Introduction
O estudo de agentes patogénicos se baseia em sistemas modelo adequados para imitar a infecção in vivo. Para alguns agentes infecciosos, sistemas modelo adequados faltam enquanto alguns dos sistemas usados estão longe de ser ideal. Um exemplo é a bactéria gástrica Helicobacter pylori (H. pylori), que está causalmente relacionada com o desenvolvimento de cancro gástrico. No entanto, na ausência de um sistema de cultura de células mais adequado, muitos estudos que objetivam analisar os mecanismos moleculares subjacentes linhas celulares de cancro uso de desenvolvimento de câncer, que representam o ponto final da cascata canceroso. Pilhas, não transformadas seria um modelo melhor para estes estudos. No entanto, as células primárias são disponíveis apenas a partir de um pequeno número de doadores e não podem ser cultivadas durante longos períodos de tempo. Nos últimos anos, a pesquisa com células-tronco tem feito progressos significativos para proporcionar novas fontes de culturas de células primárias para o estudo da biologia da infecção.
Culturas a partir detrês fontes de células-tronco têm sido utilizadas: as células-tronco embrionárias (ESC), células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) ou células-tronco adultas. Eles têm sido utilizados para modelar as infecções com os vírus, tais como o citomegalovírus ou 1,2 Vírus da Hepatite C 3 - 7, parasitas, tais como Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii 8 ou 9, e as bactérias, tais como Bacterioides thetaiotaomicron 10 ou Salmonella enterica 11. Mais recentemente, várias abordagens têm sido publicados para modelar a infecção por H. pylori com Organóides derivados de ESC ou iPS células 12, as células-tronco adultas 21,22 rato ou humanas células-tronco adultas 13 - 15.
O desenvolvimento de culturas de células organ�de estaminais adultas originado a partir de um estudo, no qual as células estaminais individuais isolados a partir de epitélio intestinal murino foram semeadas em uma matriz de 3-dimensional eincorporado em meio que mimetizava o ambiente das células estaminais intestinais contendo EGF como mitogénio, R-espondina para melhorar a sinalização Wnt e Noggin para inibir proteína morfogénica do osso (BMP) de sinalização 16. Nomeadamente estas culturas não requer a co-cultura com células mesenquimais. Nestas condições, as células estaminais proliferar e formar pequenas estruturas com domínios abrigar células das criptas intestinais, e domínios que contêm as células das vilosidades intestinais. Os Organóides assim se auto-organizar para imitar a situação in vivo. Hoje em dia, as células estaminais adultas a partir de diversos tecidos de murino e humanas podem ser crescidas in vitro e auto-organizar em Organóides que se assemelham a sua contraparte in vivo, tais como o intestino delgado e cólon 17, estômago 13,18, 19,20 fígado, pâncreas e 21 próstata 22.
Aqui nós fornecemos um protocolo de vídeo à cultura mouse ou Organóides gástricos humanos de cel-tronco adultasls e microinject-los com H. pylori. Este protocolo é baseado em relatórios anteriores 13,18. Este método pode ser adaptado para a cultura e infectar outras culturas, tais como organ�de Organóides intestinais.
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Protocol
1. Estabelecimento de gástrico organ�de Cultura
Nota: Este protocolo pode ser utilizado para o isolamento de glândulas gástricas de murganho ou tecido humano. Aconselha-se a usar o tecido de aproximadamente 1 cm². O tecido humano pode ser obtido a partir de biópsias gástricas ou ressecção.
- Preparação de material
Nota: A matriz basal utilizado é de Matrigel. Manter a matriz porão em gelo em todos os momentos. Armazenar a matriz basal a -20 ° C e descongelar em gelo antes da utilização. Meio basal refere-se a avançada DMEM / F12 suplementado com HEPES; uma fonte de glutamina apropriado tal como Glutamax e antibióticos apropriados, tais como 1x Primocin. A incubadora é utilizado numa incubadora de cultura celular padrão (37 ° C, atmosfera humidificada, 5% de CO 2)- Esterilizar utensílios de preparação por autoclavagem ou utilizando 100% de álcool isopropílico: uma pinça afiada, tesoura, um bisturi e uma lâmina de microscopia de vidro.
- Um dia antes de isolamento, colocar um 24 well placa de cultura celular na incubadora.
- Prepare a matriz porão de acordo com a recomendação do fabricante. Preparar alíquotas de 1 ml para evitar ciclos repetidos de congelamento descongelamento.
- Prepare 500 ml quelantes tampão e fresco no gelo. Preparar tampão 1x a partir de água destilada estéril com 5,6 mM de Na 2 HPO 4, 8,0 mM de KH 2 PO 4, NaCl 96,2 mM, KCl 1,6 mM, 43,4 mM de sacarose, 54,9 mM de D-sorbitol, 0,5 mM de DL-ditiotreitol (CUIDADO), pH 7. Se planear vários isolamentos, preparar uma solução concentrada de 5x sem a DL-ditiotreitol. Filtrar em condições estéreis o tampão. Antes de isolamento, dilui-se o tampão 5x com água estéril e adicionar a 1x DL-ditiotreitol apenas antes do isolamento.
- Preparar e diluir todos os factores de crescimento de acordo com as recomendações dos fabricantes. Use pequeno porte alíquotas e evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Fatores de crescimento funcionais são cruciais para os resultados.
- Meio basal fresco no gelo e arrefecer a centrífuga a 46; C.
- Aquecer outra aliquota de meio basal de 37 ° C.
- Isolamento das glândulas
- Colete aproximadamente 1 cm² de tecido em meio basal de gelo frio. Manter em gelo até a preparação. Enquanto é preferível para processar tecidos, logo que possível, em meio de armazenamento de tecido em gelo se necessário.
- Coloque o tecido em um prato de 10 centímetros Petri e cobri-lo com tampão de quelação 1x frio. Lave delicadamente movendo para trás e para frente.
- Coloque o tecido em uma seco 10 centímetros placa de Petri. Utilizando uma pinça, retire cuidadosamente o muco, bem como a camada muscular sob microscópio estereoscópico. Lave o tecido em tampão quelante 1x frio, movendo suavemente para trás e para frente.
- Coloque 1 cm2 de tecido em um novo e seco 10 centímetros placa de Petri. Usando uma tesoura corte-o em 20-50 pequenos pedaços de aproximadamente 2-5 tamanho mm².
- Utilizando uma pinça, coloque todas as peças em um tubo de 50 ml.
- Dê uma estéril 10 ml pipeta de plástico. Molhar a pipeta em tampão 1x quelante. Guardautilizando esta mesma pipeta ao longo do procedimento.
- Adicionar 10 ml de tampão 1x quelante frio para o tubo de 50 ml. Lavar as peças à vigorosamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Deixe as peças resolver. Remover o sobrenadante.
- Repetir a lavagem (passo 1.2.7) até que o sobrenadante é clara. Isso leva cerca de 50-100 ml de tampão 1x quelante para 1 cm² de tecido humano.
- Incubam-se as peças de tecido em 20 ml de tampão 1x quelante suplementado com 10 mM de EDTA à temperatura ambiente durante 10 min, com inversão suave a cada 2 min.
Nota: Tempo e temperatura de incubação este pode ser optimizado para velocidade e / ou preservação da arquitectura glandular. Elas podem variar de várias horas de incubação a 4 ° C sobre uma plataforma de rolamento para 5 min a 37 ° C num agitador com 200 rpm. Bons pontos de partida para o estômago do rato são de 30 min a 4 ° C sobre uma plataforma de rolamento e para o estômago humano, 10 min à temperatura ambiente. - Pipeta uma vez suavemente para cima e para baixo usando a pipeta de 10 ml. Permitir que o piECES para resolver. Desprezar o sobrenadante.
- Utilizando a pipeta, transferir as peças para uma limpeza 10 cm numa caixa de Petri. Remover o líquido.
- Coloque uma lâmina de microscopia de vidro na parte superior das peças de tecido. Observe o tecido intacto sob um microscópio invertido para cultura de células com ampliação de 10X.
- Aplique pressão para a lâmina de vidro e uma placa de Petri. Segure tanto na mão (com luvas estéreis) e pressionando o vidro com o dedo polegar. A borda do tecido aparece turvo, indicando que as glândulas são libertados para fora do tecido.
- Observe as glândulas liberado sob um microscópio invertido para cultura de células com ampliação de 10X.
- Recolha glândulas e tecidos em 30 ml de meio basal frio. Vamos fragmentos de tecido grandes resolver.
- Recolhe-se o sobrenadante que contém as glândulas em dois tubos de 15 ml.
- Centrifugar 5 min a 200 xg e 4 ° C. Sobrenadante de descarte. O sedimento contém glândulas isolado. Mantenha-os no gelo.
- Semeadura de Glândulas
- Alternativa 1: Semente 6 poços de uma fila de diluição.
- Suspender o sedimento em 60 mL de matriz porão.
- Prepare 5 estéreis tubos de 1,5 ml em gelo com cada uma contendo 50 ul de matriz basal. Transferir 10 uL da suspensão de glândulas matriz / cave para dentro do primeiro tubo de 1,5 ml. Suspender as glândulas e transferir 10 ul desta solução para o próximo tubo de 1,5 ml. Repita o procedimento para os próximos tubos.
- Alternativa 2: propagar uma quantidade calculada de glândulas por poço. Comece com 100 glândulas por matriz porão 50 ul em um poço de uma placa de 24 poços.
- Suspender cuidadosamente as glândulas peletizadas em 10 ml de meio basal. Colocar 50 uL sobre um limpa 10 ml numa caixa de Petri. Contagem do número de glândulas sob um microscópio invertido para cultura de células com ampliação de 10X.
- Calcular a concentração de glândulas na solução. Transferir o volume que Contains 400 glândulas para um novo tubo de 15 ml.
- Centrifugar 5 min a 200 xg e 4 ° C. Elimine o sobrenadante e manter o tubo em gelo. Adicionar 200 ul matriz porão e ressuspender cuidadosamente. Manter em gelo.
- Pegue a 37 ° C quente placa de 24 poços (ver passo 1.1.2) da incubadora. Coloque uma gota de 50 ul de glândulas matriz de porão no centro do poço. A gota deverá formar uma cúpula.
- Transferir cuidadosamente a placa de novo na incubadora de cultura de células. Deixe a matriz porão solidificar 10 min.
- Prepare meio quente com todos os fatores de crescimento.
- Para glândulas humanos: Suplementar o meio basal com os seguintes factores de crescimento para Organóides gástricos humanos: 50 ng / ml de EGF, 10% de meio condicionado de noggin, 10% de meio R-spondin1 condicionado, 50% de meio de Wnt-condicionado, 200 ng / ml de factor de crescimento de fibroblastos (FGF) 10, 1 nM de gastrina, e 2 uM de inibidor TGFbeta e 10 uM em dupla espiral associada a Rho formando proteína serina / treonina cinase inibidor (RHOKi).
- Para glândulas murinos: Suplementar o meio basal com os seguintes factores de crescimento de rato Organóides gástricas: 50 ng / ml de EGF, 10% de meio condicionado de noggin, 10% de meio R-spondin1 condicionado, 50% de meio de Wnt-condicionado, 100 ng / FGF10 ml, 10 nM de gastrina, 0,5 mM de inibidor de TGFbeta e 10 uM RHOKi.
- Pegue a placa da incubadora. Juntar cuidadosamente 500 � de meio com todos os fatores de crescimento (1.3.6) para cada poço sem perturbar a matriz porão. Coloque-o de volta para a incubadora.
- Atualizar as médias 3 vezes por semana (a cada 2-3 dias). Por meio de refrescamento, remover o meio de idade com deixando a gota de matriz porão intacta. Juntar cuidadosamente, meio quente fresco com todos os fatores de crescimento. Não adicione RHOKi. Apenas adicionar RHOKi diretamente após a semeadura das glândulas ou após a divisão dos Organóides (etapa 2).
2. A passagem de gástrico organ�de Cultura Antes de microinjeção.
ove_content "> Nota: Todo o tipo de cultura organ�de tem seu próprio tempo de duplicação mouse intestinal, assim como as culturas gástricas são geralmente divididos. 1: 5 a cada 5-7 dias culturas intestinal humano são divididas. 1: 5. a cada 10-12 dias Humano culturas gástricas são divididas 1: 5 a cada 14 dias Se iniciada a partir de células individuais, Organóides gástrico humano também pode levar 20 dias para formar adequadamente É um bom sinal se estruturas de brotamento cercam o lúmen central Neste protocolo, Organóides são divididos em... 4 placas de poços para microinjecção. Manutenção de Organóides segue o mesmo protocolo, mas pode utilizar qualquer outra placa de cultura celular, tais como placas de cultura de 24 células normais.- Preparação de material
- Pipetas Pasteur autoclave.
- O dia antes da passagem, colocar um poço 4 placa de cultura celular na incubadora a 37 ° C. Os 4 placas de poços têm bordas baixas e permitir micromanipulação.
- Prepare a matriz porão de acordo com a recomendação do fabricante. No dia da passaging, descongelar matriz porão em gelo.
- Preparar e diluir todos os factores de crescimento de acordo com as recomendações dos fabricantes.
- Meio basal fresco em gelo e arrefece-se a centrífuga a 4 ° C.
- Passagem de culturas organ�de
- Pegue a placa com as Organóides da incubadora. Remover forma de um poço.
- Adicionar 1 ml de meio basal frio à matriz basal no poço. Usando uma micropipeta 1 ml, pipetar vigorosamente cima e para baixo até que a matriz porão é dividido. Transferir para um tubo de 15 ml. Coloque no gelo.
- Dê uma pipeta de Pasteur de vidro e uma fonte de fogo, como um bico de Bunsen.
- Segurar a ponta da pipeta para o fogo até que a abertura da ponta diminuiu de 1,5 mm a cerca de 0,5 mm (Figura 1). Deixe a pipeta legal para RT.
- Molhar a pipeta em meio basal. Uma pipeta de forma otimizada estreitou vai ocupar o meio visivelmente mais lento do que uma pipeta estreitou-un, mas ainda vai tudoow pipetando bem.
- Tome-se Organóides na pipeta e vigorosamente pipeta 10x cima e para baixo. A quebra das Organóides pode ser observada a olho nu.
- Adicionar 9 ml de meio basal frio e centrifugar durante 5 min a 200 xg e 4 ° C.
- Cuidadosamente descarte tudo sobrenadante. Suspender o sedimento em 250 mL matriz porão. Manter em gelo.
- Pegue a quente 4 placa de cultura de 37 ° C e coloque uma gota de matriz 50 Organóides ul / cave em cada poço.
- Transferir a placa cuidadosamente para trás para a incubadora. Deixe a matriz porão solidificar a 37 ° C durante 10 min.
- Prepare meio adequado para qualquer rato ou humanos Organóides conforme listado na etapa 1.3.6.
- Pegue a placa da incubadora e sobrepor cada gota matriz cave com 500 � de meio.
- Transferir a placa à incubadora.
- Atualize a média 3 vezes por semana a cada 2-3 dias (ver 1.3.8.).
- Para o congelamento de Organóides, mechanically perturbar Organóides como descrito para a divisão neste protocolo (Passos 2.2.1-2.2.5.). Suspender os fragmentos organ�de em 500 ml de meio de congelação e congelar a -80 ° C usando criotubos e um recipiente de congelamento. Para armazenamento a longo prazo, para transferir os tubos em azoto líquido.
- Para o descongelamento de Organóides, preparar a placa de cultura, matriz porão, fatores de crescimento, meio frio e quente como descrito nas etapas 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Aquece-se a ampola congelada usando um banho de água, e as células de transferência imediatamente após a descongelação para um tubo de 15 ml com 10 ml de meio basal frio. Centrífuga e placa das células, conforme descrito no 2.2.5 a 2.2.12.
Nota: microinjeção de Organóides é trabalhoso, mas permite a possibilidade única de estudar a interação em 3D. - Se os estudos em 3D não são necessários, sementes Organóides em duas dimensões. Para isso, interromper as Organóides como previsto nos passos 2.2.1 a 2.2.6. Adicionar meio de 2.250 ul frio com todos os fatores de crescimento para 250 ul de porão matrix com fragmentos organ�de.
- Semente 5 em poços de uma placa de 24 poços com 500 ul por poço. Alterar média 3 vezes por semana, com a substituição cuidadosamente os superiores 400 ul somente, para manter a matriz porão na parte inferior da placa sem serem incomodados.
Nota: Organóides irá anexar à placa de cultura de células e expandir em 2D. A microscopia electrónica mostrou que o lado apical das células enfrenta a forma do poço (dados não mostrados). - Antes de infecção, incluindo o intercâmbio de todas médio matriz porão, para permitir que as bactérias para anexar às células. Um protocolo semelhante também foi descrita para a infecção por H. pylori 14. 2D camadas de células não pode conter todos os tipos de células que estão presentes no Organóides 3D.
- Semente 5 em poços de uma placa de 24 poços com 500 ul por poço. Alterar média 3 vezes por semana, com a substituição cuidadosamente os superiores 400 ul somente, para manter a matriz porão na parte inferior da placa sem serem incomodados.
3. microinjeção de organ�de Cultura.
Nota: Este protocolo pode ser utilizado para microinject bactérias em Organóides. Pode ser útil para iniciar a injecção com Organóidesque são mais permissiva para microinjecção. Por exemplo, rato Organóides gástricas podem crescer em grandes Organóides císticos que são fáceis de atingir.
- Preparação de material
- Puxe um capilar de vidro em duas agulhas de injeção, utilizando um extrator micropipeta, de acordo com a recomendação do fabricante. O puxador de micropipeta vai aquecer o capilar de vidro no meio e vai puxar o tubo capilar em duas partes, gerando, assim, duas agulhas de vidro. É prático para puxar várias agulhas e armazená-los em uma placa de Petri limpa.
- Para permitir que a infecção bacteriana, remover os antibióticos a partir de todos os meios por pelo menos 3 mudanças de meio (= uma semana). Isto irá diluir os antibióticos de matriz porão. Se for utilizada uma estirpe bacteriana que é resistente a um antibiótico específico, adicionar este antibiótico específico para minimizar as possibilidades de contaminação.
- Prepare a bancada de trabalho para microinjeções. Para o trabalho em diferentes níveis de segurança biológica, pode ser necessário colocar um estéreomicroscópio dentro de um banco estéril. Neste protocolo, injetar H. pylori sob condições de nível de biossegurança 2 sob um microscópio estereoscópico dentro de um banco estéril.
- Cultura das bactérias de acordo com protocolos padrão 13,23.
- Para estimar a multiplicidade de infecção (MOI), estimar a dois parâmetros: o número de bactérias e o número de células por organ�de como descrito abaixo. A MOI pode correlacionar-se com os resultados, por exemplo com hospedeiros de IL-8, a expressão de ARNm de 13.
- Para calcular a densidade bacteriana na solução infecção, em primeiro lugar estabelecer a curva padrão de unidades de densidade óptica e formadoras de colónias (CFU) de acordo com protocolos padrão 24. Uma densidade óptica de 0,1 a 550 nm deve dar aproximadamente 10 7 CFU / mL.
- Para estimar o número de células por organ�de, contar o número de Organóides em um bem. Disrupt Organóides como descrito nas etapas 2.2.1-2.2.4. Após a centrifugação de 5 min a 200 xg e 4 ° C,adicionar 1 ml de solução de dissociação enzimática e ressuspender.
- Incubar a 37 ° C com agitação repetida durante 5-10 min. Determinar se as células foram dissociadas em células individuais sob o microscópio (tal como o microscópio invertido Leica DMIL a ampliação de 10X). Se necessário prolongar a incubação.
- Contagem de células por organ�de utilizando um hemocitómetro e calcular o número de células por organ�de. Organóides gástricas humanas com um diâmetro de cerca de 200 um tem aproximadamente 4.000 células. A injecção de 0,2 mL de uma solução bacteriana com 1 x 10 9 bactérias por ml resultados em uma MOI aproximada de 50.
- A injecção de Organóides.
Nota: Para micro-injecção, a agulha de vidro é estabilizado em um suporte, o qual pode ser manobrado em 3 dimensões por um micromanipulador. Organóides permanecem dentro da matriz no interior do porão bem. Devido ao tamanho e posicionamento no poço, nem todos os são igualmente um OrganóidesmENABLE para injecção. Geralmente, as 30 maiores Organóides em um poço pode ser alvo de 5 min.- Bactérias colheita e lave-os em meio basal de acordo com protocolos padrão de 24.
- Calcular o número de bactérias por ml, de acordo com a densidade óptica (ver passo 3.1.5.1). Dilui-se as bactérias a 1 x 10 9 bactérias por ml em meio basal.
- Dê uma agulha de vidro. Usando fórceps quebrar a ponta de modo a que a abertura irá ser de aproximadamente 10 m de largura.
- Insira a agulha no suporte da injeção e corrigi-lo para o micromanipulador.
- Tome-se, aproximadamente, 10 solução bacteriana ul na agulha.
- Colocar uma placa de 4 bem com bordas baixas que contêm culturas organ�de, ao microscópio estereoscópico.
- Navegando com o micromanipulador, segmentar um único Organóides com a agulha. Posicione a agulha perto do organ�de e, em seguida, inserir a agulha no organ�de com um movimento rápido. Injectar approximately 0,2 ul solução bacteriana em cada organ�de utilizando o microinjector.
- Colheita Organóides para qualquer análise.
- Como exemplo, corrigir Organóides após 4 horas. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de formaldeído a 2% e incuba-se 20 min à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. Organóides podem ser processados para imuno-histoquímica de acordo com procedimentos padrão 25.
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Representative Results
Este protocolo permite o isolamento de glândulas gástricas (Figura 2). Glândulas são semeadas em matriz basal, que se solidifica como gota dentro de um poço, fornecendo uma estrutura 3 dimensional rica em laminina e colagénio para permitir que as glândulas crescer em Organóides (Figura 3). Organóides geralmente começam como pequenas cistos e dentro de 12-16 dias, que se expandem para as esferas com um diâmetro de 50-300 ^ M (Figura 4). Alguns Organóides vai ficar cística, alguns vão desenvolver pequenos brotos. O último é geralmente um sinal de uma cultura em crescimento saudável. Neste protocolo de um poço de uma placa de 24 poços é usado para 100 glândulas, 50 mL de matriz basal e 500 ul de meio. No entanto, isto pode ser para cima ou downscaled.
O sucesso da microinjecção pode ser facilmente observada ao microscópio estereoscópico como a solução turva, bacteriana enche o organóide (Figura 5). Após o tempo de incubação adequado, pode Organóidesser processadas por qualquer método de análise desejado. Por exemplo, pode ser Organóides embebidos em parafina, as secções podem ser cortadas e coradas utilizando técnicas de imuno-histoquímica padrão. A análise microscópica de Organóides imunocoradas demonstrar injecção bem sucedida das bactérias (Figura 6).
Figura 1. Imagem do Pasteur pipeta utilizada para a passagem de Organóides. Em cada painel, a pipeta superior é, antes, a pipeta menor após estreitando pelo fogo. Escala em painéis superiores e direito é cm e mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagem representativa de glândulas gástricas isoladas humanos. bar Scale 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Esquema de poços e imagem representativa de Organóides gástricos humanos. Glândulas gástricas isoladas humanas foram dispensadas em matriz basal e colocada na forma de gotas para os poços de uma placa de 24 poços. Inferior esquerdo: Visão de um bem representativa de 11 dias após a semeadura. Inferior direito: Alargamento da área indicada. A barra de escala 100? M. Organóides gástricas rato expandir mais rápido 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. Crescimento típico de Organóides gástricos humanos. Glândulas foram semeadas em placas de matriz basal e imagens da mesma organ�de foram tomadas ao longo de um período de 12 dias. Scale bar 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. microinjeção de Organóides gástricas. Imagens Stereoscope de um organ�de gástrica antes (à esquerda) e durante (à direita) microinjeção de bactérias no lúmen. As bactérias são visíveis como nuvem dentro do organ�de. Barra de escala de 200 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. imunocorados Organóides. Organóides gástricas Humanos receberam microinjeções H. pylori. Após 4 h, Organóides foram fixadas em paraformaldeído e embebidos em parafina. As secções foram coradas utilizando anticorpos dirigidos contra a citotoxicidade da proteína bacteriana gene associado A (CagA) de acordo com métodos padronizados de histologia 25. Superior esquerda: Imagem de uma organ�de representante. Painel inferior: Maior ampliação da área de box. Canto superior direito:. Maior ampliação da área de box com uma única bactéria perto das células epiteliais por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
References
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
- Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
- Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
- Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
- Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
- Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
- McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
- Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
- Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
- Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
- Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
- Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
- Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
