع ملقط الثقيلة حتى تصل إلى مستوى الفقرات القطنية (هند مستوى أطرافه).
- إجراء transection الذيلية الكامل على مستوى العمود الفقري القطني (5 عشر فقرات قطنية) باستخدام ملقط الثقيلة.
- لفة الماوس فوق (مواجهة). ليست هناك حاجة لتغطية الجرح منذ يتم استخراج DRG من مستويات العمود الفقري السفلي وليس سرطان عنق الرحم.
- خفض في خط الوسط من الرقبة إلى البطن، التراجع عنالجلد أفقيا ثم قطع لفتح الغشاء البريتوني.
- إزالة الأعضاء الداخلية داخل الصفاق (الكبد والطحال والبنكرياس والمعدة والأمعاء) ككل. بعد ذلك، إزالة الأجهزة خلف الصفاق (أي والكلى والبنكرياس). Cranially، فتح جدار الصدر.
- باستخدام ملقط وشفرة جراحية، وقطع أضلاعه، وترك 5 ملم من أضلاعه ثنائيا بعيدا عن العمود الفقري. عند هذه النقطة، يتم فصل العمود الفقري من بقية الجسم.
- غسل العمود الفقري من الدم مع الباردة (4 درجة مئوية) الفوسفات جديدة مخزنة المالحة (PBS) مرتين.
2. عزل الجذر الظهري (DRG)
- استخدام مجهر تشريحي مع 4X التكبير.
- وضع العمود الفقري على منصة استيعاب غير غير ملتصقة (Telfa / النايلون). ضع وجه العمود الفقري تصل في نفس التوجه القحف الذيلية.
- إزالة أي العضلات الشوكي والأنسجة الضامة. استخدام الأضلاع كمعلم للأعصاب لأنهاترك العمود الفقري. الأضلاع أيضا حماية الأعصاب من الأدوات الجراحية. وتقع DRG في والصدر، ومواقع قطني عنق الرحم من فقرات.
- بعد ذلك، قطع باستخدام مقص الجسم الفقري في خط الوسط وتعرض الحبل الشوكي وجذور DRG من تراجع الجانبي لطيف من الجسم الفقري.
- في الفضاء وربي، اتبع الأعصاب الطرفية إعلامي على طول جانبي الضلع إلى DRG.
- تحديد DRG. يبدو أن صفار من "البيض المقلي" الكذب على العصب.
- قطع القاصي العصب الوربي إلى DRG ترك 2-3 ملم من القاصي العصبية إلى العقد، لاستخدامها في التراجع. هذا "الذيل" سيتم إزالة بعد الحصاد.
- فهم العصب باستخدام ملقط. سوف معسر الجسم DRG نفسها تسبب تلف الخلايا العصبية ويجب تجنبها.
- الاقتراب من DRG قريب على طول حرصه على الحبل الشوكي، عبر الأمامي وجذوره الخلفية.
- تطبيق تراجع لطيف على DRG عن طريق سحب القوة التنفيذيةferent العصبية (ربي جذع العصب) أفقيا، وقطع الأمامية والخلفية جذور قريب من DRG.
- الحفاظ على DRG في طبق بتري 35 مم مملوءة جديدة، والجليد DMEM البارد تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين ستربتومايسين، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 1٪ البيروفات الصوديوم.
3. زرع في صحن بيتري
- نفذ الخطوات التالية على الجليد باستخدام ماصة نصائح تبريد مسبقا لمنع ECM التصلب.
- تحت مجهر تشريحي في 2-4X التكبير، ووضع الزجاج طبق بتري السفلي 35 مم على ورقة الشبكة.
هام: العمل على الجليد من أجل الحفاظ على ECM في الحالة السائلة. إنشاء 1 مم بقعة (حوالي 20 ميكرولتر) من النمو ECM-المنضب عامل في مركز الشبكة. - تحت رؤية مباشرة، ضع DRG في وسط بقعة ECM على مقربة من قاع الطبق.
ملاحظة: الخلايا السرطانية المستخدمة في هذا البروتوكول هي خلايا سرطان البنكرياس الفئران (KPC) تأسيس العهد[هد] من عينات الأورام المعزولة حديثا من الفئران مؤسسة البترول الكويتية كما هو موضح في مكان آخر (19). - حصاد الخلايا 40،000 السرطان من الثقافات متموجة، ويغسل لهم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، و resuspend لهم في 40 ميكرولتر ECM على الجليد.
- تحت رؤية مباشرة من الشبكة باستخدام ميكرومتر قياس مجهر تشريحي 500 في كل اتجاه من DRG. عند هذه النقطة البذور ببطء 10000 خلية / 10 ECM ميكرولتر. استخدام 2-10 ميكرولتر precooled طرف لحقن الخلايا قريبة من أسفل الطبق، وتجنب انتشارها في المصفوفة أو مفرزة من المصفوفة. (الشكل 1).
- ترك الطبق داخل غطاء تدفق الصفحي لمدة 10-15 دقيقة ليصلب. تجنب تجفيف ECM.
- ببطء إضافة DMEM، الذي أعد كما ذكر سابقا، ضد الجدار الجانبي من لوحة. إضافة المتوسطة يكفي لتغطية ECM (حوالي 2 مل).
- وضع الطبق إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
- استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة في اليوم التالي.
- استبدال المتوسط كل يوم 2. </ لى>
4. الحصول على البيانات، الوقت الفاصل بين Videomicroscopy
- في يوم 7 بعد الزرع، واتخاذ طبق للفحص المجهري مرور الوقت. لاحظ أن بعض الخلايا قد يتطلب اكتساب وقت سابق بسبب الهجرة أسرع.
- خلال التصوير الحي، ووضع الطبق في بيئة مغلقة في درجات الحرارة من 37 ± 0.1 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تسجيل الخلايا باستخدام المسؤول إلى جانب كاميرا الجهاز وضعت على المجهر.
- التقاط صور رقمية كل 10 دقيقة لمدة تصل إلى 72 ساعة لمتابعة تحرك خلية من ثلاثة إلى ستة انواع مختلفة من الخلايا.
- استبدال المتوسطة بعد 24 ساعة.
- أداء الحصول على البيانات وتحليل بسيط باستخدام برنامج المجهر.
تحليل 5. البيانات
- لتطبيقات أكثر تقدما (أي تتبع خلية في 2D أو 3D) استخدام البرمجيات المتخصصة (مثل Imaris 4D). ملاحظة: هذا البرنامج يحدد إحداثيات س ص خلية فيأي يعطى وقت، جنبا إلى جنب مع المسافة من أصل، وسرعة الحركة.
- حساب متوسط السرعة عن طريق قياس مسافة السفر بين المواقف اللاحقة في 10 دقيقة فترات. حساب مؤشر الهجرة إلى الأمام (FMI) والتي هي المسافة من أمام خلية من محوار ويصف حركة أحادي الاتجاه من الخلايا نحو DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام الفيديو المجهر والتصوير، ويمكن أن ينظر إلى DRG تنتشر neurites التي 5-7 أيام بعد غرس في حين أن الخلايا السرطانية المهاجرة بعيدا عن مستعمراتها نحو DRG. وبحلول اليوم ال 7 بعد الزرع، والخلايا السرطانية تأتي في اتصال مع neurites التي (الشكل 2).
مؤشر الهجرة إلى الأمام من خلايا سرطان البنكرياس المستخدمة في بروتوكول 3-4 أعلى أضعاف من تلك التي من خطوط الخلايا الأخرى (QLL2، B16F) (الشكل 3A). الشكل يعرض 3B علامة X تمثيلا وY تنسيق الرسم البياني، والتي تصور مسار الهجرة من الخلايا السرطانية مؤسسة البترول الكويتية في اتصال مع العصب. وأظهر تحليل videomicroscopy الوقت الفاصل بين الخلافات في الحركة إلى الأمام ولكن ليس السرعة بين الخلايا مؤسسة البترول الكويتية والخلايا غير الغازية (الشكل 3C-د).
جوري 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
الشكل 1: توضيح تخطيطي من البروتوكول خطوات الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخلية السرطانية الغزو على طول الخلايا العصبية في DRG (أ) DRG (أعلى) والخلايا السرطانية (القاع) يوم 0 بعد البذر (5X التكبير). (ب) DRG وسرطان الخلايا في يوم 7 بعد البذر (5X التكبير). الخلايا (ج) سرطان تهاجر على طول الخلايا العصبية DRG (السهام). تمثل جميع الحانات 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ضمن الصفحات = "1"> 
الرقم 3: ظهري الجذر العقدة (DRG) الخلايا العصبية لحث CNI (أ) مؤشر غزو العصب الخلايا السرطانية MiaPaCa2، خلايا مؤسسة البترول الكويتية، QLL2، والخلايا NIH3T3. (ب) تنسيق الرسم البياني تصور مسار هجرة الخلايا السرطانية مؤسسة البترول الكويتية في اتصال مع العصب (الحمراء)، وخلية QLL2 (البنفسجية). وتظهر الإحداثيات Y و X. (ن = 12-20 في كل مجموعة). (ج) تحليل المسافة من أصل المهاجرة الخلايا السرطانية QLL2 مع اتصال المحاور والخلايا (د) سرطان مؤسسة البترول الكويتية (ن = 20). كان اتجاه الهجرة باستمرار نحو العقدة العصبية. ف القيم في (أ) حسبت كل وجهين الطالب اختبار تي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه المقالة نموذجا في المختبر الذي يلخص المكروية السرطانية في محراب العصبية، ونموذج DRG. يوضح الفيديو جميع الخطوات بدءا من الاعتراف المعالم التشريحية مثل DRG في الماوس، واستخراج لها، وأخيرا، زراعة في ECM. ويرد أيضا شارك في زراعة وDRG جنبا إلى جنب مع الخلايا السرطانية. لا توجد نماذج أخرى لفي المختبر البحوث غزو حول العصب وصفها في المؤلفات جعل هذا النموذج ضروري لدراسة المكروية المتخصصة حول العصب في المختبر.
بروتوكول المعروضة في الفيديو اثنين من الخطوات الحاسمة. أولا، يجب توخي الحذر عند استيعاب العصب المجاور للجسم DRG (الخطوة 2.7 في البروتوكول). استيعاب أو معسر DRG قد تسبب التلف الميكانيكي أو نقص تروية لا رجعة فيه إلى DRG منعه من النمو وتنتشر عند المصنف في طبق بيتري. الخطوة الثانية الحاسمة هي غرسمن الخلايا السرطانية في طبق بتري داخل ECM. ومن المهم أن البذور الخلايا ببطء وبحذر، لتجنب العائمة من الخلايا وانتشارها على طبق بيتري. الهدف من زرع هو توطين الخلايا في مكان واحد، لتسهيل تتبع حركتهم (المسافة والاتجاه).
وبمجرد إنشاء المكروية نموذج يمكن تعديلها وفقا لفرضية تم اختبارها. على سبيل المثال، إضافة زراعة الخلايا الثالثة على طبق بيتري (على سبيل المثال، الخلايا غير السرطانية) تمكن الباحث من مقارنة قدرات موجه للعصب الهجرة من خلايا مختلفة. وعلاوة على ذلك، يمكن للباحث تنطبق ظروف مختلفة (أي درجة الحرارة، والرطوبة، والعوامل القابلة للذوبان، وما إلى ذلك) ودراسة تأثيرها على قدرة غزو الخلايا.
نموذج DRG تمكن الباحث لدراسة التفاعل بين الخلايا السرطانية والأعصاب. كما انها تستخدم للتجارب الفاصل الزمني الذي الصرفيةوأظهرت التغيرات في محراب حول العصب بطريقة الزمني. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا neuroinvasive يمكن أن تخضع للعلاجات المختلفة ويمكن تقييم أثرها على التفاعل مع neurites التي من العقد.
ليس كل خط الخلية هو مناسبة لنموذج DRG. يجب أن تكون الخلايا السرطانية مع القدرة الذاتية لغزو من خلال الأعصاب وأن تتحلل ECM. وعلاوة على ذلك، لاحظ أن كل نوع من الخلايا السرطانية لديها خصائص غزو مختلفة، وبالتالي فإن الوقت المتوقع لاجراء اتصالات مع neurites التي DRG تختلف الخلايا. على سبيل المثال، الخلايا مؤسسة البترول الكويتية استخدمنا تحتاج حوالي 7 أيام لغزو من خلال ECM نحو DRG في حين الخلايا MiaPaca (خلايا غدية البنكرياس الإنسان) تحتاج فقط 72-96 ساعة لجعل هذا الاتصال.
يتضمن الحد من هذا النموذج عدم توافق ممكن مع الخلايا البشرية. نظرا لاستخدامها من DRG الماوس، لا يمكن دائما أن أظهر تفاعل البروتين البروتين الفأر الإنسان عندما هو جين تاووتستخدم الخلايا السرطانية رجل. كلما تخطط لاستخدام هذا النموذج مع اثنين من الأنواع المختلفة، والتماثل من البروتين فحص ينبغي اختبار وإذا كان هناك تناظر عالية يفترض أن تكون مناسبة لتقييم تفاعلات البروتين البروتين الفحص. كذلك، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن فحص DRG كما هو مقترح في هذا البروتوكول يمثل المكروية العصبية بما في ذلك خلايا أخرى، وليس فقط الخلايا العصبية (أي خلايا شوان، الخلايا الليفية، الضامة، وما إلى ذلك). وبالتالي، السكان خلية معينة لا يمكن اختبارها على وجه التحديد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
