Introduction
Studiet av patogener er avhengig av tilstrekkelig modellsystemer for å etterligne in vivo infeksjon. For noen smittestoffer, er tilstrekkelige modellsystemer mangler mens noen av de brukte systemene er langt fra optimal. Et eksempel er den gastriske bakterien Helicobacter pylori (H. pylori), som er kausalt relatert til utvikling av magekreft. Men i mangel av et mer passende cellekultur system, mange studier som tar sikte på å analysere de molekylære mekanismene bak kreftutvikling bruk kreftcellelinjer, som representerer endepunktet for kreft kaskade. Primære, ikke-transformerte celler ville være en bedre modell for disse studiene. Imidlertid primære celler er kun tilgjengelig fra et lite antall donorer, og kan ikke bli dyrket over lengre tidsperioder. I de senere årene har stamcelleforskning gjort betydelige fremskritt for å gi nye kilder for primære cellekulturer for studiet av infeksjon biologi.
Kulturer fratre stamcelle kilder er brukt: embryonale stamceller (ESC), induserte pluripotente stamceller (IPSC) eller voksne stamceller. De er blitt brukt til å modellere infeksjoner med virus, slik som cytomegalovirus 1,2 eller hepatitt C-virus 3 - 7, parasitter, slik som Plasmodium falciparum 8 eller 9 Toxoplasma gondii, og bakterier, for eksempel Bacterioides thetaiotaomicron 10 eller Salmonella enterica 11. Nå nylig, har flere tilnærminger er publisert for å modellere infeksjon med H. pylori med organoids avledet fra MGP eller iPS-celler 12, mus voksne stamceller 21,22 eller menneskelige voksne stamceller 13 - 15.
Utviklingen av organoid kulturer fra voksne stamceller stammer fra en studie hvor enkelt stamceller isolert fra murine tarmepitelet ble sådd ut på en tre-dimensjonal matrise oginnebygd i medium som etterlignet miljøet av tarm stamceller inneholdende EGF som mitogen, R-spondin å forbedre Wnt signalering og Noggin å inhibere benmorfogent protein (BMP) signal 16. Spesielt disse kulturene ikke krever co-kultur med mesenchymalceller. Under disse forhold vil stamcellene proliferere og danne små strukturer med domener husing celler i tarm krypter, og domener som inneholder cellene i tarmtott. De organoids således selv organisere å etterligne in vivo situasjonen. I dag kan adulte stamceller fra mange murine og humane vev dyrkes in vitro og selv organisere inn organoids som ligner deres in vivo motstykke, som tynntarm og tykktarm 17, mage 13,18, lever 19,20, bukspyttkjertel 21 og prostata 22.
Her gir vi en video protokoll til kultur mus eller menneskelige mage organoids fra voksen stilk cells og microinject dem med H. pylori. Denne protokollen er basert på tidligere rapporter 13,18. Denne fremgangsmåten kan tilpasses for dyrking og infisere andre organoid kulturer som intestinale organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablering av Gastric Organoid Culture
Merk: Denne protokoll kan anvendes for isolering av gastriske kjertler fra mus eller humant vev. Det anbefales å bruke vev på ca 1 cm². Menneskelig vev kan fås fra mage reseksjoner eller biopsier.
- Utarbeidelse av Material
Merk: Den brukte kjelleren matrisen er Matrigel. Hold kjelleren matrise på is til alle tider. Oppbevar kjelleren matrisen ved -20 ° C og tines på is før bruk. Basal medium refererer til Advanced DMEM / F12 supplert med HEPES; en egnet kilde, for eksempel glutamin Glutamax og hensiktsmessige antibiotika som 1x Primocin. Inkubatoren brukes er en standard cellekulturinkubator (37 ° C, fuktet atmosfære, 5% CO2)- Steril forberedelse kjøkkenutstyr av autoklav eller ved hjelp av 100% isopropylalkohol: skarpe pinsett, saks, en skalpell og et glass mikros lysbilde.
- Dagen før isolasjon, plasserer en 24 well cellekulturplate i inkubatoren.
- Forbered kjelleren matrise henhold til produsentens anbefaling. Forberede prøver med 1 ml for å unngå gjentatte fryse tine sykluser.
- Forbered 500 ml gelateringsmidler buffer og kul på is. Forbered 1x buffer fra sterilt destillert vann med 5,6 mM Na2 HPO 4, 8,0 mM KH 2PO 4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM sukrose, 54,9 mM D-sorbitol, 0,5 mM DL-ditiotreitol (FORSIKTIG), pH 7. Hvis du planlegger flere isoleringer, utarbeide en 5x konsentrert løsning uten DL-dithiothreitol. Steril filter bufferen. Før isolering, fortynne 5x buffer med sterilt vann til 1x og legge DL-dithiothreitol like før isolasjon.
- Utarbeide og fortynne alle vekstfaktorer i henhold til produsentens anbefalinger. Bruk små-sized porsjoner og unngå fryse-tine sykluser. Funksjonelle vekstfaktorer er avgjørende for resultatene.
- Cool basal medium på is og kjøle sentrifugen til 46; C.
- Varm en annen aliquot av basalmedium til 37 ° C.
- Isolering av kjertler
- Samle ca 1 cm² av vev i iskald basal medium. Hold på is inntil forberedelse. Selv om det er å foretrekke å behandle vev så snart som mulig, lagre vev i medium på is om nødvendig.
- Plasser vev i en 10 cm petriskål og dekke den med kaldt 1x chelation buffer. Vask ved å forsiktig flytte frem og tilbake.
- Plasser vevet i en tørr 10 cm petriskål. Bruk pinsett, forsiktig fjerne slim samt muskel lag under en stereomikroskop. Vask vevet i kaldt 1x chelaterende buffer ved forsiktig bevegelse frem og tilbake.
- Plasser en cm 2 vev på et nytt, tørt 10 cm petriskål. Bruke saks klippe den i 20-50 små biter av ca på 2-5 mm² størrelse.
- Bruk pinsett, plassere alle brikkene i et 50 ml tube.
- Ta en steril 10 ml plast pipette. Fukt pipetten 1x gelaterende buffer. Beholdeved hjelp av den samme pipette gjennom hele prosedyren.
- Tilsett 10 ml kald 1x chelaterende buffer til 50 ml røret. Vask bitene av kraftig pipettere opp og ned 10 ganger. La bitene avgjøre. Fjern supernatanten.
- Gjenta vaske (trinn 1.2.7) inntil supernatanten er klar. Dette tar ca 50-100 ml 1x gelateringsmiddel buffer for en cm² av menneskelig vev.
- Inkuber vev stykker i 20 ml 1 x chelaterende buffer supplert med 10 mM EDTA ved romtemperatur i 10 min med forsiktig å invertere hvert 2 min.
Merk: Tid og temperatur av denne inkubasjonen kan optimaliseres for hver hastighet og / eller bevaring av kjertel arkitektur. De kan variere fra flere timer inkubasjon ved 4 ° C på en rullende plattform til 5 minutter ved 37 ° C i et risteapparat med 200 rpm. Gode utgangspunkt for mus er magen 30 min ved 4 ° C på en rullende plattform og for human mage, 10 min ved RT. - Pipette gang forsiktig opp og ned ved hjelp av 10 ml pipette. La pieces å bosette seg. Kast supernatanten.
- Ved hjelp av pipetten, overføre bitene til et rent 10 cm petriskål. Fjern væsken.
- Plasser et glass mikros lysbilde på toppen av vev stykker. Observer intakt vev under en invertert mikroskop for cellekultur med 10X forstørrelse.
- Legg press på glass slide og petriskål. Hold både i hånden (med sterile hansker) og trykke på glass med tommelen. Kanten av vevet vil vises klart indikerer at kjertlene er sluppet ut av vevet.
- Observere de frigitte kjertlene under en invertert mikroskop for cellekultur med 10X forstørrelse.
- Samle kjertler og vev i 30 ml kald basalmedium. La store vevsfragmentene avgjøre.
- Samle supernatanten inneholdende kjertler i to 15 ml-rør.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 200 xg og 4 ° C. Kast supernatant. Pelleten inneholder isolerte kjertler. Hold dem på is.
- Seeding av kjertler
- Alternativ 1: Seed 6 brønner i en fortynning rad.
- Suspendere pellet i 60 mL av kjelleren matrise.
- Forbered 5 sterile 1,5 ml rør på isen med hver inneholder 50 ul kjeller matrise. Overføring 10 ul av kjertler / kjeller matrise suspensjonen inn i den første 1,5 ml rør. Suspendere kjertler og overføre 10 ul av denne løsningen til neste 1,5 ml rør. Gjenta for de neste rør.
- Alternativ 2: Seed en beregnet mengde kjertler per brønn. Start med 100 kjertler per 50 ul kjeller matrise i en brønn av en 24 brønners plate.
- Nøye suspendere de pelleterte kjertlene i 10 ml basalmedium. Plasser 50 fil på en ren 10 ml petriskål. Tell antall kjertler i henhold til et invertert mikroskop for cellekultur med 10X forstørrelse.
- Beregn konsentrasjonen av kjertlene i oppløsningen. Overføre volumet som Contains 400 kjertlene til en ny 15 ml tube.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 200 xg og 4 ° C. Fjern supernatant og holde røret på is. Tilsett 200 ul kjeller matrise og nøye insulinet godt blandet. Hold på is.
- Ta 37 ° C varm 24-brønns plate (se trinn 1.1.2) fra inkubatoren. Plassere en dråpe av 50 ul kjertler i kjeller matrise i sentrum av brønnen. Nedgangen vil danne en kuppel.
- Overføre nøye platen tilbake til cellekulturinkubatoren. La kjelleren matrise stivne 10 min.
- Forbered varm medium med alle vekstfaktorer.
- For menneske kjertler: Supplement basal medium med følgende vekstfaktorer for menneske mage organoids: 50 ng / ml EGF, 10% noggin kondisjonerte medium, 10% R-spondin1 kondisjonerte medium, 50% Wnt-kondisjonert medium, 200 ng / ml fibroblast vekstfaktor (FGF) 10, 1 nM gastrin, og 2 mM TGFbeta inhibitor og 10 uM rho-assosiert kveilet spiral dannende protein serin / treonin kinase inhibitor (RHOKi).
- For murine kjertler: Supplement basal medium med følgende vekstfaktorer for mus mage organoids: 50 ng / ml EGF, 10% noggin kondisjonerte medium, 10% R-spondin1 kondisjonerte medium, 50% Wnt-kondisjonert medium, 100 ng / ml FGF10, 10 nM gastrin, 0,5 mM TGFbeta hemmer og 10 uM RHOKi.
- Ta plate fra inkubatoren. Legge nøye 500 mL medium med alle vekstfaktorer (1.3.6) til hver brønn uten å forstyrre kjelleren matrise. Plasser den tilbake til inkubatoren.
- Oppdatere mellom 3 ganger per uke (hver 2-3 dager). For forfriskende medium, fjerne den gamle medium med å forlate dråpe kjelleren matrise intakt. Legge friske, varm medium nøye med alle vekstfaktorer. Ikke legg RHOKi. Bare legge RHOKi rett etter såing av kjertler eller etter splitting av organoids (trinn 2).
2. Passage av Gastric Organoid Culture Før Mikroinjeksjon.
ove_content "> Merk: Hver type organoid kultur har sin egen dobling tid Mouse intestinal samt mage kulturer er vanligvis delt 1: 5. hver 5-7 dager mennesketarm kulturer er splittet 1:.. 5 hver 10-12 dager Menneskelig mage kulturer er splittet 1: 5 hver 14. dag hvis initiert fra enkeltceller, kan menneskelige mage organoids også ta 20 dager å danne skikkelig Det er et godt tegn hvis spirende strukturer omgir de sentrale lumen I denne protokollen, er organoids delt i... 4 brønners plater for mikroinjeksjon. Vedlikehold av organoids følger den samme protokollen, men kan bruke en hvilken som helst annen cellekulturplaten, som for eksempel standard 24 brønns cellekulturplater.- Utarbeidelse av Material
- Autoclave Pasteur pipetter.
- Dagen før passering, plasserer en fire godt cellekultur plate i inkubator ved 37 ° C. De 4 brønners plater har lave kanter og la micromanipulation.
- Forbered kjelleren matrise henhold til produsentens anbefaling. På dagen for passaging, tine kjelleren matrise på is.
- Utarbeide og fortynne alle vekstfaktorer i henhold til produsentens anbefalinger.
- Cool basal medium på is og kjøle sentrifugen til 4 ° C.
- Passering av Organoid kulturer
- Ta platen med organoids fra inkubatoren. Fjern mediet fra en brønn.
- Tilsett 1 ml kald basal medium til kjelleren matrisen i brønnen. Ved hjelp av en 1 ml mikropipette, kraft pipette opp og ned til kjelleren matrisen er brutt opp. Overføring til en 15 ml tube. Plasser på is.
- Ta et glass Pasteur pipette og en brann kilde som en Bunsen-brenner.
- Hold pipettespissen inn i ilden til åpningen av tuppen har falt fra 1,5 mm til 0,5 mm (figur 1). La pipetten kult å RT.
- Fukt pipetten i basal medium. Et optimalt smalere pipette vil ta opp mellom synlig tregere enn en un-snevret pipette, men det vil fortsatt alleow pipettering godt.
- Ta opp organoids i pipette og kraftig pipette 10x opp og ned. Brudd på de organoids kan observeres ved øyet.
- Legg 9 ml kald basal medium og sentrifuger i 5 minutter ved 200 xg og 4 ° C.
- Forkaste nøye all supernatant. Suspendere pellet i 250 mL kjelleren matrise. Hold på is.
- Ta 37 ° C varm fire vel kultur plate og legg en dråpe 50 mL organoids / kjeller matrise i hver brønn.
- Overfør platen forsiktig tilbake til inkubatoren. La kjelleren matrisen stivner ved 37 ° C i 10 min.
- Forbered egnet medium for enten mus eller menneskelige organoids som er oppført i trinn 1.3.6.
- Ta platen fra inkubatoren og overlappe hverandre kjelleren matrise dråpe med 500 mL medium.
- Overfør platen til inkubatoren.
- Oppdatere medium 3 ganger per uke hver 2-3 dager (se 1.3.8.).
- For frysing av organoids, mechanmatisk forstyrre organoids som beskrevet for splitting i denne protokollen (Steps 2.2.1-2.2.5.). Suspendere organoid fragmenter i 500 ml iskaldt medium og fryse til -80 ° C ved hjelp cryotubes og en frysing container. For langtidslagring, overføre rørene til flytende nitrogen.
- For tining av organoids, forberede kulturplaten, kjeller matrise, vekstfaktorer, kaldt og varmt medium som beskrevet i trinn 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Varm opp frosne ampullen ved hjelp av et vannbad, og overføre cellene umiddelbart etter opptining til et 15 ml rør med 10 ml kald basalmedium. Sentrifuger og plate cellene som skissert i 2.2.5 til 2.2.12.
Merk: Mikroinjeksjon av organoids er arbeidskrevende, men gir en unik mulighet til å studere samspillet i 3D. - Hvis 3D-studiene ikke er nødvendig, frø organoids i to dimensjoner. For dette forstyrre organoids som legges ut i trinn 2.2.1 til 2.2.6. Legg 2,250 mL kald medium for alle vekstfaktorer til 250 mL av kjelleren matrix med organoid fragmenter.
- Seed i 5 brønner på en 24 brønners plate med 500 mL per brønn. Endre medium 3 ganger i uken, med nøye erstatte de øverste 400 mL bare, for å holde kjelleren matrise på bunnen av tallerkenen uforstyrret.
Merk: Organoids vil legge til cellekultur plate og ekspandere i 2D. Elektronmikroskopi har vist at den apikale side av cellene står mediet i brønnen (data ikke vist). - Før infeksjon, utveksle alle medium inkludert kjeller matrise, for å tillate bakterier for å feste seg til cellene. En tilsvarende protokoll er også blitt beskrevet for infeksjon med H. pylori 14. 2D cellelag kan inneholde ikke alle celletyper som er tilstede i 3D organoids.
- Seed i 5 brønner på en 24 brønners plate med 500 mL per brønn. Endre medium 3 ganger i uken, med nøye erstatte de øverste 400 mL bare, for å holde kjelleren matrise på bunnen av tallerkenen uforstyrret.
3. Mikroinjeksjon av Organoid Culture.
Merk: Denne protokollen kan brukes til å microinject bakterier inn organoids. Det kan være nyttig å starte injeksjon med organoidssom er mer ettergivende til mikroinjeksjon. For eksempel kan mus mage organoids vokse til svært store cystisk organoids som er lette å målrette.
- Utarbeidelse av Material
- Trekk et glass kapillær i to kanyler ved hjelp av en mikropipette avtrekker, i henhold til produsentens anbefaling. Mikropipette avtrekker vil varme glasskapillær i midten, og vil trekke kapillaren i to deler, for derved å generere to glass nåler. Det er praktisk å trekke flere nåler og lagre dem i en ren petriskål.
- Å tillate bakteriell infeksjon, fjerne antibiotika fra alle medier i minst 3 middels endringer (= en uke). Dette vil utvanne antibiotika fra kjelleren matrise. Hvis du bruker en bakteriestamme som er motstandsdyktig mot et spesifikt antibiotika, legge denne spesifikke antibiotika for å redusere sjansene for forurensning.
- Forberede arbeidsbenk for microinjections. For arbeid på ulike biologisk nivåer kan det være nødvendig å plassere en stereomikroskop inne i en steril benk. I denne protokollen, injisere H. pylori henhold biosikkerhetsnivå 2 forholdene under en stereo inne i en steril benk.
- Kultur bakteriene i henhold til standard protokoller 13,23.
- For å estimere infeksjonsmultiplisitet (MOI), estimere to parametre: Antall bakterier og antallet celler pr organoid som beskrevet nedenfor. MOI kan korrelere med resultater, for eksempel med verter IL-8-mRNA-ekspresjon 13.
- For å beregne den bakterietettheten i infeksjonen oppløsning, først etablere en standardkurve for optisk tetthet-enheter og kolonidannende (CFU) i henhold til standard protokoller 24. En optisk tetthet på 0,1 ved 550 nm bør gi omtrent 10 7 cfu / ml.
- For å beregne antall celler per organoid, telle antall organoids i en godt. Forstyrre organoids som beskrevet i trinn 2.2.1-2.2.4. Etter sentrifugering i 5 minutter ved 200 xg og 4 ° C,tilsett 1 ml enzymatisk dissosiasjon løsning og resuspender.
- Inkuber ved 37 ° C med gjentatt risting i 5-10 min. Finn ut om cellene har dissosiert til enkeltceller i mikroskop (invertert mikroskop som Leica DMIL på 10X forstørrelse). Om nødvendig forlenge inkubasjon.
- Antall celler per organoid ved hjelp av et hemocytometer og beregne antall celler pr organoid. Humane gastriske organoids med en diameter på omkring 200 mikrometer har omtrent 4000 celler. Injeksjon av 0,2 mL av en bakteriell løsning med 1 x 10 9 bakterier per ml fører til en omtrent MOI på 50.
- Injeksjon av Organoids.
Merk: For mikroinjeksjon, er glasset nål stabilisert seg i en holder, som kan manøvreres i 3 dimensjoner av en micromanipulator. Organoids forblir i kjelleren matrisen inne i brønnen. På grunn av størrelse og plassering i brønnen, ikke alle er like en organoidsmENABLE til injeksjon. Vanligvis kan de 30 største organoids i ett godt være målrettet i 5 min.- Høste bakterier og vaske dem i basal medium i henhold til standard protokoller 24.
- Beregn det antall bakterier per ml i henhold til den optiske tetthet (se trinn 3.1.5.1). Fortynne bakterier til 1 x 10 9 bakterier per ml i basal medium.
- Ta et glass nål. Ved hjelp av pinsett bryter spissen slik at åpningen vil være ca 10 um bred.
- Sett nålen inn i injeksjonsholderen og fest den til mikromanipluatoren.
- Ta opp ca 10 mL bakteriell løsning inn nålen.
- Plasser en fire godt plate med lave kanter inneholder organoid kulturer under stereomikroskop.
- Navigere med mikromanipluatoren, målrette en enkelt organoids med nålen. Plasser nålen nær organoid og deretter sette nålen i organoid med en rask bevegelse. Injisere approximately 0,2 mL bakteriell løsning i hver organoid bruker microinjector.
- Høste Organoids for enhver analyse.
- Som eksempel fikse organoids etter fire timer. Fjern supernatant og tilsett 1 ml 2% formaldehyd og inkuber i 20 minutter ved RT, eller O / N ved 4 ° C. Organoids kan behandles for immunhistokjemi i henhold til standardprosedyrer 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen tillater isolering av mage kjertler (figur 2). Kjertler blir sådd ut i kjelleren matrise, som størkner som slipp inne i en brønn, noe som gir et 3-dimensjonalt rammeverk rik på laminin og kollagen for å tillate kjertlene vokse inn i organoids (figur 3). Organoids vanligvis starter så små cyster, og i løpet av 12-16 dager, utvider de til kuler med en diameter på 50-300 um (figur 4). Noen organoids vil bli cystisk, noen vil utvikle små buddings. Sistnevnte er vanligvis et tegn på en sunn voksende kultur. I denne protokollen en brønn av en 24 brønns plate anvendes til 100 kjertler, 50 ul kjeller matrise og 500 ul av medium. Men dette kan være opp- eller nedskalert.
Suksessen til mikroinjeksjon kan lett observeres under stereomikroskop som skyet, bakteriell løsning fyller organoid (Figur 5). Etter tilstrekkelig inkubasjonstid, organoids kanbearbeides til en hvilken som helst analysemetode som ønskes. For eksempel kan organoids bli innleiret i parafin, kan seksjoner kuttes og farges ved hjelp av standard teknikker immunhistokjemi. Mikroskopisk analyse av immunfarget organoids viser vellykket injeksjon av bakterier (figur 6).
Figur 1. Bilde av Pasteur pipette anvendes for passasje av organoids. I hvert panel, er den øvre pipette før den nedre pipetten etter innsnevring av brann. Skala i øvre og høyre panel er cm og mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representant bilde av isolerte menneskelige mage kjertler. Scale bar 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Scheme av brønner og representativt bilde av menneskelige mage organoids. Isolerte menneskelige mage kjertler ble utlevert i kjelleren matrise og plassert som dråper i brønner på en 24 brønners plate. Nedre venstre: Oversikt over et representativt vel 11 dager etter såing. Nedre høyre: Utvidelse av det angitte området. Scale bar 100 mikrometer. Gastric muse organoids utvide raskere 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4 "src =" / filer / ftp_upload / 53359 / 53359fig4.jpg "/>
Figur 4. Typisk veksten av humane gastriske organoids. Kjertler ble sådd inn i kjelleren matriks og bilder av den samme organoid ble tatt over en periode på 12 dager. Scale bar 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Mikroinjeksjon av mage organoids. Stereoskop bilder av en gastric organoid før (venstre) og under (høyre) mikroinjeksjon av bakterier inn i lumen. Bakterier er synlig som sky inne i organoid. Scale bar 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. immunostained organoids. Menneske mage organoids ble mikroinjisert med H. pylori. Etter 4 timer ble organoids fiksert i paraformaldehyd og innstøpt i parafin. Snittene ble farget med antistoffer rettet mot bakterielle protein Cytotoksisitet forbundet gen A (CagA) i henhold til standard histologiske metoder 25. Øverst til venstre: Bilde av en representant organoid. Nedre panel: Høyere forstørrelse av eske området. Øvre høyre. Høyere forstørrelse av eske med en enkelt bakterie nær epitelcellene Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
References
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
- Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
- Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
- Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
- Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
- Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
- McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
- Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
- Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
- Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
- Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
- Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
- Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
