Introduction
Undersøgelsen af patogener beror på passende modelsystemer for at efterligne in vivo-infektion. For nogle smitstoffer, er tilstrækkelige modelsystemer mangler, mens nogle af de anvendte systemer er langt fra optimal. Et eksempel er den gastriske bakterien Helicobacter pylori (H. pylori), som er kausalt relateret til udviklingen af mavekræft. Men i mangel af en mere egnet cellekultur-system, at mange undersøgelser, der sigter analysere de molekylære mekanismer bag udviklingen af kræft brug cancer cellelinjer, som repræsenterer endepunkt af kræft kaskade. Primære, ikke-transformerede celler vil være en bedre model for disse undersøgelser. Imidlertid er kun tilgængelige fra et lille antal donorer primære celler og kan ikke dyrkes over længere perioder. I de senere år har forskning i stamceller gjort betydelige fremskridt at tilvejebringe nye kilder til primære cellekulturer til studiet af infektionsbiologi.
Kulturer fratre stamceller kilder er blevet anvendt: Embryonale stamceller (ESC), inducerede pluripotente stamceller (IPSC) eller voksne stamceller. De er blevet brugt til at modellere infektioner med vira, såsom cytomegalovirus 1,2 eller hepatitis C-virus 3-7, parasitter, såsom Plasmodium falciparum 8 eller Toxoplasma 9, og bakterier, såsom Bacterioides thetaiotaomicron 10 eller Salmonella enterica 11. Senest har flere tilgange blevet offentliggjort at modellere infektion med H. pylori med organoids afledt af ESC eller iPS celler 12, mus voksne stamceller 21,22 eller humane voksne stamceller 13 - 15.
Udviklingen af organoide kulturer fra voksne stamceller stammer fra en undersøgelse, hvor enkelt stamceller isoleret fra murine intestinale epithel blev podet i en 3-dimensionel matrix ogindlejret i medium, der efterlignede miljøet i de intestinale celler, der indeholder stamceller EGF som mitogen, R-spondin kan forbedre Wnt signalering og Noggin at inhibere knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering 16. Især disse kulturer kræver ikke co-kultur med mesenchymale celler. Under disse omstændigheder, stamcellerne prolifererer og danner små strukturer med domæner huser celler af tarmens krypter, og domæner, der indeholder cellerne i tarmen villus. De organoids således selvorganiserende at efterligne in vivo-situationen. I dag kan voksne stamceller fra mange murine og humane væv dyrkes in vitro og selv-organisere sig i organoids der ligner deres in vivo-modstykke, såsom tyndtarmen og tyktarmen 17, mave 13,18, lever 19,20, bugspytkirtel 21 og prostata 22.
Her giver vi en video-protokol til kultur mus eller humane gastriske organoids fra voksne stamceller cells og microinject dem med H. pylori. Denne protokol er baseret på tidligere rapporter 13,18. Denne metode kan tilpasses til dyrkning og inficere andre organoide kulturer såsom tarm organoids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablering af gastrisk organoide Kultur
Bemærk: Denne protokol kan anvendes til isolering af gastriske kirtler fra mus eller humant væv. Det tilrådes at bruge væv på ca. 1 cm. Humant væv kan fås fra gastriske resektioner eller biopsier.
- Fremstilling af materiale
Bemærk: Den anvendte kælderen matrix er Matrigel. Hold kælderen matrix på is på alle tidspunkter. Opbevar kælderen matrix ved -20 ° C og optøs på is før anvendelse. Basal medium henviser til Advanced DMEM / F12 suppleret med HEPES; en passende glutamin kilde, såsom Glutamax og passende antibiotika såsom 1x Primocin. Inkubatoren anvendes, er en standard cellekultur inkubator (37 ° C, befugtet atmosfære, 5% CO 2)- Sterilisere forberedelse redskaber ved autoklavering eller ved hjælp af 100% isopropylalkohol: skarpe pincet, saks, en skalpel og et glas mikroskopi dias.
- Dagen før isolering, placere en 24 well celledyrkningspladen i inkubatoren.
- Forbered kælderen matrix ifølge producenternes anbefaling. Forbered portioner på 1 ml for at undgå gentagne fryse tø cykler.
- Forbered 500 ml chelaterende buffer og køligt på is. Forbered 1x puffer fra sterilt destilleret vand med 5,6 mM Na 2 HPO 4, 8,0 mM KH 2 PO 4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCI, 43,4 mM saccharose, 54,9 mM D-sorbitol, 0,5 mM DL-dithiothreitol (PAS), pH 7. Hvis planlægning flere isolationer, forberede en 5x koncentreret løsning uden DL-dithiothreitol. Sterilfilter bufferen. Før isolering, fortynd 5x buffer med sterilt vand til 1x og tilføj DL-dithiothreitol lige før isolation.
- Forberede og fortyndes alle vækstfaktorer ifølge producentens anbefalinger. Brug små portioner og undgå fryse-tø cykler. Funktionelle vækstfaktorer er afgørende for resultaterne.
- Cool basalt medium på is og afkøles centrifugen til 46; C.
- Varm anden portion af basalt medium til 37 ° C.
- Isolering af Kirtler
- Saml ca 1 cm af væv i iskold basalt medium. Hold på is indtil forberedelse. Selv om det foretrækkes at behandle væv så hurtigt som muligt, opbevares væv i medium på is, hvis det er nødvendigt.
- Placer vævet i en 10 cm petriskål og dække det med koldt 1x kelation buffer. Vask ved forsigtigt at flytte frem og tilbage.
- Placer vævet i en tør 10 cm petriskål. Ved hjælp af pincet, forsigtigt fjerne slim samt musklen lag under et stereomikroskop. Vask vævet i koldt 1x chelaterende puffer ved forsigtigt at bevæge sig frem og tilbage.
- Placer 1 cm2 væv på en ny, tør 10 cm petriskål. Brug af saks skære det i 20-50 små stykker på ca. 2-5 mm² størrelse.
- Ved hjælp af pincet, placere alle brikkerne i et 50 ml rør.
- Tag en steril 10 ml plastik pipette. Fugt pipetten i 1x chelaterende buffer. Holdved hjælp af denne samme pipette under hele proceduren.
- Tilsæt 10 ml kold 1x chelaterende buffer til 50 ml rør. Vask stykkerne ved kraftig pipettering op og ned 10 gange. Lad stykkerne sig. Supernatanten fjernes.
- Gentag vask (trin 1.2.7), indtil bundfaldet er klar. Dette tager ca. 50-100 ml 1x chelaterende puffer til 1 cm af humant væv.
- Inkubér vævsstykker i 20 ml 1x chelaterende puffer suppleret med 10 mM EDTA ved stuetemperatur i 10 minutter under forsigtig invertering hver 2 min.
Bemærk: Tid og temperatur af denne inkubation kan optimeres til enten hastighed og / eller konservering af glandulær arkitektur. De kan variere fra flere timer ved 4 ° C på en rullende platform til 5 minutter ved 37 ° C i et rysteapparat med 200 omdrejninger i minuttet. Gode udgangspunkter for muse maven er 30 minutter ved 4 ° C på en rullende platform og for menneskelige mave, 10 minutter ved stuetemperatur. - Pipette engang forsigtigt op og ned ved hjælp af 10 ml pipette. Lad piECEs at bosætte. Kassér supernatanten.
- Ved hjælp af pipette brikkerne til en ren 10 cm petriskål. Fjerne væsken.
- Placer et glas mikroskopi slide på toppen af væv stykker. Overhold intakt væv under en omvendt mikroskop for cellekultur med 10X forstørrelse.
- Lægge pres på objektglas og petriskål. Hold både i hånden (med sterile handsker) og trykke på glasset med tommelfingeren. Kanten af vævet vises overskyet indikerer, at kirtler frigives ud af vævet.
- Overhold de frigivne kirtler under en omvendt mikroskop for cellekultur med 10X forstørrelse.
- Saml kirtler og væv i 30 ml koldt basalt medium. Lad store vævsfragmenter bundfælde sig.
- Opsaml supernatanten indeholdende kirtler i to 15 ml rør.
- Centrifuger i 5 minutter ved 200 xg og 4 ° C. Supernatanten kasseres. Pelleten indeholder isolerede kirtler. Hold dem på is.
- Såning af Kirtler
- Alternativ 1: Seed 6 brønde i en fortynding række.
- Hæng pellet i 60 ul kælderen matrix.
- Forbered 5 sterile 1,5 ml rør på is med hver indeholdende 50 pi kælderen matrix. Transfer 10 pi kirtler / kælderen matrix suspensionen i den første 1,5 ml rør. Suspendere kirtler og overføre 10 pi af denne opløsning til den næste 1,5 ml rør. Gentag for de næste rør.
- Alternativ 2: Seed en beregnet mængde af kirtler per brønd. Start med 100 kirtler per 50 pi kælderen matrix i en brønd i en plade med 24 brønde.
- Suspendere forsigtigt de pelleterede kirtler i 10 ml basalmedium. Placer 50 pi på en ren 10 ml petriskål. Tæl antallet af kirtler under et inverteret mikroskop for cellekultur med 10X forstørrelse.
- Beregn koncentrationen af kirtler i opløsningen. Overfør den lydstyrke, contains 400 kirtler til en ny 15 ml rør.
- Centrifuger i 5 minutter ved 200 xg og 4 ° C. Supernatanten kasseres, og holde røret på is. Tilsæt 200 pi kælderen matrix og omhyggeligt resuspender. Hold på is.
- Tag 37 ° C varm plade med 24 brønde (se trin 1.1.2) fra inkubatoren. Placer en dråbe af 50 pi kirtler i kælderen matrix i centrum af brønden. Dråben vil danne en kuppel.
- Overføre forsigtigt pladen tilbage til cellekulturen inkubator. Lad kælderen matrix størkne 10 min.
- Forbered varm medium med alle vækstfaktorer.
- For humane kirtler: Supplement basalmediet med følgende vækstfaktorer for humane gastriske organoids: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditioneret medium, 10% R-spondin1-medium, 50% Wnt-konditioneret medium, 200 ng / ml fibroblast-vækstfaktor (FGF) 10, 1 nM gastrin og 2 uM TGFbeta inhibitor og 10 uM rho-associeret coiled-coil danner protein serin / threonin-kinase inhibitor (RHOKi).
- For murine kirtler: Supplement basalmediet med følgende vækstfaktorer for mus gastrisk organoids: 50 ng / ml EGF, 10% noggin-konditioneret medium, 10% R-spondin1-medium, 50% Wnt-konditioneret medium, 100 ng / ml FGF10, 10 nM gastrin, 0,5 mM TGFbeta inhibitor og 10 uM RHOKi.
- Tag pladen fra inkubatoren. Derefter tilsættes forsigtigt 500 pi medium med alle vækstfaktorer (1.3.6) til hver brønd uden at forstyrre kælderen matrix. Placer den tilbage til kuvøsen.
- Opdater mellemlang 3 gange om ugen (hver 2-3 dage). Til forfriskende medium, fjerne den gamle medium med at forlade dråbe kælderen matrix intakt. Tilsættes forsigtigt frisk, varm medium med alle vækstfaktorer. Tilsæt ikke RHOKi. Kun tilføje RHOKi direkte efter såning af kirtler eller efter spaltning af organoids (trin 2).
2. Passage af gastrisk organoide Kultur Før Mikroinjektion.
ove_content "> Bemærk: Hver type organoide kultur har sin egen fordobling tid Mus tarm samt gastrisk kulturer er som regel delt 1:. 5 hver 5-7 dage Humane tarm kulturer er opdelt 1:.. 5 hver 10-12 dage Menneskelig gastrisk kulturer er opdelt 1: 5 hver 14. dag, hvis initieret fra enkelte celler, kan humane gastriske organoids også tage 20 dage til at danne ordentligt Det er et godt tegn, hvis spirende strukturer omgiver den centrale lumen I denne protokol, er organoids delt i... 4 brønde til mikroinjektion. Vedligeholdelse af organoids følger den samme protokol, men kan bruge en hvilken som helst anden cellekultur plade, såsom standard cellekultur plader 24 godt.- Fremstilling af materiale
- Autoklave Pasteur-pipetter.
- Dagen før passage, placere en 4 cellekulturplade pladen i inkubatoren ved 37 ° C. De 4 brøndsplader har lave kanter og tillade mikromanipulering.
- Forbered kælderen matrix ifølge producenternes anbefaling. På dagen for passaging, tø kælderen matrix på is.
- Forberede og fortyndes alle vækstfaktorer ifølge producentens anbefalinger.
- Cool basalt medium på is og afkøles centrifugen til 4 ° C.
- Passage af organoide kulturer
- Tag pladen med organoids fra inkubatoren. Fjern mediet fra en brønd.
- Der tilsættes 1 ml koldt basalt medium til kælderen matrix i brønden. Anvendelse af en 1 ml mikropipette, kraftigt pipettere op og ned, indtil kælderen matrix er brudt op. Overføres til en 15 ml rør. Placer på is.
- Tag et glas Pasteur-pipette og en brand kilde, såsom en bunsenbrænder.
- Hold spidsen af pipetten ind i ilden indtil åbningen af spidsen har indsnævret fra 1,5 mm til ca. 0,5 mm (figur 1). Lad pipetten køligt til stuetemperatur.
- Fugt pipetten i basalt medium. En optimalt indsnævret pipette vil tage mediet synligt langsommere end en un-indsnævret pipette, men det vil stadig allevordan pipettering godt.
- Tage op organoids i pipetten og energisk pipettere 10x op og ned. Bruddet på organoids kan observeres med det blotte øje.
- Tilføj 9 ml koldt basalt medium og centrifugeres i 5 minutter ved 200 xg og 4 ° C.
- Kassere omhyggeligt alle supernatant. Hæng pellet i 250 pi kælder matrix. Hold på is.
- Tag 37 ° C varm 4 brønds dyrkningsplade og placere en dråbe af 50 pi organoids / kælder matrix i hver brønd.
- Overfør pladen forsigtigt tilbage til inkubatoren. Lad kælderen matrix størkne ved 37 ° C i 10 minutter.
- Forbered passende medium til enten mus eller humane organoids som anført i trin 1.3.6.
- Tag pladen fra inkubatoren og overlay hver kælder matrix dråbe med 500 pi medium.
- Overfør pladen til inkubatoren.
- Opdater mediet 3 gange om ugen hver 2-3 dage (se 1.3.8.).
- Til frysning af organoids, mechantisk forstyrre organoids som beskrevet for opdeling i denne protokol (trin 2.2.1-2.2.5.). Suspendere de organoide fragmenter i 500 ml frysning medium og fryse til -80 ° C ved hjælp af kryorør og en indefrysning beholder. Til langtidsopbevaring, overføre rørene til flydende nitrogen.
- Til optøning af organoids, forberede kultur plade, kælder matrix, vækstfaktorer, koldt og varmt medium som beskrevet i trin 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. Varm den frosne hætteglas under anvendelse af et vandbad, og overfør celler umiddelbart efter optøning til et 15 ml rør med 10 ml koldt basalt medium. Centrifuger og plade cellerne som skitseret i 2.2.5 til 2.2.12.
Bemærk: mikroinjektion af organoids er besværlig, men tillader en unik mulighed for at studere interaktionen i 3D. - Hvis 3D-undersøgelser, der ikke er nødvendige, frø organoids i to dimensioner. Til dette forstyrre organoids som angivet i trin 2.2.1 til 2.2.6. Tilføj 2.250 pi kold medium med alle vækstfaktorer til 250 pi kælderen matrix med organoide fragmenter.
- Frø i 5 brønde i en plade med 24 brønde med 500 pi per brønd. Skift medium 3 gange om ugen, med omhyggeligt kun at erstatte de øverste 400 pi, for at holde kælderen matrix på bunden af pladen uforstyrret.
Bemærk: Organoids vil knytte til celledyrkningspladen og ekspandere i 2D. Elektronmikroskopi viser, at den apikale side af cellerne vender mediet i brønden (data ikke vist). - Før infektion, udveksle alle medium, herunder kælder matrix, for at tillade bakterier til at knytte til cellerne. En lignende protokol er også blevet beskrevet for infektion med H. pylori 14. 2D cellelag må ikke indeholde alle celletyper, som er til stede i 3D organoids.
- Frø i 5 brønde i en plade med 24 brønde med 500 pi per brønd. Skift medium 3 gange om ugen, med omhyggeligt kun at erstatte de øverste 400 pi, for at holde kælderen matrix på bunden af pladen uforstyrret.
3. Mikroinjektion af organoide Kultur.
Bemærk: Denne protokol kan bruges til at microinject bakterier i organoids. Det kan være nyttigt at starte injektion med organoidsder er mere tolerante mikroinjektion. For eksempel kan muse gastriske organoids vokse til meget store cystisk organoids der er nemme at målrette.
- Fremstilling af materiale
- Træk et glas kapillar i to kanyler ved hjælp af en mikropipette aftrækker, ifølge fabrikanterne anbefaling. Mikropipetten aftrækker vil opvarme kapillarrøret i midten og vil trække kapillarrøret i to dele, hvorved der dannes to glas nåle. Det er praktisk at trække flere nåle og gemme dem i et rent petriskål.
- At tillade bakteriel infektion, fjerne antibiotika fra alle medier i mindst 3 mellemstore ændringer (= en uge). Dette vil fortynde antibiotika fra kælderen matrix. Hvis anvendelse af en bakteriestamme, der er resistent over for et bestemt antibiotikum, tilføje denne specifikke antibiotikum for at minimere risikoen for forurening.
- Forbered arbejdet bænk til mikroinjektioner. For arbejde på forskellige biosikkerhed niveauer kan det være nødvendigt at placere en stereomikroskop inde i en steril bænk. I denne protokol, injicere H. pylori under biosikkerhed niveau 2 betingelser et stereomikroskop inde i en steril bænk.
- Kultur bakterierne i overensstemmelse med standardprotokoller 13,23.
- For at estimere infektionsmultiplicitet (MOI) estimerer to parametre: Antallet af bakterier og antallet af celler pr organoide som skitseret nedenfor. MOI kan korrelere med resultater, for eksempel med værter IL-8-mRNA-ekspression 13.
- For at beregne den bakterietætheden i infektionen opløsningen, først oprette standardkurven af optiske tæthed og kolonidannende enheder (CFU) i overensstemmelse med standardprotokoller 24. En optisk densitet på 0,1 ved 550 nm bør give cirka 10 7 CFU / ml.
- For at estimere antallet af celler pr organoide, tælle antallet af organoids i 1 godt. Forstyrre organoids som skitseret i trin 2.2.1-2.2.4. Efter centrifugering i 5 minutter ved 200 xg og 4 ° C,tilsættes 1 ml enzymatisk dissociation løsning og resuspender.
- Der inkuberes ved 37 ° C ved gentagen rystning i 5-10 min. Undersøg, om cellerne er dissocieret til enkelte celler under mikroskop (inverteret mikroskop som Leica DMIL på 10X forstørrelse). Om nødvendigt kan forlænges inkubationen.
- Tæl celler pr organoide anvendelse af et hæmocytometer og beregne antallet af celler pr organoide. Humane gastriske organoids med en diameter på omkring 200 um har ca. 4.000 celler. Injektion af 0,2 pi af en bakterieopløsning med 1 x 10 9 bakterier per ml resulterer i en omtrentlig MOI på 50.
- Injektion af Organoids.
Bemærk: mikroinjektion, er glasset nål stabiliseret i en holder, der kan manøvreres i 3 dimensioner ved en mikromanipulator. Organoids forbliver inden kælderen matrix inden i brønden. På grund af størrelsen og positionering i brønden, ikke alle er lige organoids enmenable injektion. Normalt kan de 30 største organoids i en brønd målrettes i 5 min.- Harvest bakterier og vaske dem i basalt medium i overensstemmelse med standardprotokoller 24.
- Beregne antallet af bakterier pr ml ifølge den optiske tæthed (se trin 3.1.5.1). Fortynd bakterierne til 1 x 10 9 bakterier per ml i basalt medium.
- Tag et glas nål. Ved anvendelse af pincetter bryde spidsen, således at åbningen bliver ca. 10 um brede.
- Stik nålen ind indehaveren af indsprøjtning og ordne det til mikromanipulator.
- Tag op ca. 10 pi bakteriel løsning i nålen.
- Placer en 4 brønds plade med lave kanter indeholder organoide kulturer under stereomikroskop.
- Navigation med mikromanipulator, målrette en enkelt organoids med nålen. Placer nålen tæt på organoide og derefter indsætte nålen ind i organoide med en hurtig bevægelse. Sprøjt approximately 0,2 pi bakterieopløsning i hver organoide hjælp af mikroinjektor.
- Harvest Organoids for enhver analyse.
- Som eksempel fix organoids efter 4 timer. Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml 2% formaldehyd og inkuberes 20 minutter ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Organoids kan behandles for immunhistokemi henhold til standardprocedurer 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol tillader isolering af gastriske kirtler (figur 2). Kirtler podes i kælderen matrix, der størkner som drop i en brønd, hvilket giver en 3-dimensionel ramme rig på laminin og kollagen at tillade kirtler vokse ind organoids (figur 3). Organoids starter typisk som små cyster og inden 12-16 dage, udvider de sig til kugler med en diameter på 50-300 um (figur 4). Nogle organoids vil forblive cystisk, nogle vil udvikle små buddings. Sidstnævnte er normalt et tegn på en sund voksende kultur. I denne protokol én brønd i en plade med 24 brønde anvendes til 100 kirtler, 50 pi kælderen matrix og 500 pi medium. Men dette kan være op- eller nedskaleres.
Succesen af mikroinjektion kan let observeres under stereomikroskop som uklar, bakterieopløsning fylder organoide (figur 5). Efter tilstrækkelig inkubationstid, kan organoidsforarbejdes til enhver ønsket analysemetode. For eksempel kan organoids blive indlejret i paraffin, kan sektioner skåret og farvet under anvendelse af standard immunhistokemiske teknikker. Mikroskopisk analyse af immunofarvede organoids demonstrerer den vellykkede injektion af bakterier (figur 6).
Figur 1. Billede af Pasteur-pipette anvendes til passage af organoids. I hvert panel, den øverste pipetten er før, jo lavere pipette efter indsnævring af ilden. Skala i øvre og højre paneler er cm og mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. repræsentativt billede af isolerede humane gastriske kirtler. Målestok 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skema over brønde og repræsentativt billede af humane gastriske organoids. Isolerede humane gastriske kirtler blev dispenseret i kælderen matrix og placeret som dråber i brønde på en plade med 24 brønde. Nederst til venstre: Oversigt over en repræsentativ godt 11 dage efter podning. Nederste højre: Udvidelse af det angivne område. Målestokken 100 um. Gastric mus organoids ekspandere hurtigere 18. Klik her for at se en større version af dette tal.
4 "src =" / files / ftp_upload / 53359 / 53359fig4.jpg "/>
Figur 4. Typisk væksten af humane gastriske organoids. Kirtler blev podet i kælderen matrix og billeder af det samme organoide blev taget over en periode på 12 dage. Skala bar 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. mikroinjektion af gastriske organoids. Stereoskopet billeder af en gastrisk organoide før (til venstre) og under (højre) mikroinjektion af bakterier ind i lumen. Bakterier er synlige som cloud inde i organoide. Scale bar 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. immunfarvet organoids. Humane gastriske organoids blev mikroinjiceret med H. pylori. Efter 4 timer blev organoids fikseret i paraformaldehyd og indlejret i paraffin. Sektioner blev farvet ved anvendelse af antistoffer rettet mod det bakterielle protein Cytotoksicitet associerede gen A (CagA) ifølge standardprocedurer histologiske metoder 25. Øverst til venstre: Billede af en repræsentativ organoide. Lavere panel: Højere forstørrelse af indrammede areal. Øverst til højre:. Højere forstørrelse af indrammede område med en enkelt bakterie tæt på de epitelceller Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
References
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
- Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
- Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
- Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
- Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
- Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
- McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
- Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
- Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
- Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
- Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
- Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
- Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
