Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.
Dysfunktionalen Skelettmuskel Mitochondrien spielen eine Rolle in Zusammenhang mit der Alterung, Übergewicht und Diabetes Typ II beobachtet veränderten Stoffwechsel. Mitochondriale respirometrischen Assays aus isolierten Mitochondrien Zubereitungen erlauben die Beurteilung der Mitochondrienfunktion sowie die Bestimmung des Mechanismus (en) der Wirkung von Arzneimitteln und Proteinen, die den Stoffwechsel modulieren. Aktuelle Isolierungsverfahren erfordern häufig große Mengen von Gewebe, um qualitativ hochwertige Mitochondrien für respirometrischen Assays notwendig ergeben. Die hier vorgestellten Methoden beschreiben, wie hohe Qualität gereinigt Mitochondrien (~ 450 & mgr; g) von geringen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel isoliert werden für den Einsatz in Hochdurchsatz-Atemmessungen. Wir stellten fest, dass unsere Trennung Verfahren ergibt 92,5 ± 2,0% intakte Mitochondrien durch Messung Citrat-Synthase-Aktivität spektralphotometrisch. Darüber hinaus Western Blot-Analyse in isolierten Mitochondrien führte das schwache Expression des cytosolic Protein, GAPDH und die robuste Expression des mitochondrialen Proteins, COXIV. Die Abwesenheit eines bekannten GAPDH Band in den isolierten Mitochondrien indikativ für kleine Verunreinigungen von nicht mitochondrialen Quellen während des Isolierungsverfahrens. Am wichtigsten ist, die Messung des O 2 Verbrauchsrate mit Mikroplatte basierte Technologie und Bestimmen des respiratorischen Steuerungsverhältnis (RCR) für gekoppelte respirometrischen Assays zeigen hoch gekoppelt (RCR,> 6 für alle Assays) und funktionelle Mitochondrien. Im Ergebnis ist die Zugabe eines separaten Zerkleinern Schritt und Motor angetrieben Homogenisierungsgeschwindigkeit eines zuvor beschriebene Verfahren erheblich reduziert ist die Isolierung von hoher Qualität und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskel, in stark gekoppelt Mitochondrien, die mit hoher Funktions respire Ergebnisse führten während auf Mikrotiterplatte respirometirc Assays.
The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies3-5.
Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.
Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well8. Therefore, we present a modification of previously published methods7 to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O2 consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research9,10.
Die hier vorgestellten Methoden liefern eine detaillierte Beschreibung eines mitochondrialen Isolierungsverfahren von minimalen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel. Dieses Isolierungsverfahren ist in der Lage, High-Functioning, reine Mitochondrien (~ 450 & mgr; g) zu ergeben, wie durch O 2 Verbrauchsraten, RCR-Werte, Maximal Citrat-Synthase-Aktivität und Proteinexpression von Immunoblotting nachgewiesen. Wichtig ist, dass die Mitochondrien von diesem Verfahren getrennt für mehrere respirometirc …
The authors have nothing to disclose.
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
Acid Free- BSA | |||
Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
1.5mL microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
phenylhydrazone | |||
≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |