Introduction
המחקר של פתוגנים מסתמך על מערכות מודל הולמות לחקות את זיהום in vivo. לכמה סוכנים מזהמים, מערכות מודל הולמות חסרות בעוד שחלק מהמערכות המשמשות הן רחוקות מלהיות אופטימלי. דוגמא אחת היא החיידק הליקובקטר פילורי בקיבה (הליקובקטר פילורי), אשר קשור בקשר סיבתי להתפתחות סרטן קיבה. עם זאת, בהיעדר מערכת תרבית תאים מתאימה יותר, מחקרים רבים שהמטרה לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס שורות תאי סרטן שימוש התפתחות הסרטן, המייצגים את נקודת הקצה של המפל הסרטני. תאים ראשוניים, שאינם-שינה יהיו מודל טוב יותר ללימודים אלה. עם זאת, תאים ראשוניים זמינים רק ממספר קטן של תורמים ולא יכולים להיות מתורבת על פני תקופות זמן ארוכות יותר. בשנים האחרונות, מחקר בתאי גזע יש התקדמות משמעותית כדי לספק מקורות חדשים לתרביות תאים ראשוניות לחקר הביולוגיה זיהום.
תרבויות משלושה מקורות תאי גזע שימשו: תאי גזע עובריים (ESC), תאי מושרה pluripotent גזע (iPSC) או בתאי גזע בוגרים. הם היו בשימוש מודל זיהומים בוירוסים, כגון וירוס ציטומגלווירוס 1,2 או הפטיטיס C 3 - 7, טפילים, כגון falciparum Plasmodium 8 או Toxoplasma gondii 9, וחיידקים, כגון Bacterioides thetaiotaomicron 10 או 11 enterica סלמונלה. לאחרונה, כמה גישות פורסמו מודל זיהום עם ה ' פילורי עם organoids שמקורם בתאי iPS ESC או 12, בתאי גזע בוגרים עכבר 21,22 או אדם בתאי גזע בוגרים 13-15.
הפיתוח של תרבויות organoid מתאי גזע בוגרים שמקורם מחקר, שבו תאי גזע בודדים המבודדים מאפיתל במעי עכברי היו זרע לתוך מטריצת 3 ממדים ומשובץ במדיום שחיקה את הסביבה של תאי גזע במעי המכילים EGF כmitogen, R-spondin כדי לשפר איתות Wnt ובחור! לעכב חלבון מורפוגני העצם (BMP) איתות 16. יש לציין תרבויות אלה אינן דורשות שיתוף תרבות עם תאי mesenchymal. בתנאים אלה, תאי הגזע להתרבות וליצור מבנים קטנים עם תחומים מחסה תאים של מאורות מעיים, ותחומים המכילים את התאים של סיסי מעיים. Organoids כך עצמי לארגן לחקות את המצב בvivo. היום, ניתן לגדל תאי גזע בוגרים מרבים עכברי ורקמות אנושיות במבחנה ועצמית לארגן לorganoids דומה לעמיתם in vivo, כגון מעי דק ומעי גס 17, בטן 13,18, כבד 19,20, לבלב 21 ו ערמונית 22.
כאן אנו מספקים וידאו פרוטוקול לעכבר תרבות או organoids קיבה אנושי מcel גזע בוגריםls וmicroinject עם ה ' פילורי. פרוטוקול זה מבוסס על דיווחים קודמים 13,18. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לculturing ומדביק תרבויות organoid אחרות כגון organoids מעיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמת הקיבה Organoid התרבות
הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש לבידוד של בלוטות קיבה מעכבר או רקמה אנושית. מומלץ להשתמש ברקמות של כ 1 סמ"ר. ניתן להשיג רקמה אנושית מכריתות או ביופסיות קיבה.
- הכנת החומר
הערה: מטריצת המרתף המשמשת היא Matrigel. שמור את מטריצת המרתף על קרח בכל העת. אחסן את מטריצת המרתף ב -20 ° C ולהפשיר על קרח לפני השימוש. בינוני בסל מתייחס למתקדם DMEM / F12 בתוספת HEPES; מקור גלוטמין מתאים כגון Glutamax ואנטיביוטיקה מתאימה כגון 1x Primocin. החממה משמשת היא חממת תרבות תא סטנדרטית (37 ° C, אווירת humidified, 5% CO 2)- לעקר כלים הכנה ידי מעוקר או באמצעות 100% אלכוהול איזופרופיל: מלקחיים חדים, מספריים, סכין מנתחים ושקופיות מיקרוסקופ זכוכית.
- היום לפני הבידוד, מקום wel 24צלחת תרבית תאי L בחממה.
- הכן את מטריצת המרתף על פי ההמלצה של יצרנים. הכן aliquots של 1 מיליליטר, כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה חוזרים ונשנים.
- הכן 500 מיליליטר chelating חיץ ומגניב על קרח. הכן חיץ 1x ממים מזוקקים סטריליים עם 5.6 מ"מ Na 2 HPO 4, 8.0 מ"מ KH 2 PO 4, 96.2 מ"מ NaCl, 1.6 מ"מ KCl, 43.4 מ"מ סוכרוז, 54.9 מ"מ D-סורביטול, 0.5 מ"מ DL-dithiothreitol (זהירות), pH 7. אם מתכננים כמה בידודים, להכין פתרון מרוכז 5x ללא DL-dithiothreitol. סינון סטרילי החיץ. לפני הבידוד, לדלל את החיץ 5x עם מים סטריליים ל1x ולהוסיף DL-dithiothreitol רק לפני הבידוד.
- הכן ולדלל את כל גורמי הגדילה על פי ההמלצות של יצרנים. השתמש aliquots הקטן בגודל ולהימנע להקפיא להפשיר מחזורים. גורמי גדילה פונקציונליים הם קריטיים לתוצאות.
- בינוני מגניב בסיסית על קרח ולקרר את צנטריפוגות כדי 46; ג.
- לחמם aliquot אחר של מדיום בסיס 37 ° C.
- בידוד של בלוטות
- לאסוף כ 1 סמ"ר של רקמה במדיום בסיסי קר כקרח. שמור על קרח עד הכנה. למרות שזה עדיף לעבד רקמה בהקדם האפשרי, רקמות חנות במדיום על קרח במידת צורך.
- הנח את הרקמה בצלחת פטרי 10 סנטימטרים ולכסות אותו עם חיץ קלאציה 1x הקר. לשטוף בעדינות על ידי נע קדימה ואחורה.
- הנח את הרקמה בצלחת פטרי 10 סנטימטרים יבשה. בעזרת מלקחיים, להסיר את הריר, כמו גם את שכבת השריר בזהירות תחת סטראו. שטוף את הרקמה במאגר chelating 1x הקר בעדינות על ידי נע קדימה ואחורה.
- מניחים 2 סנטימטר רקמה 1 על צלחת חדשה, יבשה 10 סנטימטרים פטרי. מספריים שימוש לחתוך אותו לחתיכות קטנות 20-50 של כ 2-5 מ"מ ² גודל.
- בעזרת מלקחיים, למקם את כל החלקים לתוך צינור 50 מיליליטר.
- קח טפטפת פלסטיק 10 מיליליטר סטרילי. להרטיב את פיפטה במאגר chelating 1x. שמורבאמצעות זה אותו פיפטה לאורך כל ההליך.
- להוסיף 10 מיליליטר חיץ chelating 1x קר לשפופרת 50 מיליליטר. שטוף את החתיכות על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים. בואו החתיכות להתיישב. הסר את supernatant.
- חזור כביסה (צעד 1.2.7) עד supernatant ברורה. זה לוקח בערך 50-100 מיליליטר של חיץ chelating 1x לסמ"ר 1 של רקמה אנושית.
- דגירה חתיכות הרקמה ב 20 מיליליטר 1x חיץ chelating בתוספת 10 mM EDTA ב RT במשך 10 דקות עם היפוך עדין כל 2 דקות.
הערה: זמן וטמפרטורה של דגירה זה יכול להיות מותאם לשתי מהירות ו / או שימור של אדריכלות בלוטות. הם יכולים לנוע בין כמה שעות דגירה על 4 מעלות צלזיוס בפלטפורמה מתגלגלת עד 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס שייקר עם 200 סל"ד. נקודות פתיחה טובות לקיבה עכבר הן 30 דקות ב 4 ° C על פלטפורמה מתגלגלת ולקיבת אדם, 10 דקות ב RT. - פיפטה פעם בעדינות מעלה ומטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר. לאפשר pieces להתיישב. בטל supernatant.
- באמצעות פיפטה, להעביר את החתיכות לצלחת פטרי 10 סנטימטרים נקי. הסר את הנוזל.
- מקום שקופית מיקרוסקופ זכוכית על גבי פיסות הרקמה. שים לב לרקמות שלמות תחת מיקרוסקופ הפוכה לתרבית תאים עם הגדלה 10X.
- תפעיל לחץ על שקופיות הזכוכית וצלחת פטרי. להחזיק בשתי ביד (עם כפפות סטריליות) ולחיצה על הזכוכית עם האגודל. השפה של הרקמה תופיע מעונן מצביעה על כך שהבלוטות משתחררות מהרקמות.
- שים לב לבלוטות שוחררו תחת מיקרוסקופ הפוכה לתרבית תאים עם הגדלה 10X.
- לאסוף בלוטות ורקמות במדיום בסיסי קר 30 מיליליטר. בואו ברי רקמה גדולים ליישב.
- לאסוף את supernatant המכיל בלוטות בשני צינורות 15 מיליליטר.
- דקות צנטריפוגה 5 ב XG 200 ו 4 מעלות צלזיוס. supernatant מחק. גלולה מכילה בלוטות מבודדות. לשמור אותם על קרח.
- זריעה של בלוטות
- זרע 6 בארות של שורת דילול: 1 אלטרנטיבי.
- להשעות את גלולה ב -60 μl של מטריצת מרתף.
- הכן 5 צינורות 1.5 מיליליטר סטרילי על קרח עם כל 50 μl מכיל מטריצה של מרתף. העברה 10 μl של השעיה מטריצת בלוטות / מרתף לתוך צינור 1.5 מיליליטר הראשון. להשעות את הבלוטות ולהעביר 10 μl של פתרון זה לצינור 1.5 מיליליטר הבא. חזור לצינורות הבאים.
- חלופה 2: זרעי סכום מחושב של בלוטות לכל טוב. התחל עם כל מטריצת מרתף 50 μl 100 בלוטות ובאחד מצלחת גם 24.
- להשעות בזהירות את בלוטות pelleted במדיום בסיס 10 מיליליטר. מניחים 50 μl על צלחת פטרי 10 מיליליטר נקי. ספירת מספר הבלוטות תחת מיקרוסקופ הפוכה לתרבית תאים עם הגדלה 10X.
- חשב את הריכוז של בלוטות בפתרון. העבר את הנפח conta שתוספות 400 בלוטות לצינור 15 מיליליטר חדש.
- דקות צנטריפוגה 5 ב XG 200 ו 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant ולשמור על הצינור על קרח. הוסף 200 מטריצת מרתף μl וresuspend בזהירות. שמור על קרח.
- קח את צלחת 24 גם 37 ° C החם (ראה שלב 1.1.2) מהחממה. מניחים ירידה של 50 בלוטות μl אחד במטריצת מרתף במרכז הבאר. הירידה תהווה כיפה.
- להעביר את הצלחת בזהירות חזרה לתרבית תאי החממה. בואו מטריצת המרתף לחזק 10 דקות.
- להכין מדיום חם עם כל גורמי הגדילה.
- לבלוטות אדם: מזון בינוני הבסיסית עם הגורמים הבאים הצמיחה לorganoids קיבה אנושית: 50 ng / ml EGF, 10% בינוניים-מותנה שהגולגולת, 10% בינוניים מזגן R-spondin1, 50% בינוניים מזגן Wnt, 200 ng / גורם מיליליטר צמיחת פיברובלסטים (FGF) 10, 1 gastrin ננומטר, ומעכב TGFbeta 2 מיקרומטר וסרין 10 מיקרומטר חלבון / קינאז תראונין סליל מפותל יוצרים הקשורים Rho מעכב (RHOKi).
- לבלוטות עכברי: להשלים את המדיום הבסיסי עם הגורמים הבאים הצמיחה לorganoids קיבה עכבר: 50 ng / ml EGF, 10% בינוניים-מותנה שהגולגולת, 10% R-spondin1 מיזוג בינוני, 50% בינוניים מזגן Wnt, 100 ng / מיליליטר FGF10, 10 gastrin ננומטר, 0.5 מ"מ מעכב TGFbeta וRHOKi 10 מיקרומטר.
- קח את הצלחת מן החממה. בזהירות להוסיף 500 בינוני μl עם כל גורמי הגדילה (1.3.6) זה טוב מבלי להפריע מטריצת המרתף. מניחים אותו בחזרה לחממה.
- רענן 3 פעמים בינוניות בשבוע (כל 2-3 ימים). לרענון בינוני, להסיר את המדיום הישן עם עוזב את הירידה של מטריצת מרתף שלמה. בזהירות להוסיף בינוני טרי, חם עם כל גורמי הגדילה. אל תוסיף RHOKi. להוסיף רק RHOKi ישירות לאחר הזריעה של בלוטות או לאחר הפיצול של organoids (שלב 2).
2. מעבר של הקיבה Organoid תרבות לפני Microinjection.
ove_content "> הערה: בכל סוג של תרבות organoid יש זמן ההכפלה שלה עכבר מעיים כמו גם תרבויות קיבה בדרך כלל לפצל 1:. 5 כל 5-7 ימים תרבויות מעי אדם מפוצלים 1:.. 5 כל 10-12 ימי אדם תרבויות קיבה מפוצלות 1: 5 בכל 14 ימים אם יזם מהתאים בודדים, organoids קיבה אנושי יכול גם לקחת 20 ימים כדי ליצור כראוי זה סימן טוב אם מבני ניצנים מקיפים את לומן המרכזי בפרוטוקול זה, organoids מפוצל ב... 4 צלחות גם עבור microinjection. תחזוקה של organoids כדלקמן באותו הפרוטוקול, אך ניתן להשתמש בכל צלחת תרבית תאים אחרת, כגון צלחות תרבית תאי 24 גם סטנדרטית.- הכנת החומר
- טפטפות פסטר החיטוי.
- היום לפני המעבר, למקם צלחת תרבית תאי 4 גם בחממה על 37 מעלות צלזיוס. יש 4 הצלחות גם קצוות נמוכים ולאפשר מיקרומניפולציה.
- הכן את מטריצת המרתף על פי ההמלצה של יצרנים. ביום passaging, להפשיר מטריצת מרתף על קרח.
- הכן ולדלל את כל גורמי הגדילה על פי ההמלצות של יצרנים.
- בינוני בסיסיים מגניב על קרח ולקרר את צנטריפוגות כדי 4 מעלות צלזיוס.
- מעבר של תרבויות Organoid
- קח את הצלחת עם organoids מהחממה. הסר בינוני ומאחד.
- הוסף 1 מיליליטר של מדיום בסיס קר למטריצת המרתף בבאר. באמצעות micropipette 1 מיליליטר, במרץ פיפטה למעלה ולמטה עד מטריצת המרתף שבורה. העבר לצינור 15 מיליליטר. מניחים על קרח.
- קח זכוכית פיפטה פסטר ומקור אש כגון מבער בונזן.
- החזק את קצה פיפטה לתוך האש עד לפתיחה של הקצה הצטמצמה מ -1.5 מ"מ ועד 0.5 מ"מ על (איור 1). בוא פיפטה מגניב RT.
- להרטיב את פיפטה במדיום בסיסי. פיפטה הצטמצמה בצורה אופטימלית תיקח בינונית בעליל איטי יותר מאשר פיפטה-הצטמצם האו"ם, אבל זה עדיין יהיה כלow pipetting גם.
- קח את organoids בפיפטה ומרץ פיפטה 10x למעלה ולמטה. שבירת organoids ניתן להבחין בעין.
- להוסיף 9 מיליליטר של מדיום בסיס קר וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 200 ו 4 מעלות צלזיוס.
- להשליך בזהירות את כל supernatant. להשעות את גלולה ב250 מטריצת מרתף μl. שמור על קרח.
- קח את צלחת תרבות 37 ° C החמה 4 היטב ומניח ירידה של מטריקס 50 organoids μl / מרתף בכל טוב.
- העבר את הצלחת בזהירות חזרה לחממה. בואו מטריצת המרתף לחזק על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להכין מדיום מתאים לorganoids עכבר או אדם כמפורט בשלב 1.3.6.
- קח את הצלחת מן החממה וכיסוי כל טיפת מטריצת מרתף עם 500 בינוני μl.
- העבר את הצלחת לחממה.
- רענן הבינוני 3 פעמים בשבוע כל 2-3 ימים (ראה 1.3.8.).
- להקפאה של organoids, mechanically לשבש organoids כפי שתואר עבור פיצול בפרוטוקול זה (שלבי 2.2.1-2.2.5.). להשעות את שברי organoid ב500 מיליליטר הקפאה בינונית ולהקפיא ל -80 ° C cryotubes באמצעות ומיכל הקפאה. לאחסון לטווח ארוך, להעביר את הצינורות לחנקן נוזלי.
- להפשרת organoids, להכין צלחת התרבות, מטריצת מרתף, גורמי גדילה, בינוניים קרה וחמה כפי שמתואר בצעדי 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7. לחמם את הבקבוקון הקפוא באמצעות אמבט מים, ותאי העברה מייד לאחר ההפשרה לצינור 15 מיליליטר עם מדיום בסיס קר 10 מיליליטר. צנטריפוגה וצלחת התאים כפי שמתואר ב2.2.5 ל2.2.12.
הערה: Microinjection של organoids הוא מייגע, אך מאפשר את האפשרות הייחודית ללמוד אינטראקציה ב3D. - אם מחקרי 3D אין צורך, זרע organoids בשני ממדים. לשם כך, לשבש את organoids כפי שהותווה בצעדים 2.2.1 ל2.2.6. הוסף בינוני 2,250 μl קר עם כל גורמי הגדילה 250 μl של ma המרתףטריקס עם שברי organoid.
- זרע ב5 בארות של צלחת גם 24 עם 500 μl בכל טוב. שנה בינונית 3 פעמים בשבוע, עם החלפה בזהירות 400 μl העליון בלבד, כדי לשמור על מטריצת המרתף בתחתית הצלחת באין מפריע.
הערה: Organoids יצרף לצלחת תרבית תאים ולהרחיב ב2D. במיקרוסקופ אלקטרונים הראה כי צד הפסגה של תאי פרצופים בינוניים בבאר (מידע לא מוצג). - לפני הזיהום, להחליף את כל המדיום כולל מטריצת מרתף, כדי לאפשר לחיידקים לצרף לתאים. פרוטוקול דומה תואר גם לזיהום עם ה ' 14 פילורי. שכבות תאי 2D עשויות להכיל לא כל סוגי התאים שנמצאים בorganoids 3D.
- זרע ב5 בארות של צלחת גם 24 עם 500 μl בכל טוב. שנה בינונית 3 פעמים בשבוע, עם החלפה בזהירות 400 μl העליון בלבד, כדי לשמור על מטריצת המרתף בתחתית הצלחת באין מפריע.
3. Microinjection של Organoid תרבות.
הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש כדי microinject חיידקים לתוך organoids. זה עשוי להיות מועיל כדי להתחיל את הזריקה עם organoidsכי הם יותר מתירנית לmicroinjection. לדוגמא, organoids הקיבה העכבר יכול לגדול לתוך organoids פיברוזיס גדול מאוד, כי הם קל למקד.
- הכנת החומר
- משוך נימי זכוכית לשתי מחטי הזרקה באמצעות חולץ micropipette, על פי ההמלצה של יצרנים. חולץ micropipette יהיה לחמם את נימי זכוכית באמצע וימשוך את הנימים לשני חלקים, ובכך יוצר שתי מחטי זכוכית. זה מעשי למשוך כמה מחטים ולאחסן אותם בצלחת פטרי נקייה.
- כדי לאפשר זיהום חיידקים, להסיר את האנטיביוטיקה מכל מדיה לפחות 3 שינויים בינוניים (= שבוע). זה יהיה לדלל אנטיביוטיקה ממטריצת מרתף. אם משתמש בזן חיידקים שעמיד לאנטיביוטיקה ספציפית, להוסיף האנטיביוטיקה הספציפית הזה כדי למזער את הסיכויים לזיהום.
- הכן את עבודת הספסל עבור microinjections. לעבודה ברמות בטיחות ביולוגית שונות ייתכן שיהיה צורך למקם סטריאומיקרוסקופ בתוך ספסל סטרילי. בפרוטוקול זה, להזריק ח פילורי תחת רמת בטיחות ביולוגית 2 תנאי סטראו בתוך ספסל סטרילי.
- תרבות החיידקים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 13,23.
- כדי להעריך את הריבוי של זיהום (משרד הפנים), מעריך שני פרמטרים: מספר החיידקים ומספר התאים לכל organoid כמפורט להלן. משרד הפנים יכולים לתאם עם תוצאות, לדוגמא עם מארחי IL-8 ביטוי mRNA 13.
- כדי לחשב את צפיפות החיידקים בפתרון הזיהום, להקים ראשון עקומה סטנדרטית של יחידות צפיפות ומושבה להרכיב אופטיות (CFU) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 24. צפיפות אופטית של 0.1 ב 550 ננומטר אמורה להניב כ 10 7 CFU / ml.
- כדי להעריך את מספר תאים לכל organoid, לספור מספר organoids ב 1 גם. לשבש organoids כפי שמתואר בצעדים 2.2.1-2.2.4. לאחר צנטריפוגה 5 דקות ב XG 200 ו -4 מעלות צלזיוס,להוסיף 1 מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה האנזימטית וגלול.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם חזר רועד למשך 5-10 דקות. לקבוע אם התאים ניתקו לתוך תאים בודדים תחת מיקרוסקופ (מיקרוסקופ ההפוך כגון היקה DMIL בהגדלה 10x). אם יש צורך להאריך את הדגירה.
- ספירת תאים לorganoid באמצעות hemocytometer ולחשב את מספר תאים לכל organoid. יש לי organoids קיבה אנושי בקוטר של כ -200 מיקרומטר כ -4,000 תאים. הזרקה של 0.2 μl של פתרון חיידקים עם 1 x 10 9 חיידקים לתוצאות מיליליטר במשרד פנים משוערים של 50.
- הזרקה של Organoids.
הערה: microinjection, מחט הזכוכית הוא התייצבה בבעל, שניתן לתמרן ב 3 ממדים על ידי micromanipulator. Organoids יישאר בתוך מטריצת המרתף בתוך הבאר. בשל גודל ומיקום בבאר, לא כל organoids באותה מידהmenable להזרקה. בדרך כלל, יכול להיות ממוקד 30 organoids הגדול ובאחד ב 5 דקות.- חיידקים וקציר לשטוף אותם במדיום בסיסי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 24.
- לחשב את מספר חיידקים לכל מיליליטר לפי הצפיפות האופטית (ראה שלב 3.1.5.1). לדלל את החיידקים ל1 x 10 9 חיידקים למ"ל במדיום בסיסי.
- קח מחט זכוכית. שימוש במלקחיים לשבור את הקצה כך שהפתיחה תהיה רחבה כ -10 מיקרומטר.
- הכנס את המחט לתוך מחזיק ההזרקה ולתקן אותה לmicromanipulator.
- קח את כ 10 פתרון חיידקי μl לתוך המחט.
- מניחים צלחת 4 היטב עם קצוות נמוכים המכילים תרבויות organoid תחת סטראו.
- ניווט עם micromanipulator, לכוון organoids יחיד עם המחט. מקם את המחט הקרובה לorganoid ולאחר מכן להכניס את המחט לתוך organoid עם תנועה אחת מהירה. הזרק approximatelפתרון חיידקי 0.2 μl y לכל organoid באמצעות microinjector.
- הקציר Organoids לכל ניתוח.
- כדוגמא, לתקן organoids לאחר 4 שעות. הסר supernatant ולהוסיף פורמלדהיד% 1 מיליליטר 2 ו דגירה 20 דקות ב RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. Organoids יכול להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה על פי נהלים קבועים 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר בידוד של בלוטות קיבה (איור 2). בלוטות הם זורעים לתוך מטריצת מרתף, שמבצר כטיפה בתוך היטב, מתן מסגרת 3 ממדים עשיר בlaminin וקולגן כדי לאפשר את הבלוטות לגדול לתוך organoids (איור 3). Organoids בדרך כלל מתחיל ציסטות קטנות ובתוך 12-16 ימים, הם להתרחב לתחומים בקוטר של 50-300 מיקרומטר (איור 4). organoids כמה יישאר פיברוזיס, כמה יתפתח buddings הקטן. האחרון בדרך כלל הוא סימן לתרבות הולך וגדל בריא. בפרוטוקול זה גם אחד של צלחת גם 24 משמש לבלוטות 100, 50 μl של מטריצת מרתף ו -500 μl של מדיום. עם זאת, זה יכול להיות למעלה או downscaled.
ההצלחה של microinjection בקלות יכולה להיות שנצפתה תחת סטראו כפתרון מעונן, חיידקים ממלא את organoid (איור 5). לאחר זמן דגירה נאות, organoids יכוללהיות מעובד לכל שיטת ניתוח הרצויה. לדוגמא, יכול להיות מוטבע organoids בפרפין, ניתן לחתוך חלקים ומוכתמים באמצעות טכניקות אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית. ניתוח מיקרוסקופי של organoids immunostained להפגין זריקה מוצלחת של החיידקים (איור 6).
איור 1. תמונה של פיפטה פסטר המשמשת למעבר של organoids. בכל לוח, פיפטה העליונה היא לפני, פיפטה הנמוכה לאחר הצמצום על ידי אש. קנה מידה בלוחות העליונים ונכונים הוא סנטימטר ומ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונת נציג איור 2. של בלוטות קיבה אדם בודדות. בר סולם 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תכנית של בארות ותמונה מייצגת של organoids קיבה האנושי. בלוטות קיבה אנושיות מבודדות היו לוותר במטריצת מרתף והניחו כטיפין לתוך בארות של צלחת גם 24. שמאלי תחתון: סקירה כללית של נציג גם 11 ימים לאחר הזריעה. ימני תחתון: הגדלה של האזור המצוין. בר סולם 100 מיקרומטר. organoids עכבר הקיבה להרחיב מהר יותר 18. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4 "src =" / קבצים / ftp_upload / 53,359 / 53359fig4.jpg "/>
איור 4. צמיחה אופיינית של organoids קיבה האנושי. בלוטות היו זרע לתוך מטריצת מרתף ותמונות של אותו organoid נלקחו על פני תקופה של 12 ימים. סרגל 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Microinjection איור 5. של organoids קיבה. תמונות Stereoscope של organoid קיבה לפני (משמאל) ובמהלך microinjection (מימין) של חיידקים לתוך הלום. חיידקים נראים כענן בתוך organoid. בר סולם 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
-together.within עמודים = "תמיד"> 
organoids איור 6. immunostained. organoids קיבה האדם היה microinjected עם ה ' פילורי. לאחר 4 שעות, organoids היו קבוע בparaformaldehyde ומשובץ בפרפין. סעיפים היו מוכתמים באמצעות נוגדני מיקוד הגן הקשור Cytotoxicity חלבון חיידקים (cagA) לפי שיטות היסטולוגיה סטנדרטית 25. השמאלי עליון: תמונה של organoid נציג. פנל תחתון: הגדלה גבוהה של האזור בארגזים. ימני עליונה:. הגדלה גבוהה של האזור בארגזים עם חיידק יחיד קרוב לתאי האפיתל אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stock concentration 50 x, final concentration 1x |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Murine recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml |
| Human recombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml |
| TGFβi A-83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Wnt3A conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin1 conditioned medium | Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Noggin conditioned medium | Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers. | ||
| R-spondin3 | R&D | 3500-RS/CF | Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | Enzymatic dissociation solution |
| CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers | biocision | BCS-405 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none. |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue. |
| 4 Well Multidishes | Thermo Scientific | 144444 | You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator. |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Microinjector | Narishige | IM-5B | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Workbench | Clean Air | Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition | |
| Capillaries | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter. |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Flaming Brown Micropipette Puller | |
| anti Cag A antibody | Santa Cruz | sc-25766 |
References
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700 (2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13 (2013).
- Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
- Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617 (2012).
- Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
- Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
- Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
- Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
- McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
- Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
- Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21 (2010).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
- Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
- Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
- Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
- Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
- Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
