Introduction
Patojenlerin çalışma, in vivo enfeksiyon taklit etmek için yeterli bir model sistemler kullanır. Kullanılan sistemlerin bazı optimum uzak iken bazı enfektif ajanlar için yeterli model sistemler eksiktir. Bir örnek nedensel mide kanseri gelişimi ile ilgilidir mide bakterisi Helicobacter pylori (H. pylori) 'dir. Yine daha uygun bir hücre kültürü sisteminde yokluğunda amacı birçok çalışma, kanserli kaskadının son nokta temsil kanser gelişimi kullanımı kanser hücre çizgisi altında yatan moleküler mekanizmaların, analiz etmek. Primer, dönüştürülmemiş hücreler bu çalışmalar için daha iyi bir model olabilir. Bununla birlikte, birincil hücreler donör az sayıda kullanılabilir ve daha uzun süreler boyunca kültüre olamaz. Son yıllarda, kök hücre araştırmaları enfeksiyon biyoloji çalışma için primer hücre kültürleri için yeni kaynaklar sağlamak için önemli bir ilerleme kaydetmiştir.
Dan KültürlerÜç kök hücre kaynağı kullanılmıştır: Embriyonik kök hücreler (ESC), uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) ya da erişkin kök hücreler. Bunlar, Sitomegalovirüs, 1,2 veya Hepatit C virüsü gibi virüsler, enfeksiyonlar modellemek için kullanılmıştır 3-7, örneğin Bacterioides thetaiotaomicron 10 veya Salmonella enterica 11 olarak Plasmodium falciparum 8 veya 9, Toxoplasma gondii ve bakteriler gibi parazitler. En son, çeşitli yaklaşımlar H. enfeksiyonu modellemek için yayınlanmıştır 15 - ESC veya iPS hücrelerinin 12, fare yetişkin kök hücrelerin 21,22 ya da insan erişkin kök hücreleri 13 türetilen organoids ile pylori.
Yetişkin kök hücrelerinden organoid kültürlerinin gelişmesi sıçangil bağırsak epiteli izole tek kök hücre, bir 3-boyutlu bir matris içine ekildi bir çalışmada, gelen veKemik morfojenik protein (BMP) 16 sinyalizasyon inhibe Wnt sinyalizasyon ve Noggin geliştirmek için mitojendir, R-spondin olarak EGF içeren bağırsak kök hücrelerin çevreye taklit ortamda gömülü. Özellikle, bu kültürler mezenkimal hücreler ile birlikte kültür gerektirmez. Bu koşullar altında, kök hücreler çoğalmaya ve etki bağırsak kript hücreleri barındıran küçük yapılar oluşturur, ve bağırsak villuslarının hücreleri içeren alan. Organoids böylece in vivo durumu taklit etmek kendini düzenliyoruz. Bugün birçok fare ve insani dokulardan yetişkin kök hücrelerin in vitro ve yetiştirilebilir gibi ince bağırsak ve kolon 17, mide 13,18, karaciğer 19,20 olarak in vivo meslektaşı benzeyen organoids içine kendini organize pankreas 21 ve Prostat 22.
Burada yetişkin kök cel kültür fare veya insan mide organoids bir video protokol sağlarls H. ile Microinject ve pylori. Bu protokol daha önceki raporlarda 13,18 dayanmaktadır. Bu yöntem, kültürlenmesi ve intestinal organoids gibi diğer organoid kültürleri enfekte edilmesi için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mide organoid Kültür 1. kurulması
Not: Bu protokol, fare veya insan dokusundan gastrik bezleri izolasyonu için de kullanılabilir. Yaklaşık 1 cm² doku kullanılması tavsiye edilir. İnsan dokusu gastrik rezeksiyonu veya biyopsiler elde edilebilir.
- Malzemenin Hazırlanması
Not: Kullanılan bodrum matris Matrigel olduğunu. Her zaman buz üzerinde bodrum matrisi tutun. -20 ° C 'de taban matrisi saklayın ve kullanımdan önce buz üzerinde eritin. Bazal ortam HEPES Gelişmiş DMEM / F12 belirtir; Böyle Glutamax ve 1x Primocin uygun antibiyotikler gibi uygun bir glutamin kaynağıdır. Kullanılan kuluçka standart hücre kültürü kuluçka olan (37 ° C, nemlendirilmiş atmosfer,% 5 CO2)- Keskin forseps, makas, neşter ve bir cam mikroskopisi slayt: otoklav veya% 100 izopropil alkol kullanarak hazırlama kapları sterilize edin.
- Izolasyon gün önce, 24 wel yerleştirininkübatör l hücre kültürü plakası.
- Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak bodrum matrisi hazırlayın. Tekrarlanan donma erime döngülerinden kaçınmak için, 1 ml hacimde hazırlayın.
- Buz üzerinde tampon ve serin kenetleme 500 ml hazırlayın. HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, 96.2 mM NaCI, 1.6 mM KCI 5,6 mM Na 2 ile steril damıtılmış su 1x tamponu hazırlayın, 43,4 mM sakaroz, 54,9 mM, D-sorbitol, 0.5 mM DL-ditiyotreitol (DİKKAT), pH 7. Birkaç izolasyonların planlama ise, DL-ditiyotreitol olmaksızın 5x konsantre solüsyon hazırlanır. Steril filtre tamponu. Izolasyon önce, 1x ve sadece izolasyon önce DL-dithiothreitol eklemek için steril su ile 5x tampon sulandırmak.
- Hazırlayın ve üreticinin önerileri doğrultusunda tüm büyüme faktörlerini sulandırmak. Küçük boyutlu alikotları kullanın ve donma-çözülme döngüleri kaçının. Fonksiyonel büyüme faktörleri sonuçlar için çok önemlidir.
- Serin bazal buz üzerinde orta ve 4 santrifüj soğutmak6 ° C.
- 37 ° C'ye kadar bazal ortam ayrı bir bölüntüsünün, ısıtın.
- Bezlerin izolasyonu
- Buz soğukluğunda bazal ortamda dokusunun yaklaşık 1 cm² toplayın. Hazırlık kadar buz üzerinde tutun. O kısa sürede doku işlemek için tercih edilir olsa da, buz üzerinde orta mağaza dokusu gerekirse.
- 10 cm'lik Petri kabındaki doku yerleştirin ve soğuk 1x şelasyon tamponu ile örtün. Yavaşça ileri geri hareket ettirerek yıkayın.
- Kuru bir 10 sm Petri kabındaki doku yerleştirin. Forseps kullanarak, dikkatli bir stereomikroskop altında mukus yanı sıra kas katmanı kaldırmak. Yavaşça ileri geri hareket ettirerek soğuk 1x kıskaç tamponunda doku yıkayın.
- Yeni, kuru bir 10 cm Petri kabı 1 cm2 doku yerleştirin. Kullanımı makas yaklaşık 2-5 mm² boyutu 20-50 küçük parçalar halinde kesilmiş.
- Forseps kullanarak, 50 ml'lik bir tüp içine tüm parçaları yerleştirin.
- Steril 10 ml plastik pipet alın. 1x kıskaç tamponunda pipet ıslatın. Keepişlem boyunca aynı pipet kullanarak.
- 50 ml'lik bir tüpe 10 ml soğuk 1 x kenetleme tamponu ekleyin. Şiddetle yukarı ve aşağı 10 kez pipetleme parçaları yıkayın. Parçalar dinlendiriniz. Süpernatantı.
- Süpernatant yineleyerek yıkama (adım 1.2.7) açıktır. Bu insan dokusunun 1 cm² yaklaşık 50-100 ml 1x kıskaç tampon alır.
- Yumuşak her 2 dakikada tersini, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 10 mM EDTA ile takviye edilmiş 20 ml 1 x kenetleme tamponu içinde doku parçaları inkübe edin.
Not: Bu inkübasyonun zaman ve ısı hızı ve / veya bez mimarisinin korunmasında biri için optimize edilebilir. Bunlar 200 rpm'lik bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C 'de 5 dakika için haddeleme platformunda 4 ° C'de birkaç saat kuluçkalamadan arasında olabilir. Fare midesinde için iyi bir başlangıç noktası bir yuvarlanma platformun üzerinde 4 ° C de ve insan mide için 30 dakika, oda sıcaklığında 10 dk. - Pipet kez yavaşça yukarı ve 10 ml pipet kullanarak aşağı. Pi izin vereces yerleşmek. Süpernatantı atın.
- Pipeti kullanarak, temiz bir 10 sm petri diş parçaları aktarın. Sıvı çıkarın.
- Doku parçaları üstüne bir cam mikroskop slayt yerleştirin. 10X büyütme ile hücre kültürü için bir ters mikroskop altında sağlam dokuyu uyun.
- Cam slayt ve Petri kabı basınç uygulayın. Hem (steril eldiven ile), el ve başparmak ile cam presleme tutun. Doku jant bezleri dokusunun dışarı salınır belirten bulutlu görünecektir.
- 10X büyütme ile hücre kültürü için ters bir mikroskop altında yayımlanan bezleri uyun.
- 30 ml soğuk bazal ortamda bezleri ve doku toplayın. Büyük doku parçaları dinlendiriniz.
- İki 15 ml tüpler bezleri içeren süpernatant toplayın.
- 200 xg ve 4 ° C'de santrifüje 5 dak. Atın süpernatant. Pelet izole bezleri içerir. Buz üzerinde tutun.
- Bezlerin Tohum
- Alternatif 1: Tohum bir seyreltme satır 6 kuyu.
- Bodrum matris 60 ul pelet Askıya.
- Temel matrisinin her biri 50 ul buz üzerinde 5 steril 1,5 ml tüpler hazırlayın. Transferi ilk 1.5 ml tüp içine bezleri / bodrum matris süspansiyonu 10 ul. Bezleri Askıya ve sonraki bir 1.5 ml'lik tübe Bu çözeltinin 10 ul transfer. Bir sonraki borular için tekrarlayın.
- Alternatif 2: kuyu başına bezlerinin bir hesaplanmış miktarda Tohum. 24 plaka bir kuyuya 50 ul bodrum matrisinin başına 100 bezleri ile başlayın.
- Dikkatle 10 ml bazal ortamda topak haline bezleri askıya. Temiz bir 10 ml Petri kabı 50 ul yerleştirin. 10X büyütme ile hücre kültürü için ters bir mikroskop altında bezlerinin sayısını.
- Çözelti içinde bezlerinin konsantrasyonu hesaplanır. Sesini o conta aktarınins yeni bir 15 ml tüp 400 bezleri.
- 200 xg ve 4 ° C'de santrifüje 5 dak. Süpernatantı atın ve buz üzerinde tüp tutun. 200 ul bodrum matrisi ekleyin ve dikkatlice tekrar süspansiyon. Buz üzerinde tutun.
- 37 ° C sıcak bir 24-çukurlu plaka al inkübatör (adım 1.1.2'ye bakınız). Kuyunun merkezinde taban matris içinde 50 ul bezlerinin bir damla yerleştirin. Damla kubbe oluşturacak.
- Dikkatle geri hücre kültürü inkübatör plaka transfer. Bodrum matrisi 10 dk katılaşmaya edelim.
- Tüm büyüme faktörleri ile sıcak ortamı hazırlayın.
- İnsan bezleri için: İnsan gastrik organoids aşağıdaki büyüme faktörleri ile bazal ortamı Ek: 50 ng / ml EGF,% 10 noggin-koşullandınlmış madde içinde,% 10 R-spondin1-koşullandınlmış madde içinde,% 50, Wnt-koşullandınlmış madde içinde, 200 ng / mi fibroblast büyüme faktörü (FGF), 10, 1 nM gastrin ve 2 uM TGFbeta önleyicisi ve 10 uM rho-birleşik biçim verme sarmal bobin protein serin / treonin kinaz önleyicisi (RHOKi).
- Sıçangil bezleri için: fare gastrik organoids aşağıdaki büyüme faktörleri ile bazal ortamı Ek: 50 ng / ml EGF,% 10 noggin-koşullandınlmış madde içinde, orta R-spondin1 Koşulları 10,% 50,% Wnt-koşullandınlmış madde içinde, 100 ng / FGF10 mi, 10 nM gastrin, 0.5 mM TGFbeta önleyicisi ve 10 uM RHOKi.
- Inkübatör plaka almak. Dikkatle iyi bodrum matris bozmadan her bütün büyüme faktörleri (1.3.6) ile 500 ul orta ekleyin. Geri inkübatör yerleştirin.
- Haftada 3 kez orta (2-3 gün) yenileyin. Orta ferahlatıcı için, sağlam bodrum matris damla bırakarak eski orta kaldırmak. Dikkatle tüm büyüme faktörleri ile taze, sıcak orta ekleyin. RHOKi katmayın. Sadece, doğrudan bezlerinin tohumlama sonra veya organoids (aşama 2) arasında bölmeden sonra RHOKi ekleyin.
Mikroenjeksiyon öncesi Mide organoid Kültür 2. Passage.
"ove_content> Not: organoid kültürünün her türünün kendi katlama süresi vardır Fare bağırsak yanı sıra mide kültürler genellikle bölünmüş olarak 1:. 5 Her 5-7 gün İnsan bağırsak kültürler 1 ayrılır.:. 5 her 10-12 gün İnsan Mide kültürler 1 ayrılır: 5 14 günde tek hücre başlatılan ise, insan mide organoids de düzgün oluşturmak için 20 gün sürebilir Bu tomurcuklanan yapıların merkezi boşluğa çevreleyen bu protokolde, organoids içinde bölünür iyi bir işarettir... organoids ve mikroenjeksiyon. Bakım 4 havuzlu plakalar protokol izlenmiş, ancak bu, standart 24 gözlü hücre kültür levhaları gibi başka bir hücre kültürü plakası, kullanabilir.- Malzemenin Hazırlanması
- Otoklav Pastör pipetleri.
- Günlük geçirilmesinden önce, 37 ° C 'de inkübatör 4 hücre kültür plakası yerleştirin. 4 kuyu plakalar düşük kenarları ve mikromanipülasyon sağlar.
- Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak bodrum matrisi hazırlayın. Passagi günündeng, buz üzerinde bodrum matrisi Çözülme.
- Hazırlayın ve üreticinin önerileri doğrultusunda tüm büyüme faktörlerini sulandırmak.
- Serin bazal buz üzerinde, orta ve 4 ° C'ye kadar santrifüj soğutun.
- Organoid Kültürlerin Passage
- Inkübatör organoids ile plaka almak. Tek kuyudan orta çıkarın.
- De bazal matris soğuk bazal maddesi 1 ml ilave edilir. 1 ml mikropipet kullanarak, şiddetle yukarı pipet ve bodrum matris bozuldu kadar aşağı. 15 ml'lik bir tüpe transfer. Buz üzerine yerleştirin.
- Bir cam Pasteur pipeti ve Bunsen beki gibi yangın kaynağını atın.
- Ucunun açılması yaklaşık 0.5 mm (Şekil 1) 1,5 mm ila daralmış kadar ateşin içine pipet ucu tutun. RT serin pipet edelim.
- Bazal ortamda pipet ıslatın. Optimal daralmış pipet un-daralmış pipet daha gözle görülür yavaş orta alacak, ama yine de olacak tümow iyi pipetlenerek.
- Pipet organoids alın ve şiddetle yukarı ve aşağı 10x pipetle. Organoids kırılma gözle gözlemlenebilir.
- 200 x g'de 5 dakika 4 ° C'de soğuk bazal ortam ve santrifüj 9 ml ekleyin.
- Dikkatle tüm süpernatant atın. 250 ul bodrum matris içinde pelet Askıya. Buz üzerinde tutun.
- 37 ° C sıcak 4 kuyu kültür plaka almak ve iyi, her 50 ul organoids / bodrum matris bir damla yerleştirin.
- Dikkatle tekrar inkübatör plaka aktarın. Temel matrisi 10 dakika boyunca 37 ° C'de katılaşmaya edelim.
- Adım 1.3.6 listelenen fare ya da insan ya organoids için uygun ortamı hazırlayın.
- Kuvöz plaka almak ve 500 ul ortam ile her bodrum matris damla kaplaması.
- Inkübatör plaka aktarın.
- Her 2-3 günde orta haftada 3 kez Yenile (1.3.8 bkz.).
- Organoids dondurulması için mechanBu protokol bölme için anlatıldığı gibi ically organoids bozabilir (Merdivenleri 2.2.1-2.2.5.). Orta donma 500 ml organoid parçaları Askıya ve C kullanarak cryotubes ve dondurma kabının ° -80 dondurma. Uzun süreli saklama için sıvı nitrojen tüpleri aktarın.
- Adımlarla 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7 de belirtildiği gibi organoids çözülme için, kültür plakası, bodrum matrisi, büyüme faktörleri, soğuk ve sıcak ortam hazırlar. Hemen 10 ml soğuk bazal ortam ile 15 ml tüp çözündükten sonra dondurulmuş bir su banyosu kullanılarak şişe ve aktarım hücreleri ısıtın. 2.2.12 ile 2.2.5 özetlendiği gibi Santrifüj hücreleri plaka ve.
Not: organoids Mikroenjeksiyon zahmetli, ama benzersiz olasılık 3D etkileşim çalışma sağlar. - 3D çalışmalara ihtiyaç değilse, iki boyutta organoids tohum. Adımlarla 2.2.6 2.2.1 ortaya koydu olarak Bunun için, organoids bozabilir. Bodrum ma 250 ul tüm büyüme faktörleri ile 2250 ul soğuk orta ekleorganoid fragmanları ile matrisidir.
- Oyuk başına 500 ul, 24 gözlü bir levhanın 5 kuyularda tohum. Bozulmamış plakanın altındaki bodrum matris tutmak için, dikkatli bir şekilde sadece üst 400 ul değiştirilmesi ile, orta, haftada 3 kez değiştirin.
Not: Organoids hücre kültürü plakasına takmak ve 2D artıracaktır. Elektron mikroskopisi hücrelerinin apikal yan kuyudaki ortam karşı karşıya olduğunu göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). - Enfeksiyon önce bakteri hücreleri takmak için izin, bodrum matrisinin dahil olmak üzere tüm orta alışverişinde. Benzer bir protokol, aynı zamanda H. ile enfeksiyon için tarif edilmiştir pylori 14. 2B hücre tabakaları 3 boyutlu organoids içinde mevcut olan tüm hücre tipleri içerebilir.
- Oyuk başına 500 ul, 24 gözlü bir levhanın 5 kuyularda tohum. Bozulmamış plakanın altındaki bodrum matris tutmak için, dikkatli bir şekilde sadece üst 400 ul değiştirilmesi ile, orta, haftada 3 kez değiştirin.
Organoid Kültür 3. mikroenjeksiyonu.
Not: Bu protokol organoids bakterileri Microinject için kullanılabilir. Bu organoids ile enjeksiyon başlamak yararlı olabilirMikroenjeksiyon daha hoşgörülü olduklarını. Örneğin, fare gastrik organoids hedef kolay çok büyük kistik organoids dönüşebilir.
- Malzemenin Hazırlanması
- Üretici firmaların tavsiyelerine uygun olarak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak iki enjeksiyon iğne içine cam kılcal çekin. Mikropipet çektirmenin ortada cam kılcal ısı ve böylece iki cam iğneler üreten, iki bölüme kılcal çeker. Birkaç iğneler çekin ve temiz bir petri bunları saklamak için pratiktir.
- Bakteriyel enfeksiyon izin en az 3 orta değişiklikler (= bir hafta) tüm medya antibiyotik kaldırmak için. Bu bodrum matris antibiyotik sulandırmak. Belirli bir antibiyotiğe dirençli bakteri suşu kullanılarak, kirlilik için şansı en aza indirmek için bu özel antibiyotik ekleyin.
- Microinjections için çalışma tezgahı hazırlayın. Farklı biyogüvenlik seviyelerinde çalışma için bir stereo yerleştirmek gerekebilirsteril bir tezgah içinde mikroskop. Bu protokolde, H. enjekte 2 koşullar steril tezgah içinde bir stereomikroskop altında biyogüvenlik düzeyi altında pylori.
- Kültür standart protokollere göre 13,23 bakteriler.
- Bakteri sayısını ve organoid başına hücre sayısını aşağıda özetlenen: enfeksiyon (İB) çokluğu tahmin etmek için, iki parametre tahmin ediyoruz. MOI ana, IL-8 mRNA ekspresyonu 13, örneğin, sonuçlar ile ilişkili olabilir.
- Enfeksiyon çözeltisi bakteriyel yoğunluğunu hesaplamak için, ilk olarak, standart protokollere göre, 24 optik yoğunluk ve koloni oluşturan birimlerin standart bir eğrisi (CFU) oluşturmaktadır. 550 nm'de 0.1'lik bir optik yoğunluğu yaklaşık 10 7 cfu / ml elde edilmelidir.
- Organoid başına hücre sayısını tahmin etmek, iyi 1'de organoids sayısını. Adımlarda tarif edilen organoids bozabilir 2.2.1-2.2.4. Santrifüj 5 dakika 200 x g'de sonra ve 4 ° C'de,enzimatik ayrışma çözüm ve tekrar süspansiyon 1 ml ekleyin.
- Tekrar 5-10 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin. Hücreler (10 X büyütme gibi Leica DMIL olarak ters mikroskop) bir mikroskop altında, bir hücre içine ayrışmış olup olmadığını belirler. Gerekirse inkübasyon uzatır.
- Hemasitometre kullanarak organoid başına hücre sayımı ve organoid başına hücre sayısını hesaplamak. Yaklaşık 200 um bir çapa sahip insan gastrik organoids yaklaşık 4000 hücreleri vardır. 50 yaklaşık MOI'de ml sonuçları başına 1 x 10 9 bakterilerle bakteriyel çözelti 0,2 ul enjeksiyonu.
- Organoids enjeksiyonu.
Not: Mikroenjeksiyon için, cam iğne bir micromanipulator tarafından 3 boyutlu manevra edilebilen bir tutucu, stabilize edilir. Organoids oyuk içindeki temel matris içinde kalır. Nedeniyle kuyudaki boyutu ve konumlandırma, tüm organoids eşit bir vardırenjeksiyon menable. Genellikle, tek bir kuyuda 30 büyük organoids 5 dakika içinde hedeflenebilir.- Hasat bakteri ve standart protokoller 24'e göre bazal ortamda yıkayın.
- Optik yoğunluğuna göre, ml başına bakteri sayısını hesaplayın (adım 3.1.5.1 bakınız). Bazal ortam içinde, ml başına 1 x 10 9, bakteride bakteriye seyreltilir.
- Bir cam iğne atın. Açılış yaklaşık 10 mikron genişliğinde olacak şekilde kullanılması forseps ucu bölünürler.
- Enjeksiyon tutucu içine iğne takın ve mikromanipülatör düzeltmek.
- Iğne içine yaklaşık 10 ul bakteri çözümü alın.
- Stereomicroscope altında organoid kültürleri içeren düşük kenarlı 4 plaka koyun.
- Mikromanipülatör ile gezinme, iğne ile tek organoids hedef. Organoid yakın iğne yerleştirin ve sonra bir hızlı hareketi ile organoid içine iğne takın. Approximatel enjekteher birine y 0,2 ul bakteri solüsyonu mikroenjektör kullanılarak organoid.
- Herhangi Analiz Hasat Organoids.
- Örnek olarak, 4 saat sonra organoids düzeltin. Süpernatantı ve 1 ml% 2 formaldehid ilave edildi ve 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N 20 dakika inkübe edilir. Organoids, standart prosedürlere uygun olarak 25 immünohistokimya için işlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, gastrik bezleri (Şekil 2) ayrılmasına izin verir. Bezler organoids içine bezleri büyümeye izin laminin ve kolajen bakımından zengin bir 3 boyutlu bir çerçeve (Şekil 3) sağlanması, bir kuyu içinde damla olarak katılaşan temel matris içine ekilir. Organoids tipik haliyle küçük kistler başlar ve 12-16 gün içinde, bunlar 50-300 um (Şekil 4) bir çapa sahip olan küreler genişletmek. Bazı organoids bazı küçük buddings geliştirecek, kistik kalacak. İkincisi, genellikle sağlıklı büyüyen bir kültür işaretidir. Bu protokol, bir 24 yuvalı plakanın bir de 100 bezleri, temel matrisin 50 ul ortam 500 ul için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yukarı ya da downscaled olabilir.
Bulutlu, bakteriyel solüsyon organoid (Şekil 5) doldurur gibi mikroenjeksiyon başarısını kolaylıkla stereomikroskop altında görülebilir. Yeterli inkübasyon süresinden sonra, organoids canİstediğiniz herhangi bir analiz yöntemi için işlenebilir. Örneğin, organoids parafine gömülü olabilir, bölümler kesilmiş ve standart immünohistokimyasal teknikleri kullanılarak boyandı. Immunohistokimyasal organoids mikroskobik analizi (Şekil 6) bakteri başarılı bir enjeksiyon göstermektedir.
Şekil organoids geçişi için kullanılan Pasteur pipeti 1. Görüntü. Her panelde, üst pipet, daha önce yangın daralma sonra alt pipet olduğunu. Üst ve sağ panellerde ölçek cm ve mm'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Temsilcisi görüntü İzole insan mide bezlerinin. Ölçek bar 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil kuyu ve insan gastrik organoids temsili görüntü 3. Şema. Izole edilmiş insan gastrik bezleri bazal matris içinde dağıtılmış ve 24 gözlü bir plaka gözlerine damla olarak yerleştirilmiştir. Sol alt: 11 gün tohumlama sonra temsili bir kuyunun bakış. Alt sağ: Belirtilen alanın Genişleme. Ölçek çubuğu 100 mikron. Mide fare organoids 18 daha hızlı genişletin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4 "src =" / files / ftp_upload / 53359 / 53359fig4.jpg "/>
İnsan gastrik organoids Şekil 4. tipik büyümesi. Bezleri temel matris ve aynı organoid görüntüleri serpildi 12 günlük bir süre boyunca alındı. Ölçek çubuğu 100 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mide organoids Şekil 5. Mikroenjeksiyon. Önce (solda) ve lümen içine bakteri (sağda) mikroenjeksiyon sırasında mide organoid bir Stereoskop görüntüler. Bakteriler organoid içinde bulut gibi görebilir. Ölçek çubuğu 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. İmmüno organoids. İnsan gastrik organoids H. mikroenjeksiyon yapıldı pylori. 4 saat sonra, organoids paraformaldehid içinde sabitlendi ve parafin içine gömülmüştür. Bölümler standart histoloji yöntemlerine 25'e göre bakteriyel protein Sitotoksisite ilişkili gen A (CagA) hedefleyen antikorlar kullanılarak boyandı. Üst sol: temsili organoid İmajının. Alt panel: kutulu alanın yüksek büyütme. Sağ üst:. Epitel hücrelerine yakın tek bir bakteri ile kutulu alan yüksek büyütme bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
References
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
- Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
- Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
- Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
- Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
- Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
- McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
- Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
- Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
- Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
- Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
- Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
- Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
