感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

Introduction

病原体の研究は、in vivoでの感染を模倣するための適切なモデル系に依存しています。使用されるシステムの一部が最適ほど遠いながらいくつかの感染症剤は、適切なモデル系が不足しています。一例としては、胃がんの発症に因果関係である胃の細菌ヘリコバクター・ピロリ （ ピロリ菌 ）、です。まだ癌カスケードの終点を表す癌発生用癌細胞株の根底にある分子メカニズムを分析することを目指して、より適切な細胞培養系の非存在下で、多くの研究。プライマリ、非形質転換細胞は、これらの研究のための優れたモデルとなります。しかし、初代細胞は、ドナーの数が少ないからのみ利用可能であり、より長い期間にわたって培養することができません。近年では、幹細胞研究は、感染生物学の研究のための主要な細胞培養のための新しいソースを提供するために重要な進歩を遂げました。

からの文化3幹細胞源が使用されている：胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）または成体幹細胞。このような熱帯熱マラリア原虫 ⁸またはトキソプラズマ原虫 ^9と7、寄生虫、およびそのようなバクテリオテタイオタオミクロン ¹⁰またはサルモネラ菌 ¹¹などの細菌、 ^-彼らは、このようなサイトメガロウイルス^1,2またはC型肝炎ウイルスなどのウイルス^、3の感染をモデル化するために使用されてきました。最近では、いくつかのアプローチがHで感染をモデル化するために公開されています^{15 -} ESCまたはのiPS細胞¹²由来オルガノイド、マウスの成体幹細胞^21,22またはヒト成体幹細胞¹³とピロリ菌 。

成体幹細胞からオルガノイド培養物の開発は、マウスの腸上皮から単離された単一の幹細胞が3次元マトリックスに播種された研究に由来すると骨形態形成タンパク質^{（BMP）16シグナリング}を阻害するためにWntシグナル伝達とノギンを高めるためにマイトジェン、RスポンジンのようにEGFを含有する腸の幹細胞の環境を模倣媒体に埋め込 ​​まれました。特にこれらの培養物は、間葉系細胞との共培養を必要としません。これらの条件下では、幹細胞は増殖し、ドメインは腸陰窩細胞、および腸絨毛の細胞を含むドメインを保有して小さな構造を形成します。オルガノイドは、このようにin vivoでの状況を模倣するために、自己組織化。今日、多くのネズミと人間的な組織から成体幹細胞を in vitroで増殖させることができ、そのような小腸および結腸^17、胃^13,18、肝臓^19,20、膵臓²¹と、それらのin vivoでの対応を、似ているオルガノイドに自己組織化前立腺^22。

ここでは、成体幹CELから培養マウスまたはヒトの胃オルガノイドのビデオプロトコルを提供LSはHでそれらを顕微注入すると、 ピロリ菌 。このプロトコルは、以前の報告^13,18に基づいています。この方法は、腸のオルガノイドのような他のオルガノイド培養を培養し、感染のために適合させることができます。

Protocol

1.設立胃のオルガノイド培養

注意：このプロトコルは、マウスまたはヒトの組織からの胃腺の単離のために使用することができます。これは、約1 cm 2での組織を使用することをお勧めします。ヒト組織は、胃切除または生検から得ることができます。

1. 材料の調製
   注意：使用する地下行列はマトリゲルです。すべての回で氷の上で地下行列をしてください。 -20℃で地下行列を格納し、使用前に氷上で解凍。基礎培地は、HEPESを補充した高度なDMEM / F12を指します。そのようなグルタマックスなどの1x Primocinなどの適切な抗生物質のような適切なグルタミン源。使用される培養器は、標準的な細胞培養インキュベーター（37℃、加湿雰囲気中、5％CO _2）であります
   1. 鋭い鉗子、はさみ、メス、ガラス顕微鏡スライド：オートクレーブまたは100％のイソプロピルアルコールを使用して調理器具を滅菌します。
   2. 分離前の日は、24 WELを配置インキュベータ内のL細胞培養プレート。
   3. メーカーの推奨に従って、基底行列を準備します。繰り返し凍結融解サイクルを避けるために、1ミリリットルのアリコートを準備します。
   4. 氷の上のバッファとクールなキレート500ミリリットルを準備します。 5.6 mMの_の Na 2 HPO _4、8.0 mMのKH ₂ PO _4、96.2 mMの塩化ナトリウム、1.6mMのKClを、43.4 mMのスクロース、54.9 mMのD-ソルビトール、0.5 mMのDL-ジチオスレイトール（注意）、pHの滅菌蒸留水から1×バッファーを準備します7.いくつかのアイソレーションを計画している場合は、DL-ジチオスレイトールなしで5倍に濃縮液を調製。滅菌フィルタバッファ。分離する前に、1倍だけ分離する前に、DL-ジチオスレイトールを追加する滅菌水で5倍のバッファーを希釈します。
   5. 製造業者の推奨に従って、すべての成長因子を準備し、希釈します。小型のアリコートを使用し、凍結融解サイクルを避けます。機能的な増殖因子は、結果を得るために重要です。
   6. 氷の上に基礎培地を冷却し、4に遠心機を冷却6; C。
   7. 37℃に基礎培地の別のアリコートを温めます。
2. 腺の単離
   1. 氷冷基礎培地中の組織の約1 cm 2のを収集します。準備まで氷上に保管してください。氷上の培地中で、それはできるだけ早く組織を処理することが好ましいが、店の組織必要に応じて。
   2. 10センチメートルペトリ皿に組織を置き、冷たい1×キレート緩衝液でそれをカバーしています。静かに前後に移動することによって洗浄します。
   3. ドライ10センチメートルペトリ皿に組織を配置します。鉗子を使用して、慎重に実体顕微鏡下で粘液だけでなく、筋肉層を除去します。静かに前後に移動することによって、冷たい1×キレート緩衝液に組織を洗ってください。
   4. 新しい乾い10センチメートルペトリ皿の上に^1cm 2の組織を配置します。はさみを使用して、約2〜5mm²のサイズの20〜50小片にカット。
   5. 鉗子を使用して、50mlチューブにすべてのピースを置きます。
   6. 滅菌10ミリリットルのプラスチックピペットを取ります。 1×キレート緩衝液にピペットを濡らし。キープ作業中はこの同じピペットを使用して。
   7. 50mlのチューブに10ミリリットル冷たい1×キレートバッファを追加します。上下に激しく10回ピペッティングすることによって作品を洗ってください。ピースが落ち着くしてみましょう。上清を取り除きます。
   8. 上清が透明になるまで洗浄する（ステップ1.2.7）を繰り返します。これは、ヒト組織の1 cm 2のために約50〜100ミリリットル1×キレートバッファのを取ります。
   9. 穏やかに2分ごとに反転して10分間室温で10mMのEDTAを補った20 mlの1×キレート緩衝液中の組織片をインキュベートします。
      注：このインキュベーションの時間および温度は、速度および/または腺構造の保存のいずれかのために最適化することができます。彼らは、200 rpmのシェーカーで37℃で圧延プラットフォーム上で4℃で数時間のインキュベーションから5分の範囲であることができます。マウスの胃のための良い出発点は、ローリングプラットフォーム上で、室温でヒトの胃、10分間4℃で30分です。
   10. 一度静かにアップし、10 mlピペットを使用してダウンピペット。パイを許可します決済するECES。上清を捨てます。
   11. ピペットを使用して、きれいな10 cmでペトリ皿に片を移します。液体を除去します。
   12. 組織片の上にガラス顕微鏡スライドを配置します。 10倍の倍率で、細胞培養のための倒立顕微鏡下で無傷の組織を観察します。
   13. スライドガラスシャーレに圧力を適用します。 （滅菌手袋で）手の両方を持ち、親指でガラスを押します。組織のリムは腺が組織の外に放出されていることを示す曇って表示されます。
   14. 10倍の倍率で、細胞培養のための倒立顕微鏡下でリリースされた腺を観察します。
   15. 30ミリリットルの冷基礎培地で腺および組織を収集します。大きな組織片を沈降してみましょう。
   16. 2 15ミリリットルチューブに腺を含む上清を収集します。
   17. 200×gで5分間遠心し、4℃。上清を捨てます。ペレットは、単離された腺が含まれています。氷の上に保管してください。
3. 腺の播種播種のために、地下の行列を氷冷常に保つので、液体のままです。
4. 1代替：希釈列のシード6ウェルは。
   1. 地下行列の60μlのペレットを一時停止します。
   2. 地下行列の各含む50μlの氷の上に5滅菌1.5ミリリットルチューブを準備します。転送最初の1.5mlチューブに腺/地下行列懸濁液10μl。腺を中断し、次の1.5mlチューブにこの溶液10μlを移します。次のチューブのために繰り返します。
5. 2別の方法：シードウェルあたり腺の計算量。 24ウェルプレートの1ウェル中の50μlの基底行列あたり100腺から開始します。
   1. 慎重に10ミリリットル基礎培地中でペレット化した腺を一時停止します。クリーン10ミリリットルペトリ皿の上に50μlのを置きます。 10倍の倍率で、細胞培養のための倒立顕微鏡下腺の数をカウントします。
   2. 溶液中の腺の濃度を計算します。ボリュームにそのコンタを転送イン新しい15mlチューブに400腺。
   3. 200×gで5分間遠心し、4℃。上清を捨て、チューブを氷上に維持します。 200μlの基底行列を追加し、慎重に再懸濁します。氷の上に保管してください。
6. 37℃の温かい24ウェルプレートを取りインキュベーターから（ステップ1.1.2を参照）。ウェルの中央に地下マトリックス中50μlの腺の一滴を置きます。ドロップは、ドームを形成することになります。
7. 慎重にバック細胞培養インキュベーターにプレートを転送します。地下行列が10分を固化してみましょう。
8. すべての成長因子と温培地を準備します。
   1. 人間の腺について：ヒト胃オルガノイドのための次の成長因子と基本培地を補足：50 ngの/ mlのEGF、10％のノギン馴化培地、10％R-spondin1馴化培地、50％のWnt馴化培地、200 ngの/ mlの線維芽細胞増殖因子（FGF）10、1 nMのガストリン、および2μMTGFベータ阻害剤及び10μMRho関連コイルドコイル形成するタンパク質セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤（RHOKi）。
   2. ネズミ腺の場合：50 ngの/ mlのEGF、10％のノギン馴化培地、10％R-spondin1馴化培地、50％のWnt馴化培地、100 ngの/：マウス胃オルガノイドのための次の成長因子と基本培地サプリメントmlのFGF10、10 nMのガストリン、0.5 mMのTGFベータ阻害剤および10μMRHOKi。
9. インキュベーターからプレートを取ります。慎重地下行列を乱すことなく、各ウェルに、すべての成長因子（1.3.6）と500μlの培地を追加します。バックインキュベーターに配置します。
10. 週中3回（2〜3日ごと）を更新します。メディアをリフレッシュするために、そのまま地下行列のドロップを残して、古いメディアを削除します。慎重にすべての成長因子と新鮮な、暖かい培地を追加します。 RHOKiを追加しないでください。のみ直接腺の播種後またはオルガノイド（ステップ2）の分割後RHOKiを追加します。

マイクロインジェクションの前に胃オルガノイド培養の2継代。

ove_content ">注：すべてのオルガノイド文化のタイプ独自の倍加時間を持っているマウスの腸だけでなく、胃の培養は、通常1分割されています。。毎に10〜12日5ヒト：5〜7日ごとに5は、ヒトの腸の培養物を1に分割されています。胃の培養物を1に分割されています。5、14日ごとに単一の細胞から開始した場合、ヒト胃オルガノイドも適切に形成するために20日かかる場合がありますそれは、出芽構造は中央内腔を囲む場合は、このプロトコルでは、オルガノイドは、に分割されている良い兆候です。。。マイクロインジェクションのための4ウェルプレート。オルガノイドの維持は、同じプロトコルに従いますが、標準的な24ウェル細胞培養プレートのような、任意の他の細胞培養プレートを使用することができます。

1. 材料の調製
   1. オートクレーブパスツールピペット。
   2. 日が経過する前に、37℃のインキュベーター内で4ウェル細胞培養プレートを配置します。 4ウェルプレートは、低エッジを有するとマイクロマニピュレーションを可能にします。
   3. メーカーの推奨に従って、基底行列を準備します。 passagiの日にNG、氷上で地下行列を解凍。
   4. 製造業者の推奨に従って、すべての成長因子を準備し、希釈します。
   5. 氷上でクール基礎培地と4℃に遠心分離器を冷却します。
2. オルガノイド文化の道
   1. インキュベーターからオルガノイドでプレートを取ります。 1つのウェルから培地を除去。
   2. ウェル内の地下行列に冷たい基礎培地の1ミリリットルを追加します。地下行列が分解されるまで、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して、積極的に上下にピペットと。 15mlチューブに移します。氷の上に置きます。
   3. ガラスパスツールピペットとブンゼンバーナーなどの火源を取ります。
      1. 先端の開口部は約0.5mm（ 図1）に1.5ミリメートルから狭くするまで火にピペットの先端を保持します。室温に冷却ピペットをしてみましょう。
      2. 基礎培地にピペットを濡らし。最適狭くピペットが未狭くピペットよりも目に見えて遅くなるメディアを取るだろうが、それはまだ、すべての意志OWよくピペッティング。
   4. ピペットでオルガノイドを取り、上下に激しく10倍をピペット。オルガノイドの破壊を目で観察することができます。
   5. 200×gで5分間の寒基礎培地および遠心分離機の9ミリリットルを加え、4℃。
   6. 慎重にすべての上清を捨てます。 250μlの基底行列にペレットを一時停止します。氷の上に保管してください。
   7. 37℃の温かい4ウェル培養プレートを取り、各ウェルに50μlのオルガノイド/地下行列のドロップを置きます。
   8. 慎重にバックプレートをインキュベーターに転送します。基底行列を10分間37℃で凝固させて。
   9. ステップ1.3.6に記載されているように、マウスまたはヒトのいずれかオルガノイドのための適切な培地を準備します。
   10. インキュベーターからプレートを取り出し、500μlの培地を用いて、各地下行列降下を重ねます。
   11. インキュベーターにプレートを転送します。
   12. 2〜3日ごとに培地を週に3回のリフレッシュ（1.3.8を参照。）。
   13. オルガノイドの凍結については、mechanこのプロトコルで分割に記載されているよう的にはオルガノイドを妨害する（ステップ2.2.1-2.2.5。）。凍結培地500mlにオルガノイドの断片を一時停止し、クリオチューブと冷凍コンテナを使用して、-80℃に凍結します。長期保存のために、液体窒素にチューブを移します。
   14. ステップ1.1.2、1.1.3、1.1.5、1.1.6、1.1.7で説明したようにオルガノイドの解凍のために、培養プレート、地下マトリックス、成長因子、寒さと暖かい培地を調製。すぐに10ミリリットルの冷基礎培地を15mlチューブに解凍した後凍結した水浴を用いてバイアル、および転送細胞を温め。 2.2.12に2.2.5で説明したように、細胞を遠心分離し、プレート。
       注意：オルガノイドのマイクロインジェクションは面倒ですが、3Dでの相互作用を研究するためのユニークな可能性を可能にします。
   15. 3Dの研究が必要とされていない場合は、二次元でオルガノイドをシード。手順2.2.6に2.2.1にレイアウトされ、このため、オルガノイドを混乱させる。地下MAの250μlに、すべての成長因子と2250μlの冷たい培地を追加オルガノイドフラグメントとTRIX。
       1. ウェルあたり500μlの24ウェルプレートのウェル中の5種。慎重に邪魔されずに、プレートの下にある地下行列を維持するために、上部のみを400μlを交換すると、週3回の培地交換。
          注意：オルガノイドは、細胞培養プレートに付着して2Dで展開されます。電子顕微鏡は、細胞の頂端側はウェル中の媒体に対向していることを示した（データ示さず）。
       2. 感染する前に、細菌は細胞に付着することを可能にするために、地下の行列を含むすべてのメディアを交換します。同様のプロトコルはH.感染のために記載されていますピロリ ^14。 2D細胞層ではなく、3Dオルガノイドに存在するすべての細胞型を含んでいてもよいです。

オルガノイド培養の3マイクロインジェクション。

注意：このプロトコルは、オルガノイドに細菌を顕微注入するために使用することができます。これは、オルガノイドの注射を開始するために役立つかもしれませんマイクロインジェクションにより許容されていること。例えば、マウスの胃オルガノイドは、ターゲットが簡単で、非常に大きな嚢胞オルガノイドに成長することができます。

1. 材料の調製
   1. メーカーの推奨に従って、マイクロピペットプラーを使用して2つの注射針にガラスキャピラリーを引き出します。マイクロピペットプラーは途中でガラスキャピラリーを加熱し、それによって、二枚のガラス針を生成する2つの部分にキャピラリーを引っ張ってきます。これは、いくつかの針を引き、きれいなペトリ皿にそれらを格納することが現実的です。
   2. 細菌感染を可能にするために、少なくとも3培地の変化（= 1週間）のために、すべてのメディアから抗生物質を除去します。これは、基底行列から抗生物質を希釈します。特定の抗生物質に耐性である細菌株を使用する場合は、汚染の可能性を最小限に抑えるために、この特定の抗生物質を追加します。
   3. マイクロインジェクション用の作業台を準備します。異なる生物学的安全性レベルでの作業のためにはステレオを配置する必要があるかもしれません無菌ベンチ内部の顕微鏡。このプロトコルでは、Hを注入バイオセーフティーレベル下ピロリ無菌ベンチ内部実体顕微鏡下の2つの条件。
   4. 文化標準プロトコル^13,23による細菌。
   5. 細菌の数及びオルガノイド当たりのセルの数は、以下に概説するように：感染（MOI）の多数を推定するために、2つのパラメータを推定します。 MOIは、ホスト、IL-8 mRNA発現¹³と、たとえば、結果と相関することができます。
      1. 感染溶液中の細菌の濃度を計算するために、最初の標準的なプロトコル²⁴に記載の光学密度及びコロニー形成単位の標準曲線（CFU）を確立します。 550 nmで0.1の光学密度は約10 ⁷ CFU / mlのが得られるはずです。
      2. オルガノイド当たりの細胞数を推定するために、1ウェル中オルガノイドの数を数えます。手順で説明したようにオルガノイドを混乱させる2.2.1-2.2.4。遠心5分200×gでの後、4℃、酵素的解離溶液と再懸濁の1ミリリットルを追加します。
         1. 繰り返し5〜10分間振とうしながら37℃でインキュベートします。細胞は（10倍の倍率で、そのようなライカDMILなど倒立顕微鏡）顕微鏡下で単一細胞に分離しているかどうかを確認します。必要に応じて、インキュベーションを延長。
         2. 血球計数器を使用して、オルガノイド当たりの細胞をカウントし、オルガノイド当たりの細胞数を計算します。約200μmの直径を有するヒト胃オルガノイドは約4,000細胞を持っています。 50のおおよそのMOIでmlの結果につき1×10 ⁹細菌と菌液の0.2μlに注入。
2. オルガノイドの注入。
   注：マイクロインジェクションのために、ガラス針は、マイクロマニピュレータにより3次元的に操作することができるホルダーで安定化されます。オルガノイドは、ウェル内の地下マトリックス内に残っています。ウェル中のサイズと位置にはなく、すべてのオルガノイドは、等しくあります注射にmenable。通常、1つのウェル中で30最大のオルガノイドは5分で標的とすることができます。
   1. 収穫細菌や標準プロトコル²⁴に従って、基礎培地でそれらを洗ってください。
   2. 光学密度に応じて1ml当たりの細菌の数を計算する（ステップ3.1.5.1を参照）。基礎培地1ml当たり1×10 ⁹細菌への細菌を希釈します。
   3. ガラス針を取ります。開口部は10μm程度広いになるように鉗子を使用すると、先端を破ります。
   4. インジェクションホルダーに針を挿入し、マイクロマニピュレーターにそれを修正。
   5. 針に約10μlの菌液を取ります。
   6. 実体顕微鏡下オルガノイド培養液を含有する低エッジに4ウェルプレートを置きます。
   7. マイクロマニピュレーターによるナビゲート、針を持つ単一のオルガノイドをターゲットにしています。オルガノイドの近くに針を配置して、1素早い動きにオルガノイドに針を挿入します。 approximatelを注入yはそれぞれに0.2μlの菌液をマイクロインジェクターを用いて、オルガノイド。
3. どれ分析のための収穫オルガノイド。
   1. 例として、4時間後オルガノイドを修正。上清を除去し、1mlの2％のホルムアルデヒドを添加し、4℃で、RTまたはO / Nで20分間インキュベートします。オルガノイドは、標準的な手順²⁵に従って免疫組織化学のために処理することができます。

Representative Results

このプロトコルは、胃腺（ 図2）の単離を可能にします。腺は、腺はオルガノイド（ 図3）に成長できるように、ラミニンおよびコラーゲンが豊富な3次元フレームワークを提供し、ウェル内ドロップとして固化地下行列、中に播種されています。オルガノイドは、典型的には、小さな嚢胞を開始し、12〜16日以内に、彼らは50〜300ミクロン（ 図4）の直径を有する球状に展開します。いくつかのオルガノイドは、いくつかの小さなbuddingsを開発し、嚢胞性ままになります。後者は通常、健全な成長の文化のサインです。このプロトコルでは、24ウェルプレートの1ウェルは100腺基底行列の50μlの培地500μlのために使用されます。しかし、これは、上方または縮小することができます。

マイクロインジェクションの成功を容易に菌液をオルガノイド（ 図5）を充填し、曇ったように実体顕微鏡下で観察することができます。適切なインキュベーション時間の後、オルガノイドができます任意の所望の分析方法のために処理されます。例えば、オルガノイドをパラフィンに埋め込むことができ、切片を切り出し、標準的な免疫組織化学技術を用いて染色することができます。免疫染色オルガノイドの顕微鏡分析は、細菌の成功注入（ 図6）を示しています。

オルガノイドの通過のために使用される。各パネルでパスツールピペットの図1.画像は 、上側のピペットは、前の火災で狭めた後、下部ピペットです。上側と右側のパネルでスケールは、センチ、ミリメートルである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.代表画像単離されたヒトの胃腺の。スケールバーは100μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3のウェルのスキーム及びヒト胃オルガノイドの代表画像。単離されたヒトの胃腺は、基底行列に分配し、24ウェルプレートのウェルに下がるように配置しました。左下：11日播種後の代表的なウェルの概要。右下：指示された領域の拡大。スケールバーは100μm。胃マウスオルガノイドは¹⁸より速くを展開します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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ヒト胃オルガノイドの図4.代表的な成長。腺は地下の行列と同じオルガノイドの画像に播種し、12日間にわたって撮影しました。スケールバーは100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

胃オルガノイドの図5.マイクロインジェクション。前（左）と内腔への細菌の（右）、マイクロインジェクション時の胃オルガノイドの立体鏡画像。細菌はオルガノイド内部クラウドとして表示されます。スケールバーは200μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6.免疫染色オルガノイド。ヒト胃オルガノイドは 、Hをマイクロインジェクションしました。 ピロリ菌 。 4時間後、オルガノイドをパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋しました。切片は、標準的な組織学的方法²⁵に従って細菌タンパク質の細胞毒性関連遺伝子A（CagAタンパク質）を標的とする抗体を用いて染色しました。左上：代表オルガノイドのイメージ。下のパネル：ボックス部分の拡大。右上：上皮細胞に近い単一の細菌とのボックス部分の拡大この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium
HEPES	Invitrogen	15630-056
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
Matrigel, GFR, phenol free	BD	356231
GlutaMAX	Invitrogen	35050-079	Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
B27	Invitrogen	17504-044	Stock concentration 50 x, final concentration 1x
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Murine recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml
Human recombinant FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml
TGFβi A-83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM
[Leu15]-Gastrin	Sigma-Aldrich	G9145	Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM
RHOKi Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Wnt3A conditioned medium			Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.
R-spondin1 conditioned medium			Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.
Noggin conditioned medium			Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.
R-spondin3	R&D	3500-RS/CF	Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids.
Noggin	Peprotech	120-10	Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids.
TrypLE express	Life Technologies	12605036	Enzymatic dissociation solution
CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers	biocision	BCS-405
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Invitrogen	12648-010
Antibiotics
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.
Other
Tweezers	Neolabs	2-1033	Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.
4 Well Multidishes	Thermo Scientific	144444	You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.
Micromanipulator	Narishige	M-152
Microinjector	Narishige	IM-5B
Stereomicroscope	Leica	MZ75
Workbench	Clean Air		Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition
Capillaries	Harvard Apparatus	GC100T-10	1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter.
Micropipette Puller	Sutter Instruments	Flaming Brown Micropipette Puller
anti Cag A antibody	Santa Cruz	sc-25766