Introduction
Die Studie von Erregern beruht auf adäquate Modellsysteme, um die in vivo-Infektion nachahmen. Bei einigen Infektionserreger, sind adäquate Modellsystemen fehlt, während einige der verwendeten Systeme sind alles andere als optimal. Ein Beispiel ist der Magen-Bakterium Helicobacter pylori (H. pylori), die ursächlich für die Entwicklung von Magenkrebs in Beziehung steht. Doch in Ermangelung eines geeigneteren Zellkultursystem, viele Studien, die darauf abzielen, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Krebsentstehung Verwendung Krebszelllinien, die den Endpunkt der Krebskaskade darstellen zu analysieren. Primäre, nicht-transformierten Zellen wäre ein besseres Modell für diese Studien. Jedoch sind primäre Zellen, die nur von einer kleinen Anzahl von Gebern zur Verfügung und können nicht über längere Zeit kultiviert werden. In den letzten Jahren hat die Stammzellenforschung große Fortschritte gemacht, um neue Quellen für primäre Zellkulturen für die Untersuchung von Infektionsbiologie liefern.
Kulturen ausdrei Stammzellquellen verwendet: Embryonale Stammzellen (ESC), induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) oder adulten Stammzellen. Sie sind verwendet worden, um Infektionen mit Viren, wie Cytomegalovirus 1,2 oder Hepatitis C Virus modellieren 3-7, Parasiten wie Plasmodium falciparum 8 oder Toxoplasma gondii 9 und Bakterien, wie Bacterioides thetaiotaomicron 10 oder Salmonella ente 11. In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze veröffentlicht worden, um eine Infektion mit H. modellieren pylori mit Organoide von ESC oder iPS-Zellen 12, Maus adulten Stammzellen 21,22 oder menschlichen adulten Stammzellen abgeleiteten 13 - 15.
Die Entwicklung von organoiden Kulturen aus adulten Stammzellen stammen aus einer Studie, in der einzelne Stammzellen aus murinen Darmepithel isoliert wurden in eine 3-dimensionale Matrix ausgesät undin Medium, das die Umgebung des Darmstammzellen enthalten EGF mitogen, R-spondin nachgeahmt Wnt-Signalisierung und Noggin zu verbessern, um Knochenmorphogeneseprotein (BMP) Signalisierungs 16 hemmen eingebettet. Insbesondere diese Kulturen erfordern keine Co-Kultur mit mesenchymalen Zellen. Unter diesen Bedingungen ist die Stammzellen proliferieren und bilden kleine Strukturen mit Domänen tragende Zellen der Darmkrypten und Domänen, die die Zellen der intestinalen Zotten enthalten. Die Organoide somit selbst zu organisieren, um die in vivo-Situation nachahmt. Heute adulten Stammzellen aus vielen murinen und humanen Geweben kann in vitro und angebaut werden Selbstorganisation Organoide, die ihre in-vivo-Gegenstück, ähnlich wie Dünn- und Dickdarms 17, Magen 13,18, 19,20 Leber, Bauchspeicheldrüse 21 und Prostata 22.
Hier bieten wir ein Video-Protokoll zur Kultur Maus oder menschlichen Magen Organoide von adulten Stammzellen cells und microinject sie mit H. pylori. Dieses Protokoll basiert auf früheren Berichten 13,18 berechnet. Diese Methode kann für die Kultivierung und infizieren andere organoide Kulturen wie Darm Organoide angepasst werden.
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Protocol
1. Gründung von Magen Organoide Kultur
Hinweis: Dieses Protokoll kann für die Isolierung von Magendrüsen von Maus oder menschlichem Gewebe verwendet werden. Es wird empfohlen, um Gewebe von ca. 1 cm² zu verwenden. Menschlichem Gewebe kann von Magen-Resektionen oder Biopsien erhalten werden.
- Materialzubereitung
Hinweis: Die verwendeten Keller Matrix Matrigel. Halten Sie das Untergeschoss Matrix auf Eis zu allen Zeiten. Bewahren Sie die Keller-Matrix bei -20 ° C und Auftauen auf Eis vor der Verwendung. Grundmedium bezieht sich auf erweiterte DMEM / F12 mit HEPES; eine geeignete Glutaminquelle wie Glutamax und geeignete Antibiotika wie 1x Primocin. Das verwendete Inkubator ist ein Standard-Zellkulturbrutschrank (37 ° C, befeuchteten Atmosphäre, 5% CO 2)- Sterilisieren Vorbereitung Utensilien durch Autoklavieren oder mit 100% Isopropylalkohol: scharfen Zangen, Scheren, ein Skalpell und ein Glas-Mikroskopie Objektträger.
- Am Tag vor der Trennung, legen Sie einen 24 well Zellkultur-Platte in den Inkubator.
- Bereiten Sie den Keller Matrix nach Herstellerempfehlung. Bereiten Aliquots von 1 ml bis Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.
- Bereiten Sie 500 ml chelatisierende Puffer und kühl auf Eis. Vorbereitung 1x Puffer aus sterilem destilliertem Wasser mit 5,6 mM Na 2 HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM Saccharose, 54,9 mM D-Sorbitol, 0,5 mM DL-Dithiothreit (Vorsicht), pH 7. Wenn die Planung mehrere Isolierungen, bereiten ein 5-fach konzentrierte Lösung ohne die DL-Dithiothreitol. Sterilfilter der Puffer. Vor der Isolierung, verdünnen das 5x Puffer mit sterilem Wasser auf 1x und fügen DL-Dithiothreitol kurz vor Isolation.
- Vorbereiten und verdünnen alle Wachstumsfaktoren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Verwenden Sie kleine Teilmengen und vermeiden Frost-Tau-Zyklen. Functional Wachstumsfaktoren sind von entscheidender Bedeutung für die Ergebnisse.
- Coole Basismedium auf Eis und kühlen die Zentrifuge bis 46; C.
- Erwärmen weiteres Aliquot Basalmedium auf 37 ° C.
- Isolierung von Drüsen
- Sammeln Sie ca. 1 cm² des Gewebes in eiskaltem Grundmedium. Halten Sie auf Eis, bis Vorbereitung. Während es bevorzugt ist, Gewebe so schnell wie möglich zu verarbeiten, zu speichern Gewebe Medium auf Eis, wenn nötig.
- Legen Sie das Gewebe in einer 10 cm Petrischale und decken Sie es mit kaltem 1x Chelat-Puffer. Durch leichtes hin und her zu waschen.
- Legen Sie das Gewebe in einem trockenen 10 cm Petrischale. Mit einer Pinzette, entfernen Sie vorsichtig den Schleim als auch die Muskelschicht unter einem Stereomikroskop. Durch leichtes Hin- und Herbe Waschen Sie das Gewebe in kaltem 1x chelatbildenden Puffer.
- Zeigen 1 cm 2 Gewebe auf einem neuen, trockenen 10 cm Petrischale. Mit einer Schere schneiden Sie es in 20-50 kleine Stücke von etwa 2-5 mm² groß.
- Mit einer Pinzette, legen Sie alle Teile in einen 50-ml-Tube.
- Nehmen Sie eine sterile 10 ml Plastikpipette. Befeuchten Sie die Pipette in 1x chelatbildenden Puffer. Behaltenmit dem gleichen Pipette während des gesamten Verfahrens.
- 10 ml kaltem 1x chelatbildenden Puffer in die 50-ml-Tube. Durch kräftiges und Abpipettieren 10 Mal Waschen der Stücke. Lassen Sie die Stücke zu begleichen. Entfernen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie waschen (Schritt 1.2.7), bis der Überstand klar ist. Dies dauert ca. 50 bis 100 ml 1x chelatbildenden Puffer für 1 cm² des menschlichen Gewebes.
- Die Gewebestücke in 20 ml 1x chelatbildenden Puffer mit 10 mM EDTA ergänzt bei RT für 10 min unter leichtem Invertieren jedes 2 min inkubiert.
Hinweis: Zeit und Temperatur dieser Inkubation kann entweder für Geschwindigkeit und / oder Konservierung von Drüsenarchitektur optimiert werden. Sie können von mehreren Stunden Inkubation bei 4 ° C auf einer rollenden Plattform bis 5 min bei 37 ° C in einem Schüttler mit 200 Umdrehungen pro Minute liegen. Gute Ausgangspunkte für Maus Magen sind 30 min bei 4 ° C auf einer rollenden Plattform und für den menschlichen Magen, 10 min bei RT. - Pipette einmal sanft nach oben und unten mit der 10 ml Pipette. Lassen Sie die piECES zu begleichen. Überstand verwerfen.
- Verwenden der Pipette die Stücke in einen sauberen 10 cm Petrischale. Entfernen Sie die Flüssigkeit.
- Stellen Sie ein Glas Mikroskopie Objektträger auf der Oberseite der Gewebestücke. Beachten Sie die intakte Gewebe unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung.
- Druck auf die Glasobjektträger und Petrischale. Halten Sie beide in der Hand (mit sterilen Handschuhen) und Drücken Sie das Glas mit dem Daumen. Der Rand des Gewebes wird bewölkt angezeigt, dass Drüsen werden aus dem Gewebe freigesetzt.
- Beachten Sie die Freigabe Drüsen unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung.
- Sammeln Drüsen und Gewebe in 30 ml kaltem Grundmedium. Lassen Sie große Gewebestücke zu begleichen.
- Sammeln Sie den Überstand, der Drüsen in zwei 15-ml-Röhrchen.
- Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C. Überstand verwerfen. Das Pellet enthält isolierten Drüsen. Halten Sie sie auf Eis.
- Seeding der Drüsen
- Alternative 1: Seed 6 Vertiefungen einer Verdünnungsreihe.
- Hängen Sie das Pellet in 60 ul Keller Matrix.
- Bereiten 5 sterile 1,5-ml-Röhrchen auf Eis mit jeweils 50 & mgr; l aus Keller Matrix. Transfer 10 ul Drüsen / Keller Matrix Suspension in den ersten 1,5-ml-Tube. Suspend die Drüsen und Transfer 10 ul dieser Lösung auf den nächsten 1,5 ml-Tube. Wiederholen Sie für die nächsten Rohre.
- Alternative 2: Pflanzensamen eine berechnete Menge Drüsen pro Vertiefung. Beginnen Sie mit 100 Verschraubungen pro 50 ul Keller Matrix in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- Die pelletierten Drüsen in 10 ml Grundmedium vorsichtig suspendieren. Zeigen 50 ul auf ein sauberes 10 ml Petrischale. Count Anzahl der Drüsen unter einem inversen Mikroskop für die Zellkultur mit 10-facher Vergrößerung.
- Berechnen der Konzentration der Drüsen in der Lösung. Übertragen Sie das Volume, contaIns 400 Drüsen auf ein neues 15-ml-Tube.
- Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C. Überstand verwerfen und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Fügen Sie 200 ul Keller Matrix und sorgfältig resuspendieren. Halten Sie auf dem Eis.
- Nehmen Sie die 37 ° C warme 24-Well-Platte (siehe Schritt 1.1.2) aus dem Inkubator. Geben Sie einen Tropfen von 50 ul Drüsen im Keller Matrix in der Mitte des Brunnens. Der Tropfen wird eine Kuppel bilden.
- Die Platte vorsichtig Transfer zurück zum Zellkulturbrutschrank. Lassen Sie den Keller Matrix verfestigen 10 min.
- Bereiten warmen Medium bei allen Wachstumsfaktoren.
- Menschennieren: Ergänzen Sie den Basismedium mit den folgenden Wachstumsfaktoren für menschliche Magen Organoide: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditionierten Medium, 10% R-spondin1-konditionierten Medium, 50% Wnt-konditionierten Medium, 200 ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 10, 1 nM Gastrin und 2 uM TGFbeta-Hemmer sowie 10 uM rho-assoziierten Coiled-Coil-bildendes Protein-Serin / Threonin-Kinase Inhibitor (RHOKi).
- Für murine Drüsen: Ergänzen Sie den Basismedium mit den folgenden Wachstumsfaktoren für Maus Magen Organoide: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditionierten Medium, 10% R-spondin1-konditionierten Medium, 50% Wnt-konditionierten Medium, 100 ng / FGF10 ml, 10 nM Gastrin, 0,5 mM TGFbeta-Hemmer sowie 10 uM RHOKi.
- Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. 500 & mgr; l Medium bei allen Wachstumsfaktoren (1.3.6) zu jedem Vorsichtig gut ohne den Keller Matrix zu stören. Setzen Sie ihn wieder in den Inkubator.
- Aktualisieren Sie die Medium 3 mal pro Woche (alle 2-3 Tage). Für erfrischende Medium, entfernen Sie das alte Medium mit dem Verlassen des Tropfen Keller Matrix intakt. Vorsichtig frischen, warmen Medium bei allen Wachstumsfaktoren. Sie RHOKi hinzufügen nicht. RHOKi nur direkt nach dem Aussäen von Drüsen oder nach der Aufspaltung der Organoide (Schritt 2) hinzuzufügen.
2. Durchgang des Magen Organoide Kultur Vor Mikroinjektion.
ove_content "> Hinweis: Jede Art von organoiden Kultur hat ihre eigenen Verdopplungszeit Maus Darm sowie Magen-Kulturen in der Regel aufgeteilt werden. 1: 5 alle 5-7 Tage menschlichen Darm-Kulturen sind gespalten. 1:. 5 alle 10-12 Tage Menschliche Magen-Kulturen werden im Verhältnis 1: 5 alle 14 Tage Wenn aus einzelnen Zellen initiiert, kann menschlichen Magen Organoide auch nehmen 20 Tage, um richtig zu bilden, ist es ein gutes Zeichen, wenn angehende Strukturen umgeben die zentrale Lumen In diesem Protokoll Organoide sind gespalten... 4-Well-Platten für die Mikroinjektion. Wartung Organoide folgt das gleiche Protokoll, kann aber andere Zellkulturplatte, wie Standard-24-Well-Zellkulturplatten zu verwenden.- Materialzubereitung
- Autoklaven Pasteurpipetten.
- Am Tag vor der Passage, legen Sie ein 4 well Zellkulturplatte im Brutschrank bei 37 ° C. Die 4-Well-Platten haben eine geringe Kanten und ermöglichen Mikromanipulation.
- Bereiten Sie den Keller Matrix nach Herstellerempfehlung. Am Tag der passaging, tauen Keller Matrix auf Eis.
- Vorbereiten und verdünnen alle Wachstumsfaktoren entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.
- Kühlen Basalmedium auf Eis und kühlen die Zentrifuge auf 4 ° C.
- Durchgang von Organoide Kulturen
- Nehmen Sie die Platte mit den Organoide aus dem Inkubator. Entfernen Sie Medium aus einem gut.
- 1 ml kaltem Basalmedium zum Keller Matrix in dem Bohrloch. Unter Verwendung einer 1 ml-Mikropipette, kräftig pipettieren nach oben und unten, bis der Keller-Matrix aufgebrochen. Transfer zu einem 15-ml-Tube. Auf Eis stellen.
- Nehmen Sie ein Glas Pasteurpipette und eine Feuerquelle, wie zB einem Bunsenbrenner.
- Halten Sie die Spitze der Pipette in das Feuer, bis die Öffnung der Spitze von 1,5 mm bis etwa 0,5 mm (Abbildung 1) verengt. Lassen Sie die Pipette auf RT abkühlen.
- Befeuchten Sie die Pipette in Grundmedium. Ein optimal verengt Pipetten dauern wird, bis das Medium sichtbar langsamer als ein nicht-verengten Pipette, aber es wird immer noch alleow Pipettieren gut.
- Nehmen Sie Organoide in der Pipette und kräftig pipettieren 10x auf und ab. Das Brechen der Organoide mit dem Auge beobachtet werden.
- Hinzufügen 9 ml kaltem Basalmedium und Zentrifuge 5 min bei 200 × g und 4 ° C.
- Vorsichtig verwerfen alle Überstand. Hängen Sie das Pellet in 250 ul Keller Matrix. Halten Sie auf dem Eis.
- Nehmen Sie die 37 ° C warme 4 Well-Kulturplatte und einen Tropfen von 50 ul Organoide / Keller Matrix in jeder Vertiefung.
- Übertragen Sie die Platte vorsichtig zurück in den Inkubator. Lassen Sie den Keller Matrix erstarren bei 37 ° C für 10 min.
- Bereiten geeigneten Medium entweder Maus oder Mensch Organoide wie in Schritt 1.3.6 aufgeführt.
- Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und überlagern Keller Matrix Tropfen mit 500 ul Medium.
- Übertragen Sie die Platte in den Inkubator.
- Aktualisieren Sie das Medium 3 mal pro Woche alle 2-3 Tage (siehe 1.3.8.).
- Für das Einfrieren von Organoide, mechantisch stören Organoide wie für die Spaltung in diesem Protokoll beschrieben (Schritte 2.2.1-2.2.5.). Suspendieren die organoiden Fragmente in 500 ml Gefriermedium und frieren bis -80 ° C unter Verwendung von Kryoröhrchen und eines Gefrierbehälters. Für langfristige Lagerung, übertragen Sie die Röhrchen in flüssigen Stickstoff.
- Zum Auftauen von Organoide, bereiten die Kulturplatte, Keller Matrix, Wachstumsfaktoren, kalte und warme Medium wie in den Schritten 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7 beschrieben. Wärmen Sie das gefrorene Fläschchen mit einem Wasserbad, und Transfer Zellen unmittelbar nach dem Auftauen zu einem 15-ml-Röhrchen mit 10 ml kaltem Grundmedium. Zentrifuge und die Platte, die Zellen wie in 2.2.5 bis 2.2.12 beschrieben.
Hinweis: Mikroinjektion von Organoide ist mühsam, aber erlaubt die einzigartige Möglichkeit, die Interaktion in 3D zu studieren. - Wenn 3D-Studien nicht benötigt werden, Saatgut Organoide in zwei Dimensionen. Dafür stören die Organoide wie in Schritten 2.2.1 bis 2.2.6 festgelegt. In 2250 ul kalten Medium bei allen Wachstumsfaktoren, um 250 ul Keller matrix mit organoiden Fragmente.
- Seed in 5 Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 500 ul pro Vertiefung. Medium ändern 3 mal pro Woche, mit sorgfältig nur das Ersetzen der oberen 400 ul, in den Keller-Matrix an der Unterseite der Platte ungestört zu halten.
Anmerkung: Organoide wird der Zellkulturplatte zu befestigen und in 2D zu erweitern. Elektronenmikroskopie zeigte, daß die apikale Seite der Zellen Flächen des Mediums in der Vertiefung (Daten nicht gezeigt). - Vor der Infektion, tauschen alle Medium einschließlich Keller Matrix, damit Bakterien an die Zellen anzuhängen. Ein ähnliches Protokoll wurde auch für eine Infektion mit H. beschrieben worden pylori 14. 2D Zellschichten möglicherweise nicht alle Zelltypen, die in 3D Organoiden vorhanden sind, enthalten.
- Seed in 5 Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 500 ul pro Vertiefung. Medium ändern 3 mal pro Woche, mit sorgfältig nur das Ersetzen der oberen 400 ul, in den Keller-Matrix an der Unterseite der Platte ungestört zu halten.
3. Mikroinjektion von Organoide Kultur.
Hinweis: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bakterien in Organoiden microinject werden. Es kann hilfreich sein, um die Injektion mit Organoide startendie mehr permissive, um die Mikroinjektion sind. So kann beispielsweise der Maus Magen Organoide in sehr großen zystischen Organoide, die einfach zu zielen sind zu wachsen.
- Materialzubereitung
- Ziehen Sie eine Glaskapillare in zwei Injektionsnadeln mit einer Mikropipette Puller, entsprechend der Empfehlung des Herstellers. Die Mikropipette Abzieher wird das Glaskapillare in der Mitte zu erwärmen und wird die Kapillare in zwei Teile zu ziehen, wodurch zwei Glasnadeln. Es ist praktisch, mehrere Nadeln ziehen und speichern sie in einer sauberen Petrischale.
- Auf eine bakterielle Infektion zu ermöglichen, entfernen Sie die Antibiotika aus allen Medien für mindestens 3 mittel Veränderungen (= 1 Woche). Dies wird Antibiotika aus Keller Matrix zu verdünnen. Bei Verwendung eines Bakterienstammes, die resistent gegen ein bestimmtes Antibiotikum, fügen Sie diesen spezifischen Antibiotikum, um Chancen für die Kontamination zu minimieren.
- Bereiten Sie den Arbeitstisch für Mikroinjektionen. Für die Arbeit an verschiedenen biologischen Sicherheitsstufen kann es notwendig sein, um eine Stereo platzierenMikroskop in einer Sterilbank. In diesem Protokoll injizieren H. pylori unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen, unter einem Stereomikroskop in einer Sterilbank.
- Kultur die Bakterien nach Standardprotokollen 13,23.
- Um die Multiplizität der Infektion (MOI) zu schätzen, schätzen, zwei Parameter: die Anzahl der Bakterien und die Anzahl der Zellen pro organoiden wie unten beschrieben. Das Innenministerium kann mit den Ergebnissen zu korrelieren, beispielsweise mit Gastgeber IL-8-mRNA-Expression 13.
- Um die Bakteriendichte in der Infektionslösung zu berechnen, zuerst anhand einer Standardkurve der optischen Dichte und der koloniebildenden Einheiten (CFU) nach Standardprotokollen 24. Eine optische Dichte von 0,1 bei 550 nm sollte bei etwa 10 7 CFU / ml zu ergeben.
- Um die Anzahl der Zellen pro organoiden schätzen, zählen Anzahl von Organoide in 1 gut. Disrupt Organoide wie in den Schritten umrissen 2.2.1-2.2.4. Nach Zentrifugation 5 Minuten lang bei 200 × g und 4 ° C,1 ml enzymatische Dissoziationslösung und resuspendieren.
- Inkubieren bei 37 ° C unter mehrmaliges Schütteln für 5-10 min. Bestimmen, ob die Zellen in einzelne Zellen unter dem Mikroskop (inverses Mikroskop wie Leica DMIL bei 10-facher Vergrößerung) dissoziiert. Bei Bedarf verlängern die Inkubationszeit.
- Graf Zellen pro organoiden mit einer Zählkammer und berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro organoiden. Menschlichen Magen Organoide mit einem Durchmesser von etwa 200 um in etwa 4.000-Zellen. Injektion von 0,2 ul einer Bakterienlösung mit 1 x 10 9 Bakterien pro ml zu einer ungefähren MOI von 50.
- Die Injektion von Organoide.
Anmerkung: Für die Mikroinjektion wird die Glas Nadel in einem Halter, der in 3 Dimensionen durch einen Mikromanipulator manövriert werden kann stabilisiert. Organoide bleiben im Keller Matrix innerhalb des Bohrlochs. Abhängig von der Größe und Positionierung in der gut, nicht alle sind gleichermaßen Organoide einmEnable zur Injektion. In der Regel lassen sich die 30 größten Organoide in einem gut in 5 min ausgerichtet sein.- Ernte-Bakterien und waschen Sie sie in Basismedium nach Standardprotokollen 24.
- Berechnung der Anzahl der Bakterien pro ml nach der optischen Dichte (siehe Schritt 3.1.5.1). Verdünnen der Bakterien bis 1 x 10 9 Bakterien pro ml in Basalmedium.
- Nehmen Sie ein Glas Nadel. Mit einer Pinzette brechen Sie die Spitze, so dass die Öffnung ungefähr 10 & mgr; m breit sein.
- Führen Sie die Nadel in die Injektionshalter und fixieren Sie sie mit dem Mikromanipulator.
- Nehmen Sie etwa 10 & mgr; l Bakterienlösung in die Nadel.
- Legen Sie eine 4-Well-Platte mit niedrigen Kanten enthält organoide Kulturen unter dem Stereomikroskop.
- Navigieren mit dem Mikromanipulator, gezielt eine einzelne Organoide mit der Nadel. Positionieren Sie die Nadel in der Nähe des organoiden und legen Sie die Nadel in die organoiden mit einer schnellen Bewegung. Injizieren approximately 0,2 ul Bakterienlösung in jede organoiden mit der Mikroinjektor.
- Ernte Organoide für jede Analyse.
- Wie beispielsweise zu beheben Organoide nach 4 h. Überstand entfernen und 1 ml 2% Formaldehyd und Inkubation 20 min bei RT oder O / N bei 4 ° C. Organoide kann für die Immunhistochemie nach Standardverfahren 25 verarbeitet werden.
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Representative Results
Dieses Protokoll erlaubt Isolierung von Magendrüsen (Abbildung 2). Drüsen in Keller-Matrix, die als Tropfen aus dem gut verfestigt, wodurch eine 3-dimensionale Rahmen reich an Laminin und Kollagen, damit die Drüsen wachsen zu Organoiden (Figur 3) angeimpft. Organoide beginnen in der Regel als kleine Zysten und innerhalb von 12-16 Tage, zu Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 300 & mgr; m (Abbildung 4) erweitern Sie sie. Einige Organoide wird zystische bleiben, werden einige kleine buddings zu entwickeln. Letzteres ist in der Regel ein Zeichen für eine gesunde wachsende Kultur. In diesem Protokoll wird für 100 Drüsen, 50 ul Keller Matrix und 500 ul Medium eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen verwendet. Dies kann jedoch nach oben oder verkleinert werden.
Der Erfolg der Mikroinjektion kann leicht unter dem Stereomikroskop beobachtet werden, wie die trübe, Bakterienlösung füllt die organoiden (Abbildung 5). Nach ausreichender Inkubationszeit kann Organoidefür einen beliebigen Analyseverfahren bearbeitet werden. Beispielsweise kann Organoiden in Paraffin eingebettet werden können Abschnitte geschnitten und gefärbt unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden Immunhistochemie. Mikroskopische Analyse von immun Organoiden demonstrieren erfolgreiche Injektion der Bakterien (Figur 6).
Abbildung 1. Foto des für den Durchgang Organoide verwendet Pasteurpipette. In jeder Platte ist die obere Pipette vor, die untere Pipette nach der Einengung durch Feuer. Maßstab in der oberen und rechten Fensterbereich ist cm und mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Representative Bild von isolierten menschlichen Magendrüsen. Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 Schema der Vertiefungen und für Bild des menschlichen Magen Organoiden. Isolierte menschliche Magendrüsen wurden im Keller Matrix verteilt und in Form von Tropfen in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben. Unten links: Übersicht eines Vertreters auch 11 Tage nach der Aussaat. Unten rechts: Die Erweiterung der angegebenen Stelle. Maßstabsleiste 100 um. Magen-Maus Organoide erweitern schneller 18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4. Typische Wachstum von menschlichen Magen Organoide. Drüsen wurden in Keller Matrix und Bilder der gleichen organoiden ausgesät wurden über einen Zeitraum von 12 Tagen übernommen. Maßstabsleiste 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5. Die Mikroinjektion von Magen Organoiden. Stereoskop-Bilder eines Magen organoiden vor (links) und während der (rechte) Mikroinjektion von Bakterien in das Lumen. Bakterien sind als Cloud innerhalb der organoiden sichtbar. Maßstabsleiste 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Immungefärbte Organoide. Menschlichen Magen Organoide wurden mit H. mikroinjiziert pylori. Nach 4 h wurden Organoiden in Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden unter Verwendung von Antikörpern gegen die Bakterienprotein-Zytotoxizität assoziierten Gens A (CagA) nach Standardmethoden der Histologie 25 gefärbt. Oben links: Bild eines repräsentativen organoiden. Unten: Höhere Vergrößerung des eingerahmten Bereich. Oben rechts:. Stärkere Vergrößerung des eingerahmten Bereich mit einem einzigen Bakterium in der Nähe der Epithelzellen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
References
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- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
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- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
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