Introduction
De studie van pathogenen berust op adequate modelsystemen voor de in vivo infectie na te bootsen. Voor sommige ziekteverwekkers, zijn adequate modelsystemen ontbreekt, terwijl een deel van de gebruikte systemen zijn verre van optimaal. Een voorbeeld is de maag bacterie Helicobacter pylori (H. pylori), die causaal gerelateerd is aan de ontwikkeling van maagkanker. Maar in afwezigheid van een meer geschikte celcultuur systeem, vele studies die gericht zijn op de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van kanker gebruik van kanker cellijnen, waarbij het eindpunt van de kanker cascade vertegenwoordigen analyseren. Primaire, niet- getransformeerde cellen zou een beter model voor deze studies. Echter, primaire cellen zijn alleen beschikbaar van een klein aantal donoren en kan niet gekweekt over een langere periode van tijd. De laatste jaren heeft stamcellen aanzienlijke vooruitgang nieuwe bronnen van primaire celculturen voor het onderzoek van infectiebiologie verschaffen.
Culturendrie stamcel bronnen zijn gebruikt: Embryonale stamcellen (ESC), geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) of volwassen stamcellen. Ze werden gebruikt voor het modelleren van infecties met virussen zoals cytomegalovirus 1,2 of Hepatitis C Virus 3 - 7, parasieten zoals Plasmodium falciparum 8 of 9 Toxoplasma gondii, en bacteriën, zoals Bacterioides thetaiotaomicron 10 of Salmonella enterica 11. Recentelijk zijn verschillende benaderingen bekend model infectie met H. pylori met organoids afgeleid van ESC of iPS cellen 12, muis volwassen stamcellen 21,22 of menselijke volwassen stamcellen 13-15.
De ontwikkeling van organoïde kweken van volwassen stamcellen afkomstig uit een studie waarin één stamcellen geïsoleerd uit muizen darmepitheel werden geënt in een 3-dimensionale matrix eningebed in medium dat de omgeving van het intestinale stamcellen met mitogeen zoals EGF, R-spondin nagebootst met Wnt signalering en Noggin verbeteren bot morfogeen eiwit (BMP) signalering 16 remmen. Met name deze culturen niet co-cultuur met mesenchymale cellen nodig. In deze omstandigheden is de stamcellen prolifereren en vormen kleine structuren domeinen herbergen cellen van de intestinale crypten en domeinen die de cellen van de darmvlokken bevatten. De organoids dus zelf organiseren om de in vivo situatie na te bootsen. Vandaag de dag kunnen volwassen stamcellen uit vele muizen en menselijke weefsels worden gekweekt in vitro en zichzelf organiseren in organoids dat hun in vivo tegenhanger, lijken zoals dunne darm en dikke darm 17, maag 13,18, 19,20 lever, pancreas 21 en prostaat 22.
Hier bieden we een video-protocol tot cultuur muis of menselijke maag organoids van volwassen stamcellen cells en microinject ze met H. pylori. Dit protocol is gebaseerd op eerdere verslagen 13,18. Deze methode kan worden aangepast voor het kweken en te infecteren andere organoïde culturen zoals intestinale organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oprichting van Gastric organoïde Cultuur
Opmerking: Dit protocol kan worden gebruikt voor het isoleren van maagklieren van muizen- of menselijk weefsel. Het is aangeraden om weefsel van ongeveer 1 cm² gebruiken. Menselijk weefsel kan worden verkregen uit de maag resectie of biopsie.
- Voorbereiding van Materiaal
Opmerking: De gebruikte kelder matrix Matrigel. Houd de kelder matrix op ijs te allen tijde. Bewaar de kelder matrix bij -20 ° C en ontdooien op ijs voor gebruik. Basaal medium verwijst naar geavanceerde DMEM / F12 aangevuld met HEPES; een geschikte Glutaminebron zoals Glutamax en geschikte antibiotica zoals 1x Primocin. De incubator gebruikte standaard celkweek incubator (37 ° C, vochtig gemaakte atmosfeer, 5% CO 2)- Steriliseren voorbereiding gebruiksvoorwerpen autoclaaf of met behulp van 100% isopropylalcohol: scherpe tang, schaar, een scalpel en een glas microscopie glijbaan.
- De dag voor de isolatie, plaats een 24 well celcultuur plaat in de incubator.
- Bereid de kelder matrix volgens de aanbeveling van de fabrikant. Aliquots van 1 ml tot herhaalde vries dooi cycli te voorkomen.
- Bereid 500 ml chelerende buffer en koel op ijs. Bereid 1x buffer uit steriel gedistilleerd water met 5,6 mM Na 2 HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCI, 43,4 mM sucrose, 54,9 mm D-sorbitol, 0,5 mM DL-dithiothreitol (LET), pH 7. Bij de planning van verschillende isolaties, bereiden een 5x geconcentreerde oplossing zonder de DL-dithiothreitol. Filtreer steriel de buffer. Voordat isolatie, te verdunnen de 5x buffer met steriel water tot 1x en voeg DL-dithiothreitol net voor isolatie.
- Bereiden en verdun alle groeifactoren volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Gebruik kleine porties en te voorkomen dat vries-dooi cycli. Functionele groeifactoren zijn cruciaal voor de resultaten.
- Cool basismedium op ijs te koelen en de centrifuge 46; C.
- Warm ander aliquot van basismedium tot 37 ° C.
- Isolatie van Klieren
- Verzamel ongeveer 1 cm² van weefsel in ijskoud basaal medium. Houd op ijs tot voorbereiding. Hoewel het de voorkeur om weefsels zo snel mogelijk te verwerken, opslag in weefsel medium op ijs indien nodig.
- Plaats het weefsel in een 10 cm petrischaal en bedek met koud 1x chelatietherapie buffer. Was door zachtjes heen en weer bewegen.
- Plaats het weefsel in een droge 10 cm Petrischaal. Met behulp van een tang voorzichtig het slijm en de spierlaag verwijderen onder een stereomicroscoop. Was het weefsel in koude 1x chelerende buffer door voorzichtig heen en weer bewegen.
- Plaats 1 cm2 weefsel op een nieuw, droog 10 cm Petrischaal. Met een schaar snijd het in 20-50 kleine stukjes van ongeveer 05/02 mm² grootte.
- Met behulp van een tang, plaatst u alle stukken in een 50 ml buis.
- Neem een steriele 10 ml plastic pipet. Bevochtig de pipet in 1x chelerende buffer. HoudenMet deze zelfde pipet gehele procedure.
- Voeg 10 ml koud 1x chelerende buffer om de 50 ml buis. Was de stukken door krachtig pipetteren en neer 10 keer. Laat de stukken af te wikkelen. Verwijder het supernatant.
- Herhaal het wassen (stap 1.2.7) totdat het supernatans helder is. Dit duurt ongeveer 50-100 ml 1x chelerende buffer voor 1 cm² van menselijk weefsel.
- Incubeer de weefselstukken in 20 ml 1 x chelerende buffer gesupplementeerd met 10 mM EDTA bij kamertemperatuur gedurende 10 min met voorzichtig omkeren elke 2 min.
Opmerking: De tijd en de temperatuur van deze incubatie kan worden geoptimaliseerd voor zowel de snelheid en / of handhaving van glandulaire architectuur. Zij kunnen variëren van enkele uren incubatie bij 4 ° C op een rollende platform 5 min bij 37 ° C in een schudinrichting bij 200 rpm. Geschikt startpunten voor muizen maag 30 min bij 4 ° C op een rollende platform en menselijke maag, 10 min bij kamertemperatuur. - Pipet keer zachtjes op en neer met behulp van de pipet 10 ml. Laat de piECES om zich te vestigen. Verwijder het supernatant.
- Met behulp van de pipet de stukken om een schone 10 cm petrischaal. Verwijder de vloeistof.
- Plaats een glazen microscopie dia bovenop de stukken weefsel. Let op de intact weefsel onder een omgekeerde microscoop voor celkweek met 10x vergroting.
- Oefen druk uit op het glaasje en petrischaal. Houd beide in de hand (met steriele handschoenen) en op het glas met de duim. De rand van het weefsel weergegeven troebel aangeeft dat klieren vrijkomen uit het weefsel.
- Let op de vrijgegeven klieren onder een omgekeerde microscoop voor celkweek met 10x vergroting.
- Verzamel klieren en weefsel in 30 ml koud basaal medium. Laat grote weefselfragmenten vestigen.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof bevattende klieren in twee 15 ml buisjes.
- Centrifugeer 5 minuten bij 200 xg en 4 ° C. Teruggooi supernatant. De pellet bevat geïsoleerde klieren. Houd ze op ijs.
- Zaaien van Klieren
- Alternatief 1: Zaad 6 putjes van een verdunning rij.
- Hang de pellet in 60 ul van de kelder matrix.
- 5 Bereid steriele 1,5 ml buisjes op ijs met elk 50 pi kelder matrix. Breng 10 gl van klieren / kelder matrix suspensie in de eerste 1,5 ml buis. Suspendeer de klieren en breng 10 pl van deze oplossing met de volgende 1,5 ml buis. Herhaal dit voor de volgende buizen.
- Alternatief 2: Seed een berekende hoeveelheid klieren per putje. Begin met 100 klieren per 50 ul kelder matrix in een putje van een plaat met 24 putjes.
- Schorten zorgvuldig het ingehulde klieren in 10 ml basaal medium. Plaats 50 gl op een schone 10 ml petrischaal. Tel het aantal klieren onder een omgekeerde microscoop voor celkweek met 10x vergroting.
- Bereken de concentratie van klieren in de oplossing. Transfer het volume dat Contains 400 klieren om een nieuwe 15 ml buis.
- Centrifugeer 5 minuten bij 200 xg en 4 ° C. Gooi supernatant en houden de buis op ijs. Voeg 200 ul kelder matrix en zorgvuldig mengen. Houden op het ijs.
- Neem de 37 ° C warm 24-well plaat (zie stap 1.1.2) uit de incubator. Plaats een druppel van 50 ui klieren in de kelder matrix in het midden van de put. De druppel zal een koepel te vormen.
- Overdracht van de plaat zorgvuldig terug naar de celkweek incubator. Laat de kelder matrix stollen 10 min.
- Bereid warm medium met alle groeifactoren.
- Voor menselijke klieren: Supplement de basale medium met de volgende groeifactoren voor menselijke maag organoids: 50 ng / ml EGF, 10%-noggin geconditioneerd medium, 10% R-spondin1-geconditioneerd medium, 50% Wnt-geconditioneerd medium, 200 ng / ml fibroblast groeifactor (FGF) 10, 1 nM gastrine en 2 uM TGFbeta remmer en 10 pM-rho geassocieerde coiled coil vormende proteïne serine / threonine kinase inhibitor (RHOKi).
- Voor muizen klieren: Supplement de basale medium met de volgende groeifactoren voor de muis maag organoids: 50 ng / ml EGF, 10%-noggin geconditioneerd medium, 10% R-spondin1-geconditioneerd medium, 50% Wnt-geconditioneerd medium, 100 ng / FGF10 ml, 10 nM gastrine, 0,5 mM TGFbeta remmer en 10 uM RHOKi.
- Neem de plaat uit de incubator. Voeg voorzichtig 500 ul medium met alle groeifactoren (1.3.6) aan elk putje zonder de kelder matrix. Plaats het terug naar de incubator.
- Refresh het medium 3 maal per week (om de 2-3 dagen). Voor verfrissende medium, verwijder de oude medium met het verlaten van de daling van de kelder matrix intact. Voeg verse, warme medium zorgvuldig met alle groeifactoren. Heeft RHOKi niet toevoegen. Slechts voeg RHOKi onmiddellijk na zaaien klieren of na splitsing van de organoids (stap 2).
2. Passage van Gastric organoïde Cultuur Voordat Microinjection.
ove_content "> Opmerking: Elk type organoïde cultuur heeft zijn eigen verdubbeling tijd Muis intestinale evenals maag culturen zijn meestal gesplitst. 1: 5 om de 5-7 dagen Human intestinale culturen worden gesplitst 1:.. 5 elke 10-12 dagen Human maag culturen worden gesplitst 1: 5 per 14 dagen Als gestart vanaf enkele cellen, kan de menselijke maag organoids ook 20 dagen om goed formulier Het is een goed teken als ontluikende structuren rond de centrale lumen In dit protocol, organoids zijn opgesplitst in... 4 well platen voor micro-injectie. Onderhoud van organoids volgt hetzelfde protocol, maar kan geen andere celcultuur plaat, zoals standaard 24 en celcultuur platen gebruiken.- Voorbereiding van Materiaal
- Autoclaaf pasteurpipetten.
- De dag voor passage plaats een 4 goed celkweek plaat in de incubator bij 37 ° C. De 4 well platen hebben een lage randen en laat micromanipulatie.
- Bereid de kelder matrix volgens de aanbeveling van de fabrikant. Op de dag van passaging, ontdooien kelder matrix op ijs.
- Bereiden en verdun alle groeifactoren volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Cool basismedium op ijs te koelen en de centrifuge tot 4 ° C.
- Passage van organoïde Culturen
- Neem de plaat met de organoids uit de incubator. Verwijder medium van de ene ook.
- Voeg 1 ml koude basaal medium naar de kelder matrix in de put. Met behulp van een 1 ml micropipet, krachtig pipet op en neer tot de kelder matrix wordt verdeeld. Dragen aan een 15 ml buis. Plaats op ijs.
- Neem een glas Pasteur pipet en een open bron, zoals een bunsenbrander.
- Houd de punt van de pipet in het vuur tot de opening van de tip is gedaald van 1,5 mm tot ongeveer 0,5 mm (figuur 1). Laat de pipet afkoelen tot kamertemperatuur.
- Bevochtig de pipet in de basale medium. Een optimaal versmalde pipet zal nemen het medium zichtbaar langzamer dan een-un versmald pipet, maar het zal nog steeds allemaalow goed pipetteren.
- Nemen organoids in de pipet en krachtig 10x pipet op en neer. Het breken van de organoids kan worden waargenomen door het oog.
- Voeg 9 ml koude basismedium en centrifugeer 5 min bij 200 xg en 4 ° C.
- Gooi alle bovenstaande zorgvuldig. Hang de pellet in 250 ul kelder matrix. Houden op het ijs.
- Neem de 37 ° C warm 4 en cultuur plaat en plaats een daling van 50 ul organoids / kelder matrix in elk putje.
- Breng de plaat zorgvuldig terug naar de incubator. Laat de kelder matrix stollen bij 37 ° C gedurende 10 min.
- Bereid geschikt medium voor zowel de muis of menselijke organoids zoals vermeld in stap 1.3.6.
- Neem de plaat uit de incubator en overlay elke kelder matrix daling met 500 ul medium.
- Breng de plaat naar de incubator.
- Vernieuw de medium 3 keer per week om de 2-3 dagen (zie 1.3.8.).
- Voor het invriezen van organoids, mechantisch verstoren organoids zoals beschreven voor het splitsen in dit protocol (Stappen 2.2.1-2.2.5.). Hang de organoïde fragmenten in 500 ml bevriezing medium en vriezen tot -80 ° C met behulp van cryobuizen en een bevriezing container. Voor de lange termijn opslag, de overdracht van de buizen om vloeibare stikstof.
- Voor het ontdooien van organoids, de voorbereiding van de cultuur plaat, kelder matrix, groeifactoren, koude en warme medium zoals beschreven in de stappen 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Verwarm de bevroren flesje met behulp van een waterbad, en de overdracht van de cellen direct na ontdooien een buis van 15 ml met 10 ml koud basaal medium. Centrifugeer plaat en de cellen zoals beschreven in 2.2.5 tot 2.2.12.
Opmerking: Micro-injectie van organoids is bewerkelijk, maar laat de unieke mogelijkheid om interactie te bestuderen in 3D. - Als 3D-studies niet nodig zijn, zaad organoids in twee dimensies. Voor deze, verstoren de organoids zoals beschreven in de stappen 2.2.1 tot 2.2.6 vastgelegd. Voeg 2250 ul koude medium met alle groeifactoren tot 250 ul van de kelder matrix met organoïde fragmenten.
- Zaad in 5 putjes van een 24 goed plaat met 500 ul per putje. Verander medium 3 maal per week, met zorgvuldig vervangen van uitsluitend de bovenste 400 pl, naar de kelder matrix aan de onderzijde van de plaat ongestoorde houden.
Opmerking: Organoids zal hechten aan de celkweek plaat en uit te breiden in 2D. Elektronenmicroscopie blijkt dat de apicale zijde van de cellen tegenover het medium in de put (gegevens niet getoond). - Vóór infectie, wisselen alle medium dat kelder matrix, zodat bacteriën hechten aan de cellen. Een soortgelijk protocol werd ook beschreven voor infectie met H. 14 pylori. 2D cel lagen kunnen niet alle celtypen die aanwezig zijn in 3D organoids bevatten.
- Zaad in 5 putjes van een 24 goed plaat met 500 ul per putje. Verander medium 3 maal per week, met zorgvuldig vervangen van uitsluitend de bovenste 400 pl, naar de kelder matrix aan de onderzijde van de plaat ongestoorde houden.
3. Micro-injectie van organoïde Culture.
Opmerking: Dit protocol kan worden gebruikt om bacteriën in microinject organoids. Het kan nuttig zijn om de injectie met organoids beginnendie meer tolerant aan micro-injectie. Zo kan bijvoorbeeld de muis maag organoids groeien tot zeer grote cystic organoids die gemakkelijk te richten zijn.
- Voorbereiding van Materiaal
- Trek een glazen capillaire in twee injectienaalden met behulp van een micropipet trekker, volgens de aanbeveling van de fabrikant. De micropipet trekker de glazen capillaire midden verhitten en de capillair trekken in twee delen, zo werden twee glazen naalden. Het is praktisch om meerdere naalden te trekken en ze in een schone petrischaal.
- Om bacteriële infectie toelaten, verwijdert antibiotica uit alle media gedurende ten minste 3 mediumveranderingen (= één week). Dit zal antibiotica uit de kelder matrix verdunnen. Bij gebruik van een bacteriële stam die resistent is tegen een bepaald antibioticum, voeg deze specifieke antibioticum kans op besmetting te minimaliseren.
- Bereid de werkbank voor micro-injecties. Voor het werken op verschillende bioveiligheid niveaus kan het nodig zijn om een stereo-installatie te plaatsenmicroscoop in een steriele bank. In dit protocol, injecteren H. pylori onder bioveiligheidsniveau 2 voorwaarden onder een stereomicroscoop in een steriele bank.
- Kweken van de bacteriën volgens standaardprotocollen 13,23.
- Om de multipliciteit van infectie (MOI) te schatten, schatten twee parameters: het aantal bacteriën en het aantal cellen per organoïde zoals hieronder beschreven. De MOI kan correleren met resultaten, bijvoorbeeld door hosts IL-8 mRNA expressie 13.
- Om de bacteriële dichtheid in de infectie oplossing berekenen eerst de standaardcurve van de optische dichtheid en kolonievormende eenheden (CFU) volgens standaardprotocollen 24 vast. Een optische dichtheid van 0,1 bij 550 nm moet ongeveer 10 7 CFU / ml verkregen.
- Om het aantal cellen per organoïde schatten, tel aantal organoids in 1 goed. Verstoren organoids zoals beschreven in stappen 2.2.1-2.2.4. Na centrifugeren 5 minuten bij 200 xg en 4 ° C,voeg 1 ml van enzymatische dissociatie oplossing en resuspendeer.
- Incubeer bij 37 ° C met schudden gedurende herhaalde 5-10 min. Bepalen of de cellen zijn gescheiden in enkele cellen onder de microscoop (omgekeerde microscoop zoals Leica DMIL bij 10x vergroting). Eventueel verlengt de incubatie.
- Tellen cellen per organoïde behulp van een hemocytometer en bereken het aantal cellen per organoïde. Menselijke maag organoids met een diameter van ongeveer 200 urn bij benadering 4000 cellen. Injectie van 0,2 pl van een bacteriële oplossing met 1 x 10 9 bacteriën per ml resulteert in een geschatte MOI van 50.
- Injectie van Organoids.
Opmerking: Bij micro-injectie wordt het glas naald gestabiliseerd in een houder, die in 3 dimensies kan worden gemanoeuvreerd door een micromanipulator. Organoids blijven binnen de kelder matrix in de put. Vanwege de grootte en positionering in de put, niet alle organoids even eenmenable injectie. Meestal kan de 30 grootste organoids in een goed gericht in 5 min.- Harvest bacteriën en was ze in basaal medium volgens standaardprotocollen 24.
- Bereken het aantal bacteriën per ml volgens de optische dichtheid (zie stap 3.1.5.1). Verdun de bacteriën 1 x 10 9 bacteriën per ml in basaal medium.
- Neem een glazen naald. Behulp van een tang breekt de punt zodat de opening ongeveer 10 um breed zijn.
- Steek de naald in de injectie-houder en bevestig het aan de micromanipulator.
- Nemen ongeveer 10 ul bacteriële oplossing in de naald.
- Plaats een 4 wells plaat met lage randen bevatten organoïde culturen onder de stereomicroscoop.
- Navigeren met de micromanipulator, richten op een enkele organoids met de naald. Plaats de naald dicht bij de organoïde en steek de naald in de organoïde met een snelle beweging. Injecteren approximately 0,2 gl bacteriële oplossing in elk organoïde met de microinjector.
- Oogst Organoids voor elke analyse.
- Als voorbeeld, fix organoids na 4 uur. Verwijder supernatant en voeg 1 ml 2% formaldehyde en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Organoids kunnen worden verwerkt voor immunohistochemie volgens standaardprocedures 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakt isolatie van maagklieren (figuur 2). Klieren worden gezaaid in de kelder matrix, die vast als druppel binnen een put, die een 3-dimensionale raamwerk rijk aan laminine en collageen om de klieren uitgroeien tot organoids (figuur 3). Organoids beginnen meestal als kleine cysten en binnen 12-16 dagen, ze uit te breiden naar gebieden met een diameter van 50-300 micrometer (Figuur 4). Sommige organoids zal cystic blijven, zullen sommige kleine oculaties ontwikkelen. De laatste is gewoonlijk een teken van een gezond groeiende kweek. In dit protocol een putje van een 24 wells plaat wordt gebruikt voor 100 klieren, 50 pi kelder matrix en 500 pl medium. Dit kan echter up- of verkleind worden.
Het succes van de micro-injectie kan gemakkelijk onder de stereomicroscoop worden waargenomen als troebel, bacteriële oplossing vult de organoïde (figuur 5). Na voldoende incubatietijd, organoids kanworden verwerkt voor elke analysemethode gewenst. Zo kan organoids worden ingebed in paraffine secties kunnen worden gesneden en gekleurd met standaard immunohistochemische technieken. Microscopische analyse van immunostained organoids demonstreren succesvolle injectie van de bacteriën (Figuur 6).
Figuur 1. Beeld van Pasteur pipet gebruikt voor de passage van organoids. In elk paneel, de bovenste pipet is voor de lagere pipet na versmallen door brand. Schaal in de bovenste en rechts panelen is cm en mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. representatief beeld van geïsoleerde menselijke maag klieren. Schaal bar 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Schema van putten en representatief beeld van de menselijke maag organoids. Geïsoleerde menselijke maag klieren werden afgeleverd in de kelder matrix en geplaatst als druppels in putjes van een plaat met 24 putjes. Linksonder: Overzicht van een representatieve goed 11 dagen na het zaaien. Rechtsonder: Uitbreiding van het aangegeven gebied. Schaalbalk 100 micrometer. Maag muis organoids uitbreiden sneller 18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4 "src =" / files / ftp_upload / 53.359 / 53359fig4.jpg "/>
Figuur 4. Typische groei van menselijke maag organoids. Klieren werden geënt in de kelder matrix en beelden van dezelfde organoïde werden genomen over een periode van 12 dagen. Schaalbalk 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Micro-injectie van maag organoids. Stereoscope beelden van een maag organoïde voor (links) en tijdens (rechts) micro-injectie van bacteriën in het lumen. Bacteriën zijn zichtbaar als wolk in de organoïde. Schaalbalk 200 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. immunostained organoids. Menselijk maag organoids werden gemicroinjecteerd met H. pylori. Na 4 uur werden organoids gefixeerd in paraformaldehyde en ingebed in paraffine. Secties werden gekleurd met antilichamen gericht op het bacteriële eiwit cytotoxiciteit geassocieerd gen A (CagA) volgens standaard histologische methoden 25. Linksboven: Beeld van een vertegenwoordiger organoïde. Onderste paneel: Hogere vergroting van de boxed gebied. Rechtsboven:. Hogere vergroting van de boxed gebied met een enkele bacterie in de buurt van de epitheelcellen Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
References
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
- Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
- Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
- Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
- Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
- Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
- McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
- Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
- Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
- Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
- Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
- Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
- Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
