Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Organoids كنموذج للأمراض المعدية: ثقافة الإنسان وOrganoids المعدة الفئران وهيليكوباكتر بيلوري Microinjection من

Published: November 12, 2015 doi: 10.3791/53359
Automatic Translation
1, 1
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Introduction

تعتمد دراسة مسببات الأمراض على أنظمة نموذج كافية لمحاكاة العدوى في الجسم الحي. وبالنسبة لبعض العوامل المعدية، ونظم نموذج كافية وتفتقر بينما بعض الأنظمة المستخدمة هي بعيدة كل البعد عن المثالية. ومن الأمثلة على ذلك بكتيريا المعدة هيليكوباكتر بيلوري (H. بيلوري)، والذي يرتبط سببيا لتطوير سرطان المعدة. ولكن في غياب نظام زراعة الخلايا أكثر ملاءمة، العديد من الدراسات التي تهدف إلى تحليل الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور مرض السرطان السرطان استخدام خطوط الخلايا، التي تمثل نقطة النهاية لسلسلة السرطانية. أن الخلايا الأولية، غير حولت يكون نموذجا أفضل لهذه الدراسات. ومع ذلك، هي الخلايا الأولية متوفرة فقط من عدد قليل من المانحين ولا يمكن أن تكون مثقف لفترات أطول من الوقت. في السنوات الأخيرة، جعلت أبحاث الخلايا الجذعية تقدما كبيرا لتوفير مصادر جديدة للثقافات الخلية الأولية لدراسة البيولوجيا العدوى.

ثقافات منوقد استخدمت ثلاثة مصادر الخلايا الجذعية: الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)، والخلايا التي يسببها المحفزة الجذعية (التوجيهية) أو الخلايا الجذعية البالغة. تم استخدامها في تصميم نموذج العدوى بفيروسات، مثل الفيروس المضخم للخلايا 1،2 أو الالتهاب الكبدي الفيروسي ج 3-7، والطفيليات، مثل المنجلية 8 أو 9 التوكسوبلازما، والبكتيريا، مثل باكتيريويدز thetaiotaomicron 10 أو السالمونيلا الملهبة لل11. وفي الآونة الأخيرة، تم نشر العديد من المناهج لنموذج عدوى H. بيلوري مع organoids المستمدة من ESC أو الجذع خلايا 12، الخلايا الجذعية الماوس الكبار 21،22 أو الإنسان الخلايا الجذعية البالغة 13-15.

تطوير الثقافات عضي من الخلايا الجذعية البالغة نشأت من الدراسة، والتي كانت المصنفة الخلايا الجذعية واحدة معزولة عن ظهارة الأمعاء الفئران في مصفوفة 3 الأبعاد وجزءا لا يتجزأ من المتوسطة التي تحاكي البيئة من الخلايا الجذعية المعوية تحتوي EGF كما mitogen، R-spondin لتعزيز إشارات Wnt ورأس لمنع البروتين morphogenic العظام (BMP) مما يشير إلى 16. ولا سيما هذه الثقافات لا تتطلب ثقافة مشتركة مع خلايا اللحمة المتوسطة. في هذه الظروف، فإن الخلايا الجذعية تتكاثر وتشكل هياكل صغيرة مع المجالات التي تؤوي خلايا الخبايا المعوية، والمجالات التي تحتوي على خلايا زغابة المعوية. وبالتالي فإن organoids تنظيم الذاتي لتقليد الوضع في الجسم الحي. اليوم، والخلايا الجذعية البالغة من العديد من الفئران والأنسجة إنسانية يمكن زراعتها في المختبر وتقرير المصير، تنتظم organoids التي تشبه في الجسم الحي نظيرهما، مثل الأمعاء الدقيقة والقولون 17، 13،18 المعدة والكبد 19،20، 21 و البنكرياس البروستاتا 22.

نحن هنا نقدم بروتوكول الفيديو إلى الماوس الثقافة أو organoids المعدة البشري من سل الجذعية للبالغينليرة سورية وmicroinject لهم H. بيلوري. ويستند هذا البروتوكول على تقارير سابقة 13،18. هذه الطريقة يمكن تكييفها للزراعة واصابة الثقافات عضي أخرى مثل organoids الأمعاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنشاء المعدة عضي الثقافة

ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل الغدد المعدة من الماوس أو الأنسجة البشرية. ينصح لاستخدام الأنسجة من حوالي 1 سم مربع. ويمكن الحصول على الأنسجة البشرية من استئصال المعدة أو الخزعات.

  1. إعداد المواد
    ملاحظة: مصفوفة الطابق السفلي المستخدمة Matrigel. الحفاظ على مصفوفة الطابق السفلي على الجليد في جميع الأوقات. تخزين المصفوفة الطابق السفلي في -20 درجة مئوية، وذوبان الجليد على الجليد قبل الاستخدام. متوسطة القاعدية يشير إلى المتقدم DMEM / F12 تستكمل مع HEPES. مصدر الجلوتامين المناسب مثل Glutamax والمضادات الحيوية المناسبة مثل 1X Primocin. الحاضنة المستخدمة هي حاضنة الثقافة الخلية القياسية (37 ° C، جو ترطيب، 5٪ CO 2)
    1. تعقيم الأواني بإعداد التعقيم أو باستخدام 100٪ الإيزوبروبيل: الملقط حادة، ومقص، مشرط وشريحة زجاجية المجهري.
    2. قبل يوم والعزلة، ووضع 24 أهلا وسهلالوحة الثقافة ل الخلية في الحاضنة.
    3. إعداد مصفوفة الطابق السفلي وفقا لتوصية الصانعين. إعداد aliquots من 1 مل لتجنب المتكررة دورات تجميد ذوبان الجليد.
    4. إعداد 500 مل مخلبية العازلة وبارد على الجليد. إعداد العازلة 1X من الماء المقطر المعقم مع 5.6 ملي نا 2 هبو 4، 8.0 مم KH 2 PO 4، 96.2 ملي كلوريد الصوديوم، 1.6 ملي بوكل، 43.4 ملي السكروز، 54.9 مم D-سوربيتول، 0.5 ملي DL-dithiothreitol (تنبيه)، ودرجة الحموضة 7. إذا كان يخطط العديد من العزلة، يعد حل 5X تتركز دون DL-dithiothreitol. تصفية العقيمة المخزن المؤقت. قبل العزلة، ويخفف من العازلة 5X مع الماء المعقم ل1x أخرى وإضافة DL-dithiothreitol قبل العزلة.
    5. إعداد وتمييع كل عوامل النمو وفقا لتوصيات الصانعين. استخدام قسامات صغيرة الحجم وتجنب تجميد أذاب دورات. عوامل النمو وظيفية هي حاسمة للنتائج.
    6. متوسطة القاعدية بارد على الجليد وتبريد أجهزة الطرد المركزي إلى 46؛ C.
    7. تدفئة قسامة أخرى متوسطة القاعدية إلى 37 درجة مئوية.
  2. عزل الغدد
    1. جمع حوالي 1 سم مربع من الأنسجة في الجليد المتوسطة القاعدية البارد. الحفاظ على الجليد حتى إعداد. في حين أنه من الأفضل لمعالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن، وتخزين الأنسجة في المتوسط ​​على الجليد إذا لزم الأمر.
    2. وضع الأنسجة في طبق بتري 10 سم وتغطية ذلك مع 1X الباردة عازلة عملية إزالة معدن ثقيل. يغسل عن طريق تحريك بلطف ذهابا وإيابا.
    3. وضع الأنسجة في منطقة جافة 10 سم طبق بتري. باستخدام ملقط، إزالة بعناية المخاط وكذلك طبقة العضلات تحت stereomicroscope. غسل الأنسجة في 1X الباردة عازلة مخلبية عن طريق تحريك بلطف ذهابا وإيابا.
    4. ضع 1 سم 2 الأنسجة على وجافة 10 سم طبق بتري جديد. قطع باستخدام مقص ذلك إلى 20-50 قطعة صغيرة من حوالي 2-5 حجم مم ².
    5. باستخدام ملقط، ضع كل قطعة في أنبوب 50 مل.
    6. اتخاذ العقيمة 10 مل من البلاستيك ماصة. الرطب ماصة في المخزن خالب 1X. احتفظباستخدام هذا نفس ماصة في جميع أنحاء الداخلي.
    7. إضافة 10 مل الباردة العازلة 1X خالب للأنبوب 50 مل. غسل القطع من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا 10 مرات. السماح القطع تسوية. إزالة طاف.
    8. تكرار غسل (الخطوة 1.2.7) حتى طاف هو واضح. هذا يستغرق حوالي 50-100 مل من العازلة خالب 1X ل 1 سم مربع من الأنسجة البشرية.
    9. احتضان قطعة نسيج في 20 مل 1X خالب العازلة تستكمل مع 10 ملي EDTA في RT لمدة 10 دقيقة مع طيف قلب كل 2 دقيقة.
      ملاحظة: الوقت ودرجة الحرارة من هذه الحضانة يمكن أن يكون الأمثل لأي سرعة و / أو الحفاظ على هوية العمارة غدي. ويمكن أن تتراوح بين عدة ساعات الحضانة عند 4 درجات مئوية على منصة المتداول لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في شاكر مع 200 دورة في الدقيقة. نقطة انطلاق جيدة للماوس المعدة هي 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على منصة المتداول وبالنسبة لمعدة الإنسان، و 10 دقيقة في RT.
    10. ماصة مرة بلطف صعودا ونزولا باستخدام ماصة 10 مل. السماح للبياللجنة الاقتصادية لأوروبا ليستقر. تجاهل طاف.
    11. باستخدام ماصة، ونقل القطع لنظيف 10 سم طبق بتري. إزالة السائل.
    12. وضع شريحة زجاجية مجهرية على أعلى من قطعة نسيج. مراقبة أنسجة سليمة تحت مجهر مقلوب للثقافة الخلية مع 10X التكبير.
    13. ممارسة الضغط على شريحة زجاجية وطبق بيتري. عقد كل من في يده (مع قفازات معقمة) والضغط على الزجاج مع الإبهام. سوف حافة الأنسجة تظهر غائم تشير إلى أن يتم الإفراج الغدد من الأنسجة.
    14. مراقبة الغدد صدر تحت مجهر مقلوب للثقافة الخلية مع 10X التكبير.
    15. جمع الغدد والأنسجة في 30 مل الباردة المتوسطة القاعدية. السماح شظايا الأنسجة الكبيرة تستقر.
    16. جمع طاف تحتوي على غدد في اثنين من 15 مل أنابيب.
    17. الطرد المركزي 5 دقائق في 200 x ج و 4 درجات مئوية. طاف تجاهل. بيليه يحتوي على الغدد معزولة. الاحتفاظ بها على الجليد.
  3. البذر من الغدد للبذر، والحفاظ على الطابق السفلي مصفوفة الجليد الباردة في جميع الأوقات، لذلك سيبقى السائل.
  4. البديل 1: بذور 6 آبار على التوالي التخفيف.
    1. تعليق بيليه في 60 ميكرولتر من الطابق السفلي المصفوفة.
    2. إعداد 5 العقيمة 1.5 مل أنابيب على الجليد مع بعضها يحتوي على 50 ميكرولتر من الطابق السفلي المصفوفة. نقل 10 ميكرولتر من الغدد / الطابق السفلي مصفوفة تعليق في أول أنبوب 1.5 مل. تعليق الغدد ونقل 10 ميكرولتر من هذا الحل إلى أنبوب 1.5 مل المقبل. كرر لأنابيب المقبلة.
  5. البديل 2: البذور كمية محسوبة من الغدد لكل بئر. تبدأ مع 100 الغدد في 50 ميكرولتر الطابق السفلي مصفوفة في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا.
    1. تعليق بعناية الغدد مكعبات في 10 مل المتوسطة القاعدية. ضع 50 ميكرولتر على نظيفة 10 مل طبق بتري. عد عدد من الغدد تحت مجهر مقلوب للثقافة الخلية مع 10X التكبير.
    2. حساب تركيز الغدد في الحل. نقل وحدة التخزين التي حساب المشتركانس 400 الغدد إلى أنبوب جديد 15 مل.
    3. الطرد المركزي 5 دقائق في 200 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل طاف والحفاظ على أنبوب على الجليد. إضافة 200 ميكرولتر الطابق السفلي مصفوفة و resuspend بعناية. الحفاظ على الجليد.
  6. خذ 37 ° C الحارة لوحة 24 كذلك (راجع الخطوة 1.1.2) من الحاضنة. وضع قطرة واحدة من 50 ميكرولتر الغدد في الطابق السفلي مصفوفة في وسط البئر. فإن انخفاض شكل قبة.
  7. نقل بعناية لوحة إلى حاضنة الثقافة الخلية. السماح للمصفوفة الطابق السفلي يصلب 10 دقيقة.
  8. إعداد المتوسطة دافئ مع كل عوامل النمو.
    1. لالغدد الإنسان: الملحق المتوسطة القاعدية مع عوامل النمو التالية لorganoids المعدة البشرية: 50 نانوغرام / مل EGF، 10٪ مكيفة رأس المتوسطة، و 10٪ متوسطة مكيفة R-spondin1، 50٪ المتوسطة مكيفة WNT، 200 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل) 10، 1 نانومتر الغاسترين، و2 ميكرومتر TGFbeta المانع و 10 ميكرومتر لفائف ملفوف تشكيل المرتبطة رو بروتين سيرين / ثريونين كيناز المانع (RHOKi).
    2. لالغدد الفئران: الملحق المتوسطة القاعدية مع عوامل النمو التالية للماوس organoids المعدة: 50 نانوغرام / مل EGF، 10٪ مكيفة رأس المتوسطة، و 10٪ مكيفة R-spondin1 المتوسطة، و 50٪ متوسطة مكيفة WNT، 100 نانوغرام / مل FGF10، 10 نانومتر الغاسترين، 0.5 ملي TGFbeta المانع و 10 ميكرومتر RHOKi.
  9. تأخذ لوحة من الحاضنة. إضافة بعناية 500 ميكرولتر المتوسطة مع كل عوامل النمو (1.3.6) إلى كل بئر من دون إزعاج مصفوفة الطابق السفلي. وضعه مرة أخرى إلى الحاضنة.
  10. تحديث متوسطة 3 مرات أسبوعيا (كل 2-3 أيام). لمنعش المتوسطة، وإزالة المتوسطة القديمة مع ترك قطرة من الطابق السفلي مصفوفة سليمة. إضافة بعناية الطازجة والمتوسطة دافئ مع كل عوامل النمو. لا تقم بإضافة RHOKi. فقط إضافة RHOKi مباشرة بعد الغرس الغدد أو بعد انفصالها من organoids (الخطوة 2).

2. مرور المعدة عضي الثقافة قبل Microinjection.

ove_content "> ملاحظة: كل نوع من الثقافة عضي لديه الوقت تضاعف الخاصة ماوس المعوية وكذلك الثقافات المعدة عادة تقسيم 1: 5 كل 5-7 أيام يتم تقسيم الثقافات المعوية البشرية 1: 5 كل 10-12 يوما الإنسان يتم تقسيم الثقافات المعدة 1: 5 كل 14 يوما إذا بدأت من الخلايا واحدة، قد organoids المعدة البشري أيضا أن تأخذ 20 يوما لتشكيل صحيح إنها علامة جيدة إذا الهياكل الناشئة تحيط التجويف المركزية في هذا البروتوكول، يتم تقسيم organoids في... 4 لوحات جيدا ل microinjection. صيانة organoids يتبع نفس البروتوكول، ولكن يمكن استخدام أي لوحة خلية ثقافة أخرى، مثل 24 جيدا لوحات زراعة الخلايا القياسية.

  1. إعداد المواد
    1. ماصات باستور الأوتوكلاف.
    2. قبل يوم واحد مرور، ضع 4 جيدا لوحة زراعة الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. لوحات جيدا 4 لها حواف منخفضة وتسمح المجهرية.
    3. إعداد مصفوفة الطابق السفلي وفقا لتوصية الصانعين. في يوم passagiنانوغرام، ذوبان الجليد الطابق السفلي مصفوفة على الجليد.
    4. إعداد وتمييع كل عوامل النمو وفقا لتوصيات الصانعين.
    5. متوسطة القاعدية بارد على الجليد وتبريد أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  2. مرور الثقافات عضي
    1. تأخذ لوحة مع organoids من الحاضنة. إزالة المتوسطة من بئر واحدة.
    2. إضافة 1 مل من المتوسط ​​القاعدية البارد لمصفوفة الطابق السفلي في البئر. باستخدام micropipette 1 مل، ماصة بقوة صعودا وهبوطا حتى يتم كسر مصفوفة الطابق السفلي حتى. نقل إلى أنبوب 15 مل. ضع على الجليد.
    3. اتخاذ الزجاج ماصة باستير ومصدر إطلاق النار مثل الموقد بنسن.
      1. عقد غيض من ماصة في النار حتى ضاقت افتتاح غيض من 1.5 ملم إلى حوالي 0.5 مم (الشكل 1). السماح للماصة باردة لRT.
      2. الرطب ماصة في المتوسط ​​القاعدية. وماصة ضاقت على النحو الأمثل يستغرق فترة تصل المتوسط ​​أبطأ بشكل واضح ما لا يقدر عليه ضاقت الامم المتحدة ماصة، ولكنه سيظل كلآه pipetting لكذلك.
    4. تناول organoids في ماصة وماصة بقوة 10X صعودا وهبوطا. كسر في organoids يمكن ملاحظة بالعين.
    5. إضافة 9 مل من البرد المتوسطة القاعدية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج و 4 درجات مئوية.
    6. تجاهل بعناية كل طاف. تعليق بيليه في 250 ميكرولتر مصفوفة الطابق السفلي. الحفاظ على الجليد.
    7. خذ 37 ° C الحارة لوحة ثقافة 4 بشكل جيد ووضع قطرة من 50 organoids ميكرولتر / الطابق السفلي مصفوفة في كل بئر.
    8. نقل لوحة بعناية إلى الحاضنة. السماح للمصفوفة الطابق السفلي يصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    9. إعداد الوسيلة المناسبة إما الماوس أو البشري organoids كما هو موضح في الخطوة 1.3.6.
    10. تأخذ لوحة من الحاضنة وتراكب كل قطرة مصفوفة الطابق السفلي مع 500 ميكرولتر المتوسطة.
    11. نقل لوحة إلى الحاضنة.
    12. تحديث متوسطة 3 مرات في الأسبوع كل يوم 2-3 (انظر 1.3.8).
    13. لتجميد organoids، ميكانأما من الناحية تعطيل organoids كما هو موضح لتقسيم في هذا البروتوكول (خطوات 2.2.1-2.2.5). تعليق شظايا عضي في 500 مل المتوسطة تجميد وتجمد حتى -80 درجة مئوية باستخدام cryotubes وحاوية التجميد. للتخزين على المدى الطويل، ونقل الأنابيب إلى النيتروجين السائل.
    14. للذوبان organoids، وإعداد لوحة الثقافة، الطابق السفلي المصفوفة، عوامل النمو والمتوسطة الباردة والحارة كما هو موضح في الخطوات 1.1.2، 1.1.3، 1.1.5، 1.1.6، 1.1.7. تدفئة قارورة المجمدة باستخدام حمام مائي، ونقل الخلايا مباشرة بعد ذوبان إلى أنبوب 15 مل مع 10 مل الباردة المتوسطة القاعدية. الطرد المركزي ولوحة الخلايا على النحو المبين في 2.2.5 إلى 2.2.12.
      ملاحظة: Microinjection من organoids هو شاقة، ولكن يسمح إمكانية فريدة لدراسة التفاعل في 3D.
    15. إذا لم يكن هناك حاجة لدراسات 3D، البذور organoids في بعدين. لهذا، تعطيل organoids على النحو المنصوص عليه في الخطوات 2.2.1 إلى 2.2.6. إضافة المتوسطة 2250 ميكرولتر الباردة مع كل عوامل النمو إلى 250 ميكرولتر من الطابق السفلي أماهتريكس مع شظايا عضي.
      1. البذور في 5 آبار من 24 لوحة جيدا مع 500 ميكرولتر لكل بئر. تغيير متوسطة 3 مرات في الأسبوع، مع استبدال بعناية العليا 400 ميكرولتر فقط، للحفاظ على مصفوفة الطابق السفلي في الجزء السفلي من لوحة دون عائق.
        ملاحظة: سوف Organoids نعلق على لوحة الثقافة الخلية والتوسع في 2D. وقد أظهرت الإلكترون المجهري أن الجانب قمية من الخلايا التي يواجهها المتوسطة في البئر (لا تظهر البيانات).
      2. قبل الإصابة، تبادل كل المتوسطة بما في ذلك القبو مصفوفة، لتسمح للبكتيريا ان نعلق على الخلايا. كما تم وصفها بروتوكول مماثل للعدوى مع H. بيلوري 14. قد تحتوي على طبقات الخلايا 2D ليس كل أنواع الخلايا التي تكون موجودة في organoids 3D.

3. Microinjection من عضي الثقافة.

ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن استخدامها لmicroinject البكتيريا إلى organoids. قد يكون من المفيد لبدء حقن مع organoidsالتي هي أكثر تساهلا لmicroinjection. على سبيل المثال، يمكن أن الماوس organoids المعدة تنمو لتصبح organoids الكيسي كبير جدا التي يسهل استهدافها.

  1. إعداد المواد
    1. سحب الزجاج الشعرية إلى قسمين إبر الحقن باستخدام مجتذب micropipette، وفقا لتوصية الصانعين. سوف مجتذب micropipette تسخين الزجاج الشعرية في الوسط، وسوف سحب الشعرية إلى قسمين، وبالتالي توليد إبرتين الزجاج. هي عملية لسحب العديد من الإبر وتخزينها في طبق بتري نظيفة.
    2. للسماح للعدوى بكتيرية، وإزالة المضادات الحيوية من جميع وسائل الإعلام لا يقل عن 3 تغييرات المتوسطة (= أسبوع واحد). وهذا يخفف المضادات الحيوية من الطابق السفلي المصفوفة. في حالة استخدام السلالة البكتيرية التي هي مقاومة لمضاد حيوي محددة، إضافة هذه المضادات الحيوية محددة لتقليل فرص التلوث.
    3. إعداد مقاعد البدلاء العمل لإبر دقيقة جدا. للعمل على مختلف المستويات السلامة الأحيائية قد يكون من الضروري لوضع ستيريوالمجهر داخل مقعد العقيمة. في هذا البروتوكول، وضخ H. بيلوري تحت مستوى السلامة الحيوية 2 الشروط تحت stereomicroscope داخل مقعد العقيمة.
    4. ثقافة البكتيريا وفقا لبروتوكولات موحدة 13،23.
    5. لتقدير وافر من العدوى (وزارة الداخلية)، وتقدير معلمتين: عدد البكتيريا وعدد الخلايا في عضي على النحو المبين أدناه. وزارة الداخلية يمكن ربط مع النتائج، على سبيل المثال مع المضيفين IL-8 مرنا التعبير 13.
      1. لحساب الكثافة البكتيرية في حل العدوى، وإنشاء أول منحنى القياسية وحدات الكثافة وتشكيل مستعمرة البصرية (كفو) وفقا للبروتوكولات القياسية 24 ساعة. الكثافة البصرية من 0.1 في 550 نانومتر ينبغي أن تسفر حوالي 10 7 CFU / مل.
      2. لتقدير عدد الخلايا في عضي، عد عدد من organoids في 1 جيدا. تعطيل organoids على النحو المبين في الخطوات 2.2.1-2.2.4. بعد الطرد المركزي 5 دقائق في 200 x ج و 4 درجات مئوية،إضافة 1 مل من محلول التفكك الأنزيمي و resuspend.
        1. احتضان عند 37 درجة مئوية مع تكرار تهتز لمدة 5-10 دقيقة. تحديد ما إذا كانت الخلايا وفصلها إلى الخلايا وحيدة تحت المجهر (الميكروسكوب مقلوب مثل لايكا DMIL في 10X التكبير). إذا لزم الأمر إطالة أمد الحضانة.
        2. عدد الخلايا في عضي باستخدام عدادة الكريات وحساب عدد الخلايا في عضي. organoids المعدة البشرية التي يبلغ قطرها حوالي 200 ميكرون لديها ما يقرب من 4000 الخلايا. حقن 0.2 ميكرولتر من محلول بكتيري مع 1 × 10 9 البكتيريا في نتائج مل في وزارة الداخلية التقريبية لل50.
  2. حقن Organoids.
    ملاحظة: ل microinjection، واستقرت الإبرة الزجاج في حامل، والتي يمكن أن تناور في 3 أبعاد من قبل micromanipulator. تبقى Organoids داخل المصفوفة الطابق السفلي داخل البئر. نظرا لحجمها وتحديد المواقع في البئر، وليس كل organoids وعلى قدم المساواة لmenable الحقن. عادة، وأكبر 30 organoids في بئر واحدة يمكن أن تستهدف في 5 دقائق.
    1. البكتيريا الحصاد وغسلها في المتوسط ​​القاعدية وفقا لبروتوكولات القياسية 24 ساعة.
    2. حساب عدد من البكتيريا لكل مل وفقا لكثافة ضوئية (راجع الخطوة 3.1.5.1). تمييع البكتيريا إلى 1 × 10 9 بكتيريا في كل مل في المتوسط ​​القاعدية.
    3. أخذ إبرة الزجاج. باستخدام ملقط كسر غيض بحيث الافتتاح سيكون ما يقرب من 10 ميكرون واسع.
    4. ادخال الإبرة في حامل الحقن وإصلاحه إلى micromanipulator.
    5. يستغرق حوالي 10 حل البكتيرية ميكرولتر في الإبرة.
    6. وضع لوحة 4 بشكل جيد مع حواف منخفضة تحتوي على الثقافات عضي تحت stereomicroscope.
    7. التنقل باستخدام micromanipulator، استهداف organoids واحد مع الإبرة. ضع الإبرة على مقربة من عضي ومن ثم ادخال الإبرة في عضي مع حركة واحدة سريعة. حقن approximatelذ 0.2 ميكرولتر حل بكتيرية في كل عضي باستخدام microinjector.
  3. حصاد Organoids عن أي تحليل.
    1. وكمثال، إصلاح organoids بعد 4 ساعات. إزالة طاف وإضافة 1 مل 2٪ فورمالدهايد واحتضان 20 دقيقة في RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. يمكن معالجة Organoids لالمناعية وفقا للاجراءات المتبعة 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا البروتوكول يسمح عزل الغدد المعدة (الشكل 2). هي المصنفة الغدد في مصفوفة الطابق السفلي، والذي يتصلب قطرة داخل بئر، وتوفير إطار الأبعاد 3 غني laminin والكولاجين للسماح للغدد تنمو لتصبح organoids (الشكل 3). بدء Organoids عادة الخراجات الصغيرة، وداخل 12-16 يوما، والتوسع في المجالات التي يبلغ قطرها 50-300 ميكرون (الشكل 4). وبعض organoids البقاء الكيسي، وبعض سيطور buddings صغيرة. وهذا الأخير هو عادة علامة على تنامي ثقافة صحية. في هذا البروتوكول يستخدم أيضا واحدة من 24 لوحة جيدا لمدة 100 الغدد، 50 ميكرولتر من الطابق السفلي مصفوفة و 500 ميكرولتر من المتوسط. ومع ذلك، يمكن أن يكون هذا السهم العلوي أو يضيق نطاق.

نجاح microinjection يمكن بسهولة ملاحظة تحت stereomicroscope كما حل البكتيرية غائم يملأ عضي (الشكل 5). بعد فترة حضانة كافية، يمكن organoidsتتم معالجتها عن أي أسلوب التحليل المطلوب. على سبيل المثال، organoids يمكن جزءا لا يتجزأ من البارافين، أقسام ويمكن خفض وملطخة باستخدام تقنيات المناعية القياسية. التحليل المجهري للorganoids immunostained تثبت حقن ناجحة من البكتيريا (الشكل 6).

الشكل 1
الشكل 1. صورة من ماصة باستير تستخدم لمرور organoids. وفي كل لوحة، ماصة العليا هي قبل، وانخفاض ماصة بعد تضييق النار. الحجم في الألواح العلوية واليمين هو سم و مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. صورة الممثل من الغدد المعدة البشرية معزولة. مقياس شريط 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مخطط الآبار وصورة ممثل organoids المعدة البشري. تم الاستغناء الغدد في المعدة البشرية معزولة في الطابق السفلي مصفوفة وضعت كما قطرات في الآبار من 24 لوحة جيدا. أسفل اليسار: نظرة عامة على بئر التمثيلي بعد 11 يوما البذر. أسفل اليمين: توسيع المنطقة المشار إليها. مقياس شريط 100 ميكرون. organoids الماوس المعدة توسيع أسرع 18. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53359 / 53359fig4.jpg "/>
واتخذت الشكل 4. نمو نموذجي من organoids المعدة البشري. والمصنف الغدد في مصفوفة الطابق السفلي والصور من نفس عضي على مدى 12 يوما. مقياس شريط 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. Microinjection من organoids المعدة. الصور مجسام من عضي المعدة من قبل (يسار) وخلال (يمين) Microinjection من البكتيريا في التجويف. البكتيريا مرئية كما السحابية داخل عضي. مقياس شريط 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

-together.within صفحة = "دائما"> الشكل (6)
تم microinjected الشكل 6. Immunostained organoids. organoids المعدة البشري مع H. بيلوري. بعد 4 ساعات، كانت ثابتة organoids في امتصاص العرق وجزءا لا يتجزأ من البارافين. كانت ملطخة المقاطع باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف بكتيريا البروتين السمسة الجينات المرتبطة A (CagA) وفقا لأساليب الأنسجة القياسية 25. اليسار العلوي: صورة من عضي تمثيلي. اللوحة السفلى: التكبير العالي لمنطقة محاصر. العلوي الأيمن: التكبير العالي لمنطقة محاصر مع بكتيريا واحدة على مقربة من الخلايا الظهارية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium
HEPES Invitrogen 15630-056
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-028
Matrigel, GFR, phenol free BD 356231
GlutaMAX Invitrogen 35050-079 Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
B27 Invitrogen 17504-044 Stock concentration 50 x, final concentration 1x
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Murine recombinant EGF Invitrogen PMG8043 Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml
Human recombinant FGF10 Peprotech 100-26 Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml
TGFβi A-83-01 Tocris 2939 Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM 
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM 
[Leu15]-Gastrin Sigma-Aldrich G9145 Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM
RHOKi Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Wnt3A conditioned medium Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.
R-spondin1 conditioned medium Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.
Noggin conditioned medium Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.
R-spondin3 R&D 3500-RS/CF Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids.
Noggin Peprotech 120-10 Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids.
TrypLE express Life Technologies 12605036 Enzymatic dissociation solution 
CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers biocision BCS-405
Recovery Cell Culture Freezing Medium Invitrogen 12648-010
Antibiotics
Primocin Invivogen ant-pm-1 An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.
Other
Tweezers Neolabs 2-1033 Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.
4 Well Multidishes Thermo Scientific 144444 You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.
Micromanipulator Narishige M-152
Microinjector Narishige IM-5B
Stereomicroscope Leica MZ75
Workbench Clean Air Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition
Capillaries Harvard Apparatus GC100T-10 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter.
Micropipette Puller Sutter Instruments Flaming Brown Micropipette Puller
anti Cag A antibody Santa Cruz sc-25766

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
  2. Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
  3. Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
  4. Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
  5. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  6. Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
  7. Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
  8. Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
  9. Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
  10. Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
  11. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  12. McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  13. Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
  14. Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
  15. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  19. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  20. Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  21. Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  22. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  23. Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
  24. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
  25. Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
  26. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
  27. Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
  28. Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
  29. Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  30. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
  31. Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
  32. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  33. Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
  34. Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Tags

العدوى، العدد 105، زراعة الخلايا الأولية، العدوى، المضيف تفاعل العوامل المسببة للأمراض، المعدة، Microinjection، الملوية.
Organoids كنموذج للأمراض المعدية: ثقافة الإنسان وOrganoids المعدة الفئران وهيليكوباكتر بيلوري Microinjection من
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids… More

Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori. J. Vis. Exp. (105), e53359, doi:10.3791/53359 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter