Introduction
Studiet av patogener bygger på lämpliga modellsystem för att efterlikna in vivo infektion. För vissa smittämnen, är lämpliga modellsystem saknas medan vissa av de använda systemen är långt ifrån optimal. Ett exempel är den gastriska bakterien Helicobacter pylori (H. pylori), som kausalt relaterad till utveckling av magcancer. Men i avsaknad av en mer lämplig cellodlingssystem, många studier som syftar analysera de molekylära mekanismerna bakom cancerutveckling användning cancercellinjer, som representerar slutpunkten för cancer kaskaden. Primära, icke-transformerade celler skulle vara en bättre modell för dessa studier. Men primära celler är endast tillgängliga från ett litet antal givare och kan inte odlas över längre tidsperioder. Under de senaste åren har stamcellsforskning gjort betydande framsteg för att ge nya källor för primära cellkulturer för studiet av infektionsbiologi.
Kulturer fråntre stamcells källor har använts: Embryonala stamceller (ESC), inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) eller adulta stamceller. De har använts för att modellera infektioner med virus, såsom cytomegalovirus 1,2 eller hepatit C-virus 3-7, parasiter, såsom Plasmodium falciparum 8 eller Toxoplasma gondii 9, och bakterier, såsom Bacterioides thetaiotaomicron 10 eller Salmonella enterica 11. Senast har flera metoder publicerats att modellera infektion med H. pylori med organoids härrör från ESC eller iPS-celler 12, mus adulta stamceller 21,22 eller mänskliga adulta stamceller 13 - 15.
Utvecklingen av organoid kulturer från adulta stamceller härstammar från en studie, i vilken enstaka stamceller som isolerats från murina tarmepitel ympades i en 3-dimensionell matris ochinbäddad i medium som härmade miljön i tarm stamceller innehållande EGF som mitogen, R-spondin att förbättra Wnt-signalering och Noggin att inhibera benmorfogent protein (BMP) signalering 16. Notably dessa kulturer inte kräver samodling med mesenkymala celler. Under dessa förhållanden, stamcellerna proliferera och bilda små strukturer med domäner som härbärgerar celler av tarmkryptorna och domäner som innehåller cellerna i villi. De organoids sålunda själv organisera sig för att efterlikna in vivo situationen. Idag kan adulta stamceller från många murina och humana vävnader odlas in vitro och själv organisera sig i organoids som liknar deras in vivo motsvarighet, såsom tunntarmen och tjocktarmen 17, mage 13,18, lever 19,20, bukspottkörtel 21 och prostata 22.
Här ger vi en video protokoll till kultur mus eller människa gastric organoids från adulta stamceller cells och mikroinjicera dem med H. pylori. Detta protokoll är baserad på tidigare rapporter 13,18. Denna metod kan anpassas för odling och infektera andra organoid kulturer såsom intestinala organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inrättande av Gastric organoida Culture
Notera: Detta protokoll kan användas för isoleringen av gastriska körtlar från mus eller human vävnad. Det rekommenderas att använda vävnad av ca 1 cm. Mänsklig vävnad kan erhållas från gastriska resektioner eller biopsier.
- Framställning av material
Obs: Den använda källaren matrisen är Matrigel. Håll källaren matrisen på is vid alla tidpunkter. Förvara källaren matrisen vid -20 ° C och tina på is före användning. Bassubstratets hänvisar till Avancerad DMEM / F12 kompletterat med HEPES; en lämplig glutamin källa, såsom Glutamax och lämpliga antibiotika såsom 1x Primocin. Inkubatorn används är en standardcellodlingsinkubator (37 ° C, fuktad atmosfär, 5% CO2)- Sterilisera förberedelse redskap genom autoklavering eller använda 100% isopropylalkohol: vassa pincett, sax, en skalpell och ett glas mikroskopi bild.
- Dagen före isolering, placera en 24 well cellodlingsplatta i inkubatorn.
- Förbered källaren matris enligt tillverkarens rekommendation. Förbered alikvoter av 1 ml för att undvika upprepade frysupptiningscykler.
- Förbered 500 ml komplexbildare buffert och cool på is. Bered 1x buffert från sterilt destillerat vatten med 5,6 mM Na 2 HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, 96,2 mM NaCI, 1,6 mM KCI, 43,4 mM sackaros, 54,9 mM D-sorbitol, 0,5 mM DL-ditiotreitol (OBS), pH 7. Om planerar flera isoleringar, förbereda en 5x koncentrerad lösning utan DL-ditiotreitol. Sterilfiltrera bufferten. Före isolering, späd 5x buffert med sterilt vatten till 1x och lägga DL-ditiotreitol strax före isolering.
- Förbered och späd alla tillväxtfaktorer enligt tillverkarens rekommendationer. Använd små stora portioner och undvika frysupptiningscykler. Funktionella tillväxtfaktorer är avgörande för resultatet.
- Cool basalt medium på is och kyla centrifugen 46; C.
- Värm en annan portion av basalmedium till 37 ° C.
- Isolering av körtlar
- Samla ca 1 cm av vävnad i iskallt basalt medium. Håll på is tills förberedelser. Medan det är föredraget att behandla vävnaden så snart som möjligt, lagra vävnad i medium på is vid behov.
- Placera vävnaden i en 10 cm petriskål och täck den med kallt 1x kelering buffert. Tvätta genom att försiktigt flytta fram och tillbaka.
- Placera vävnad i en torr 10 cm petriskål. Använd pincett, försiktigt bort slemmet samt muskellagret under ett stereomikroskop. Tvätta vävnaden i kallt 1x kelatbildande buffert genom att försiktigt flytta fram och tillbaka.
- Placera en cm2 vävnad på en ny, torr 10 cm petriskål. Använda sax skär den i 20-50 små bitar av cirka 2-5 mm storlek.
- Använd pincett, placera alla bitar i en 50 ml rör.
- Ta en steril 10 ml plastpipett. Blöt pipetten i 1x kelatbildande buffert. Hållamed hjälp av samma pipett under hela förfarandet.
- Tillsätt 10 ml kall 1x kelatbildande buffert till 50 ml röret. Tvätta bitarna genom kraftig pipettering upp och ned 10 gånger. Låt bitarna sedimentera. Avlägsna supernatanten.
- Upprepa tvätt (steg 1.2.7) tills supernatanten är klar. Detta tar ungefär 50 till 100 ml 1x kelatbildande buffert under 1 cm av mänsklig vävnad.
- Inkubera vävnaden bitar i 20 ml 1x kelatbildande buffert kompletterad med 10 mM EDTA vid RT under 10 minuter med varsam vända varje 2 min.
Obs: Tid och temperatur av denna inkubation kan optimeras för antingen hastighet och / eller bevarande av körtel arkitektur. De kan variera från flera timmar inkubering vid 4 ° C på en rullplattform till 5 min vid 37 ° C i en skakanordning med 200 varv per minut. Bra utgångspunkter för mus mage är 30 minuter vid 4 ° C på en rullande plattform och för människans mage, 10 min vid RT. - Pipett en gång försiktigt upp och ner med 10 ml pipett. Låt piECES sedimentera. Kasta bort supernatanten.
- Med hjälp av pipett bitarna till en ren 10 cm petriskål. Avlägsna vätskan.
- Placera en glas mikroskopi glida ovanpå vävnaden bitar. Observera intakt vävnad under ett inverterat mikroskop för cellodling med 10x förstoring.
- Pressa på objektglas och petriskål. Håll både i hand (med sterila handskar) och trycka på glaset med tummen. Kanten av vävnaden kommer att visas grumlig, vilket indikerar att körtlar släpps ut ur vävnaden.
- Följ de frigjorda körtlar under ett inverterat mikroskop för cellodling med 10x förstoring.
- Samla körtlar och vävnad i 30 ml kall basalmedium. Låt stora vävnadsfragment lösa.
- Samla upp supernatanten innehållande körtlar i två 15 ml rör.
- Centrifugera 5 minuter vid 200 xg och 4 ° C. Släng supernatanten. Pelleten innehåller isolerade körtlar. Håll dem på is.
- Sådd av körtlar
- Alternativ 1: Seed 6 brunnar i en utspädnings rad.
- Suspendera pelleten i 60 | il källaren matris.
- Förbered 5 sterila 1,5 ml rör på is med vardera innehållande 50 pl källaren matris. Transfer 10 il av körtlar / källaren matris suspension i den första 1,5 ml rör. Suspendera körtlar och överföra 10 fil av denna lösning till nästa 1,5 ml rör. Upprepa för de kommande rören.
- Alternativ 2: Seed en beräknad mängd körtlar per brunn. Börja med 100 körtlar per 50 pl källaren matris i en brunn i en platta med 24 brunnar.
- Försiktigt suspendera pellet körtlar i 10 ml basmedium. Placera 50 ul på en ren 10 ml petriskål. Räkna antal körtlar under ett inverterat mikroskop för cellodling med 10x förstoring.
- Beräkna koncentrationen av körtlar i lösningen. Överför den volym som contains 400 körtlar till en ny 15 ml tub.
- Centrifugera 5 minuter vid 200 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten och hålla röret på is. Tillsätt 200 pl källaren matris och försiktigt resuspendera. Håll på is.
- Ta 37 ° C varmt 24-brunnar (se steg 1.1.2) från inkubatorn. Placera en droppe av 50 ^ körtlar i källaren matris i mitten av brunnen. Nedgången kommer att utgöra en kupol.
- Försiktigt överföra plattan tillbaka till cellodlingsinkubator. Låt källaren matrisen stelna 10 minuter.
- Förbered varmt medium med alla tillväxtfaktorer.
- För humana körtlar: Supplement basalmediet med följande tillväxtfaktorer för humana gastriska organoids: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditionerat medium, 10% R-spondin1-konditionerat medium, 50% Wnt-konditionerat medium, 200 ng / ml fibroblasttillväxtfaktor (FGF) 10, 1 nM gastrin, och 2 pM TGFbeta hämmare och 10 | iM rho associerade tvinnat slingbildande protein serin / treonin-kinas hämmare (RHOKi).
- För murina körtlar: Supplement basalmediet med följande tillväxtfaktorer för mus gastric organoids: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditionerat medium, 10% R-spondin1-konditionerat medium, 50% Wnt-konditionerat medium, 100 ng / ml FGF10, 10 nM gastrin, 0,5 mM TGFbeta inhibitor och 10 pM RHOKi.
- Ta plattan från inkubatorn. Försiktigt 500 l medium med alla tillväxtfaktorer (1.3.6) till varje brunn utan att störa källaren matrisen. Placera den tillbaka till inkubatorn.
- Uppdatera medel 3 gånger i veckan (var 2-3 dagar). För uppfriskande medium, ta bort den gamla medium med lämnar droppe källaren matris intakt. Försiktigt färskt, varmt medium med alla tillväxtfaktorer. Lägg inte till RHOKi. Bara lägga RHOKi direkt efter sådd av körtlar eller efter delning av organoids (steg 2).
2. Passage av Gastric organoida kultur Före mikroinjektion.
ove_content "> Obs: Varje typ av organoid kultur har sin egen fördubbling tid Mus tarm liksom gastric kulturer brukar delas 1:. 5 var 5-7 dagar mänskliga tarm kulturer split 1:.. 5 var 10-12 dagar Human gastric kulturer split 1: 5 var 14 dagar vid uppsägning från enstaka celler, kan mänskliga gastric organoids också ta 20 dagar för att bilda ordentligt Det är ett gott tecken om spirande strukturer omger den centrala lumen I detta protokoll är organoids upp i... 4 brunnsplattor för mikroinjektion. Underhåll av organoids följer samma protokoll, men kan använda någon annan cellodlingsplatta, såsom standard 24 och cellodlingsplattor.- Framställning av material
- Autoklav Pasteur pipetter.
- Dagen före passage, placera en fyra väl cellodlingsplatta i inkubatorn vid 37 ° C. De 4 brunnsplattor har låga kanter och tillåter mikromanipulering.
- Förbered källaren matris enligt tillverkarens rekommendation. På dagen för passaging, tina källaren matris på is.
- Förbered och späd alla tillväxtfaktorer enligt tillverkarens rekommendationer.
- Kyla basalt medium på is och svalka centrifugen till 4 ° C.
- Passage av organoid kulturer
- Ta plattan med organoids från inkubatorn. Ta bort mediet från en brunn.
- Tillsätt 1 ml kall basalmedium till källaren matrisen i brunnen. Med hjälp av en 1 ml mikropipett, kraftfullt pipett upp och ner tills källaren matrisen bryts upp. Överför till en 15 ml rör. Placera på is.
- Ta ett glas pasteurpipett och en brandkälla, såsom en bunsenbrännare.
- Håll spetsen på pipetten i elden tills öppnandet av spetsen har minskat från 1,5 mm till ca 0,5 mm (Figur 1). Låt pipetten svalna till RT.
- Blöt pipetten i basalt medium. En optimalt minskat pipett tar upp mediet synligt långsammare än en icke-minskat pipett, men det kommer fortfarande allaow pipettering väl.
- Ta upp organoids i pipetten och kraftfullt pipett 10x upp och ned. Brytandet av organoids kan observeras med ögat.
- Lägg 9 ml kall basalt medium och centrifugera i 5 minuter vid 200 xg och 4 ° C.
- Försiktigt kassera all supernatant. Suspendera pelleten i 250 ul källaren matris. Håll på is.
- Ta 37 ° C varmt 4 väl odlingsplatta och placera en droppe 50 il organoids / källaren matris i varje brunn.
- Överför försiktigt tillbaka till inkubatorn plattan. Låt källaren matrisen stelna vid 37 ° C under 10 minuter.
- Förbered lämpligt medium för antingen mus eller mänskliga organoids som anges i steg 1.3.6.
- Ta plattan från kuvösen och överlagra varje källaren matris droppe med 500 ul medium.
- Överför plattan till inkubatorn.
- Uppdatera mediet 3 gånger per vecka var 2-3 dagar (se 1.3.8.).
- För frysning av organoids, mechantiskt störa organoids som beskrivits för uppdelning i detta protokoll (steg 2.2.1-2.2.5.). Suspendera organoid fragmenten i 500 ml frysmedium och frysa till -80 ° C med hjälp av cryotubes och en frysning behållare. För långtidsförvaring, överföra rören till flytande kväve.
- För upptining av organoids, förbereda odlingsplatta, källare matris, tillväxtfaktorer, kallt och varmt medium som beskrivs i steg 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Värm den frusna flaskan med hjälp av ett vattenbad, och överföra celler omedelbart efter upptining till en 15 ml rör med 10 ml kall basalmedium. Centrifugera och plattan cellerna som beskrivs i 2.2.5 till 2.2.12.
Anmärkning: Mikroinjektion av organoids är arbetskrävande, men tillåter den unika möjligheten att studera interaktionen i 3D. - Om 3D-studier inte behövs, utsäde organoids i två dimensioner. För detta störa organoids som anges i steg 2.2.1 till 2.2.6. Lägg 2.250 il kall medium med alla tillväxtfaktorer till 250 il källaren matrix med organoid fragment.
- Utsäde i 5 brunnar i en 24-brunnsplatta med 500 | il per brunn. Ändra mediet 3 gånger i veckan, med noggrant ersätter de övre 400 ^ bara, för att hålla källaren matrisen vid bottnen av plattan ostörd.
Obs: Organoids kommer att fästa till cellkulturplatta och expandera i 2D. Elektronmikroskopi har visat att den apikala sidan av cellerna är vänd mot mediet i brunnen (data ej visade). - Före infektion, utbyta all medel inklusive källare matris, att låta bakterier att fästa till cellerna. Ett liknande protokoll har också beskrivits för infektion med H. pylori 14. 2D cellskikt kan innehålla inte alla celltyper som finns i 3D organoids.
- Utsäde i 5 brunnar i en 24-brunnsplatta med 500 | il per brunn. Ändra mediet 3 gånger i veckan, med noggrant ersätter de övre 400 ^ bara, för att hålla källaren matrisen vid bottnen av plattan ostörd.
3. Mikroinjektion av organoida kultur.
Obs: Detta protokoll kan användas för att mikroinjicera bakterier i organoids. Det kan vara till hjälp för att starta injektionen med organoidssom är mer tillåtande för mikroinjektion. Till exempel kan mus mag organoids växa till mycket stora cystisk organoids som är lätta att rikta.
- Framställning av material
- Dra en glaskapillär i två injektionsnålar med hjälp av en mikropipett avdragare, enligt tillverkarens rekommendation. Mikropipett avdragare värmer glaskapillären i mitten och kommer att dra kapillären i två delar och därigenom generera två glasnålar. Det är praktiskt att dra flera nålar och förvara dem i en ren petriskål.
- För att möjliggöra bakterieinfektion, ta bort antibiotika från alla media för minst 3 medel förändringar (= en vecka). Detta kommer att späda antibiotika från källaren matris. Vid användning av en bakteriestam som är resistent mot en specifik antibiotikum, lägga till detta specifika antibiotikum för att minimera chanserna för kontaminering.
- Förbered arbetsbänk för microinjections. För arbete på olika biosäkerhet nivåer kan det vara nödvändigt att placera en stereomikroskop inuti en steril bänk. I detta protokoll, injicera H. pylori i skyddsnivå 2 villkor under ett stereomikroskop i en steril bänk.
- Kultur bakterierna enligt standardprotokoll 13,23.
- För att uppskatta infektionsmultiplicitet (MOI), uppskatta två parametrar: Antalet bakterier och antalet celler per organoid såsom skisseras nedan. MOI kan korrelera med resultat, exempelvis med värdar IL-8-mRNA-expression 13.
- För att beräkna den bakterietäthet i infektionslösningen, först etablera standardkurvan av optisk densitet och kolonibildande enheter (CFU) i enlighet med standardprotokoll 24. En optisk densitet av 0,1 vid 550 nm ska ge cirka 10 7 CFU / ml.
- För att uppskatta antalet celler per organoid, räkna antalet organoids i en brunn. Störa organoids som det beskrivs i steg 2.2.1-2.2.4. Efter centrifugering 5 min vid 200 xg och 4 ° C,tillsätt 1 ml enzymatisk dissociation lösning och återsuspendera.
- Inkubera vid 37 ° C med upprepad skakning under 5-10 minuter. Ta reda på om cellerna har dissocieras till enskilda celler under mikroskop (inverterat mikroskop såsom Leica DMIL vid 10x förstoring). Vid behov förlänga inkubation.
- Räkna celler per organoid med hjälp av en hemocytometer och räkna antalet celler per organoid. Humana gastriska organoids med en diameter av ca 200 | j, m har ca 4000 celler. Injektion av 0,2 ul av en bakterielösning med 1 x 10 9 bakterier per ml resulterar i en ungefärlig MOI av 50.
- Injektion av Organoids.
Obs! För mikroinjektion, är glaset nålen stabiliseras i en hållare, som kan manövreras i 3 dimensioner av en mikromanipulator. Organoids kvar inom källaren matris i brunnen. Beroende på storlek och placering i brunnen inte alla organoids är lika enmENABLE injektion. Vanligtvis kan de 30 största organoids i en brunn riktas i 5 min.- Harvest bakterier och tvätta dem i basalmedium enligt standardprotokoll 24.
- Beräkna antalet bakterier per ml enligt den optiska densiteten (se steg 3.1.5.1). Späd bakterierna till 1 x 10 9 bakterier per ml i basalmedium.
- Ta en glasnål. Använd pincett bryta spetsen så att öppningen blir ca 10 mikrometer breda.
- Stick in nålen i injektionshållaren och fixa det till mikromanipulator.
- Ta upp cirka 10 pl bakteriell lösning i nålen.
- Placera en fyra brunnar med låga kanter som innehåller organoid kulturer under stereomikroskop.
- Navigera med mikromanipulator, rikta en enda organoids med nålen. Placera nålen nära organoid och sedan in nålen i organoid med en snabb rörelse. Injicera approximately 0,2 pl bakteriell lösning i varje organoid använda microinjector.
- Harvest Organoids för någon analys.
- Som exempel, fixa organoids efter 4 timmar. Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml 2% formaldehyd och inkubera 20 min vid RT eller O / N vid 4 ° C. Organoids kan bearbetas för immunohistokemi enligt standardförfaranden 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll möjliggör isolering av magkörtlar (Figur 2). Körtlar sås i källaren matris, som stelnar som droppe inuti en brunn, vilket ger en 3 dimensionell ram rik på laminin och kollagen för att tillåta körtlar växa till organoids (Figur 3). Organoids börjar vanligtvis som små cystor och inom 12-16 dagar, de expanderar till sfärer med en diameter av 50-300 pm (Figur 4). Vissa organoids kommer att stanna cystisk, vissa kommer att utveckla små buddings. Det senare är vanligtvis ett tecken på en frisk växande kultur. I detta protokoll en brunn i en 24 brunnars platta användes för 100 körtlar, 50 pl källaren matris och 500 | il medium. Detta kan dock vara upp- eller nedskalad.
Framgången för mikroinjektion kan lätt observeras under stereomikroskop som den grumliga, bakterie lösning fyller organoid (Figur 5). Efter adekvat inkubationstid organoids kanbehandlas för någon analys metod önskas. Exempelvis kan organoids inbäddas i paraffin, kan sektioner kapas och färgas med användning av standard immunohistokemi tekniker. Mikroskopisk analys av immunostained organoids visar lyckad injektion av bakterierna (Figur 6).
Figur 1. Bild av Pasteur pipett som används för passage av organoids. I varje panel är den övre pipetten innan den nedre pipetten efter förträngning av eld. Skala i de övre och högra panelerna är cm och mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa bild isolerade humana magkörtlar. Skalstreck 100 pm. klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schema brunnar och representativ bild av mänskliga gastric organoids. Isolerade humana magkörtlar fördelades i källaren matris och placerade sig som droppar i brunnar i en platta med 24 brunnar. Nedre vänster: Översikt över ett representativt väl 11 dagar efter sådd. Nedre högra: Utvidgning av det angivna området. Skalstreck 100 | im. Gastric mus organoids expandera snabbare 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4 "src =" / filer / ftp_upload / 53359 / 53359fig4.jpg "/>
Figur 4. Typisk tillväxt av humana gastriska organoids. Körtlar såddes i källaren matris och bilder av samma organoida togs under en period av 12 dagar. Skala bar 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Mikroinjektion av gastric organoids. Stereoscope bilder av en gastric organoid före (vänster) och under (höger) mikroinjektion av bakterier i lumen. Bakterier är synliga som moln inuti organoid. Skala bar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. immunostained organoids. Mänskliga gastric organoids mikroinjicerades med H. pylori. Efter 4 timmar, var organoids fixerades i paraformaldehyd och inbäddades i paraffin. Sektioner färgades med användning av antikroppar riktade mot bakteriella protein Cytotoxicitet associerat gen A (CagA) enligt standard histologi metoder 25. Övre vänstra: Bilden av en representativ organoid. Lägre panel: Högre förstoring av den inramade området. Uppe till höger:. Högre förstoring av den inramade med en enda bakterie nära epitelcellerna Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
References
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
- Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
- Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
- Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
- Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
- Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
- McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
- Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
- Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
- Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
- Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
- Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
- Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
