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Immunology and Infection

संक्रामक रोगों के लिए मॉडल के रूप में Organoids: हेलिकोबेक्टर के मानव की संस्कृति और murine पेट Organoids और microinjection

Published: November 12, 2015 doi: 10.3791/53359
Automatic Translation
1, 1
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Introduction

रोगजनकों के अध्ययन में विवो संक्रमण नकल करने के लिए पर्याप्त मॉडल प्रणाली पर निर्भर करता है। इस्तेमाल किया प्रणालियों में से कुछ इष्टतम से दूर हैं, जबकि कुछ संक्रामक एजेंटों के लिए, पर्याप्त मॉडल प्रणाली कमी कर रहे हैं। एक उदाहरण कारणतः गैस्ट्रिक कैंसर के विकास से संबंधित है जो आमाशय जीवाणु हेलिकोबेक्टर (एच पायलोरी), है। अभी तक एक अधिक उपयुक्त सेल संस्कृति प्रणाली के अभाव में, उद्देश्य है कि कई अध्ययनों से कैंसर झरना का समापन बिंदु प्रतिनिधित्व करते हैं जो कैंसर के विकास में उपयोग के कैंसर कोशिका लाइनों अंतर्निहित आणविक तंत्र, विश्लेषण करने के लिए। प्राथमिक, गैर बदल कोशिकाओं इन अध्ययनों के लिए एक बेहतर मॉडल होगा। हालांकि, प्राथमिक कोशिकाओं दाताओं की एक छोटी संख्या से ही उपलब्ध हैं और समय की लंबी अवधि में सुसंस्कृत नहीं हो सकता। हाल के वर्षों में, स्टेम सेल अनुसंधान के संक्रमण जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए प्राथमिक सेल संस्कृतियों के लिए नए स्रोतों प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति की है।

से संस्कृतितीन स्टेम सेल के सूत्रों इस्तेमाल किया गया है: भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी), प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSC) या वयस्क स्टेम कोशिकाओं। वे इस तरह के Cytomegalovirus 1,2 या हेपेटाइटिस सी वायरस के रूप में वायरस, साथ संक्रमण मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 3-7, ऐसे में इस तरह Bacterioides thetaiotaomicron 10 या साल्मोनेला enterica 11 के रूप में प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम 8 या Toxoplasma gondii 9, और बैक्टीरिया के रूप में परजीवी,। अभी हाल ही में कई दृष्टिकोण एच के साथ संक्रमण मॉडल करने के लिए प्रकाशित किया गया है 15 - ईएससी या आईपीएस कोशिकाओं 12, माउस वयस्क स्टेम कोशिकाओं 21,22 या मानव वयस्क स्टेम कोशिकाओं को 13 से निकाली गई organoids साथ पाइलोरी।

वयस्क स्टेम कोशिकाओं से organoid संस्कृतियों के विकास murine आंतों उपकला से अलग एकल स्टेम कोशिकाओं को एक तीन आयामी मैट्रिक्स में वरीयता प्राप्त थे, जिसमें एक अध्ययन से प्रारंभ हुआ औरहड्डी morphogenic प्रोटीन (बीएमपी) 16 सिगनल को बाधित करने के लिए WNT सिगनल और नोगिन को बढ़ाने के लिए माइटोजन, आर spondin रूप EGF युक्त आंतों स्टेम कोशिकाओं का वातावरण मजाक उड़ाया कि मध्यम में एम्बेडेड। उल्लेखनीय है कि इन संस्कृतियों mesenchymal कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति की आवश्यकता नहीं है। इन परिस्थितियों में, स्टेम कोशिकाओं को पैदा करना और डोमेन आंतों तहखाने की कोशिकाओं को शरण देने के साथ छोटे संरचनाओं फार्म, और आंतों अंकुर की कोशिकाओं होते कि डोमेन। organoids इस प्रकार इन विवो स्थिति नकल करने के लिए स्वयं को व्यवस्थित। आज, कई murine और मानवीय ऊतकों से वयस्क स्टेम कोशिकाओं इन विट्रो और में उगाया जा सकता है ऐसी छोटी आंत और पेट के 17, पेट 13,18, जिगर 19,20 के रूप में उनके इन विवो समकक्ष, जैसे लगते हैं कि organoids में स्वयं को व्यवस्थित, अग्न्याशय 21 और प्रोस्टेट 22।

यहाँ हम वयस्क स्टेम सेल से संस्कृति माउस या मानव गैस्ट्रिक organoids के लिए एक वीडियो प्रोटोकॉल प्रदानरास एच के साथ उन्हें microinject और पाइलोरी। इस प्रोटोकॉल पिछली रिपोर्टों 13,18 पर आधारित है। इस विधि के संवर्धन और ऐसे आंतों organoids के रूप में अन्य organoid संस्कृतियों को संक्रमित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

गैस्ट्रिक organoid संस्कृति 1. स्थापना

नोट: इस प्रोटोकॉल माउस या मानव ऊतकों से गैस्ट्रिक ग्रंथियों के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह लगभग 1 सेमी ² के ऊतक का उपयोग करने की सलाह दी है। मानव ऊतक गैस्ट्रिक उच्छेदन या बायोप्सी से प्राप्त किया जा सकता है।

  1. सामग्री की तैयारी
    नोट: इस्तेमाल किया तहखाने मैट्रिक्स Matrigel है। सभी समय पर बर्फ पर तहखाने मैट्रिक्स रखें। -20 डिग्री सेल्सियस पर तहखाने मैट्रिक्स की दुकान है और उपयोग करने से पहले बर्फ पर पिघलना। बेसल मध्यम HEPES के साथ पूरक उन्नत DMEM / F12 के लिए संदर्भित करता है; ऐसे Glutamax और ऐसे 1x Primocin के रूप में उचित एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में एक उचित glutamine के स्रोत। इस्तेमाल किया इनक्यूबेटर एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर है (37 डिग्री सेल्सियस, humidified माहौल, 5% सीओ 2)
    1. तेज संदंश, कैंची, एक छुरी और एक गिलास माइक्रोस्कोपी स्लाइड: autoclaving या 100% isopropyl शराब का उपयोग करके तैयारी बर्तन जीवाणुरहित।
    2. अलगाव से पहले दिन, एक 24 wel जगहइनक्यूबेटर में एल सेल कल्चर प्लेट।
    3. 'निर्माताओं सिफारिश के अनुसार तहखाने मैट्रिक्स तैयार करें। दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के लिए 1 मिलीलीटर की aliquots तैयार करें।
    4. बर्फ पर बफर और शांत chelating 500 मिलीलीटर की तैयारी। 4 HPO, 8.0 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 96.2 मिमी NaCl, 1.6 मिमी KCl 5.6 मिमी ना 2 के साथ बाँझ आसुत जल से 1x बफर तैयार, 43.4 मिमी सुक्रोज, 54.9 मिमी डी-सोर्बिटोल, 0.5 मिमी डीएल dithiothreitol (चेतावनी), पीएच 7. कई विलगन योजना बना रहे हैं, डीएल-dithiothreitol बिना एक 5x केंद्रित समाधान तैयार है। बाँझ फिल्टर बफर। अलगाव से पहले, 1x और सिर्फ अलगाव से पहले डीएल dithiothreitol जोड़ने के लिए बाँझ पानी के साथ 5x बफर पतला।
    5. तैयार है और निर्माताओं की सिफारिशों के अनुसार सभी विकास कारकों पतला। छोटे आकार के aliquots का प्रयोग करें और फ्रीज पिघलना चक्र से बचें। कार्यात्मक वृद्धि कारकों के परिणामों के लिए महत्वपूर्ण हैं।
    6. कूल बेसल बर्फ पर मध्यम और 4 के लिए सेंट्रीफ्यूज शांत6, सी।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस तक बेसल माध्यम की एक और विभाज्य गर्म।
  2. ग्रंथियों का अलगाव
    1. बर्फ के ठंडे बेसल मध्यम में ऊतक के लगभग 1 सेमी ² लीजिए। तैयारी तक बर्फ पर रखें। यह जितनी जल्दी हो सके ऊतक पर कार्रवाई करने के लिए बेहतर है, वहीं बर्फ पर मध्यम में दुकान ऊतक यदि आवश्यक है।
    2. एक 10 सेमी पेट्री डिश में ऊतक प्लेस और ठंडे 1x केलेशन बफर के साथ कवर। धीरे आगे और पीछे ले जाकर धो लें।
    3. एक सूखी 10 सेमी पेट्री डिश में ऊतक रखें। संदंश का प्रयोग, ध्यान से एक stereomicroscope के तहत बलगम के साथ-साथ मांसपेशियों की परत को हटा दें। धीरे आगे और पीछे ले जाकर ठंड 1x chelating बफर में ऊतक धो लें।
    4. एक नया, सूखी 10 सेमी पेट्री डिश पर 1 सेमी 2 टिशू रखें। का प्रयोग कैंची लगभग 2-5 मिमी ² आकार के 20-50 छोटे-छोटे टुकड़ों में काट लें।
    5. संदंश का प्रयोग, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सभी टुकड़े जगह है।
    6. एक बाँझ 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक पिपेट ले लो। 1x chelating बफर में पिपेट गीले। रखनाप्रक्रिया के दौरान इस एक ही पिपेट का उपयोग।
    7. 50 मिलीलीटर ट्यूब को 10 मिलीलीटर ठंड 1x chelating बफर जोड़ें। सख्ती के ऊपर और नीचे 10 बार pipetting द्वारा टुकड़े धो लें। टुकड़े तय है। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    8. सतह पर तैरनेवाला दोहराएँ जब तक धोने (कदम 1.2.7) स्पष्ट है। यह मानव ऊतक के 1 सेमी ² के लिए लगभग 50-100 मिलीग्राम 1x chelating बफर के लेता है।
    9. कोमल हर 2 मिनट inverting के साथ 10 मिनट के लिए आरटी पर 10 मिमी EDTA के साथ पूरक 20 मिलीलीटर 1x chelating बफर में ऊतक टुकड़े सेते हैं।
      नोट: इस गर्मी के समय और तापमान की गति और / या ग्रंथियों के स्थापत्य कला के संरक्षण के लिए या तो अनुकूलित किया जा सकता। वे 200 आरपीएम के साथ एक प्रकार के बरतन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक रोलिंग मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटे ऊष्मायन से लेकर कर सकते हैं। माउस पेट के लिए अच्छी शुरुआत अंक एक रोलिंग मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर और मानव पेट के लिए 30 मिनट, आरटी पर 10 मिनट कर रहे हैं।
    10. पिपेट एक बार धीरे से ऊपर और 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर नीचे। गड़बड़ी की अनुमति देंeces व्यवस्थित करने के लिए। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    11. पिपेट का उपयोग करना, एक स्वच्छ 10 सेमी पेट्री डिश के टुकड़े हस्तांतरण। तरल निकालें।
    12. ऊतक के टुकड़े के शीर्ष पर एक गिलास माइक्रोस्कोपी स्लाइड रखें। 10X बढ़ाई साथ सेल संस्कृति के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत बरकरार ऊतक का निरीक्षण करें।
    13. गिलास स्लाइड और पेट्री डिश के लिए दबाव लागू करें। दोनों (बाँझ दस्ताने के साथ) हाथ में और अंगूठे के साथ कांच दबाने पकड़ो। ऊतक के रिम ग्रंथियों के ऊतकों के बाहर जारी कर रहे हैं यह दर्शाता है कि बादल दिखाई देगा।
    14. 10X बढ़ाई साथ सेल संस्कृति के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत जारी की ग्रंथियों को ध्यान से देखें।
    15. 30 मिलीलीटर ठंड बेसल मध्यम में ग्रंथियों और ऊतक लीजिए। बड़े ऊतक टुकड़े तय है।
    16. दो 15 मिलीलीटर ट्यूब में ग्रंथियों से युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
    17. 200 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गोली पृथक ग्रंथियों में शामिल है। बर्फ पर उन्हें रखें।
  3. ग्रंथियों की सीडिंग बोने के लिए, तहखाने मैट्रिक्स ठंडा हर समय रखने के लिए, तो यह तरल रहना होगा।
  4. एक वैकल्पिक: बीज एक कमजोर पड़ने पंक्ति के 6 कुओं।
    1. तहखाने मैट्रिक्स के 60 μl में गोली निलंबित।
    2. तहखाने मैट्रिक्स के प्रत्येक युक्त 50 μl के साथ बर्फ पर 5 बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार। स्थानांतरण पहले 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में ग्रंथियों / तहखाने मैट्रिक्स निलंबन के 10 μl। ग्रंथियों को निरस्त करने और अगले 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को यह समाधान के 10 μl हस्तांतरण। अगले ट्यूबों के लिए दोहराएँ।
  5. 2 वैकल्पिक: अच्छी तरह से प्रति ग्रंथियों की एक राशि की गणना बीज। एक 24 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से में 50 μl तहखाने मैट्रिक्स प्रति 100 ग्रंथियों के साथ शुरू करते हैं।
    1. ध्यान से 10 मिलीलीटर बेसल मध्यम में pelleted ग्रंथियों निलंबित। एक स्वच्छ 10 मिलीलीटर पेट्री डिश पर 50 μl रखें। 10X बढ़ाई साथ सेल संस्कृति के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत ग्रंथियों की संख्या की गणना।
    2. समाधान में ग्रंथियों की एकाग्रता की गणना। मात्रा कि conta स्थानांतरणभारतीय नौसेना पोत एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब 400 ग्रंथियों।
    3. 200 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बर्फ पर ट्यूब रखें। 200 μl तहखाने मैट्रिक्स जोड़ें और ध्यान से resuspend। बर्फ पर रखें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस गर्म 24 अच्छी तरह से थाली ले लो इनक्यूबेटर से (कदम 1.1.2 देखें)। अच्छी तरह से केंद्र में तहखाने मैट्रिक्स में 50 μl ग्रंथियों में से एक बूंद रखें। ड्रॉप एक गुंबद के रूप में होगा।
  7. ध्यान से वापस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर की थाली हस्तांतरण। तहखाने मैट्रिक्स 10 मिनट जमना।
  8. सभी विकास कारकों के साथ गर्म मध्यम तैयार।
    1. मानव ग्रंथियों के लिए: मानव गैस्ट्रिक organoids के लिए निम्न वृद्धि कारकों के साथ बेसल मध्यम अनुपूरक: 50 एनजी / एमएल EGF, 10% नोगिन वातानुकूलित मध्यम, 10% आर-spondin1 वातानुकूलित मध्यम, 50% Wnt वातानुकूलित मध्यम, 200 एनजी / मिलीलीटर fibroblast वृद्धि कारक (FGF) 10, 1 एनएम गैस्ट्रीन, और 2 माइक्रोन TGFbeta अवरोध करनेवाला और 10 माइक्रोन रो-जुड़े गठन कुंडलित कॉइल प्रोटीन सेरीन / threonine काइनेज अवरोध करनेवाला (RHOKi)।
    2. Murine ग्रंथियों के लिए: माउस गैस्ट्रिक organoids के लिए निम्न वृद्धि कारकों के साथ बेसल मध्यम अनुपूरक: 50 एनजी / एमएल EGF, 10% नोगिन वातानुकूलित मध्यम, मध्यम आर-spondin1 वातानुकूलित 10%, 50% Wnt वातानुकूलित मध्यम, 100 एनजी / मिलीलीटर FGF10, 10 एनएम गैस्ट्रीन, 0.5 मिमी TGFbeta अवरोध करनेवाला और 10 माइक्रोन RHOKi।
  9. इनक्यूबेटर से थाली ले लो। ध्यान से अच्छी तरह से तहखाने मैट्रिक्स परेशान बिना प्रत्येक के लिए सभी विकास कारकों (1.3.6) के साथ 500 μl के माध्यम जोड़ें। वापस इनक्यूबेटर रखें।
  10. प्रति सप्ताह मध्यम 3 बार (हर 2-3 दिन) ताज़ा करें। मध्यम ताज़ा करने के लिए, बरकरार तहखाने मैट्रिक्स की बूंद छोड़ने के साथ पुराने मध्यम निकालें। ध्यान से सभी विकास कारकों के साथ ताजा, गर्म माध्यम जोड़ें। RHOKi न जोड़ें। केवल सीधे ग्रंथियों के बोने के बाद या organoids (चरण 2) के बंटवारे के बाद RHOKi जोड़ें।

Microinjection पहले गैस्ट्रिक organoid संस्कृति की 2. बीतने।

"ove_content> नोट: organoid संस्कृति के हर प्रकार की अपनी दुगनी समय है माउस आंतों के रूप में अच्छी तरह से गैस्ट्रिक संस्कृतियों आमतौर पर विभाजित कर रहे हैं के रूप में 1:। 5 हर 5-7 दिनों मानव आंतों संस्कृतियों 1 विभाजित कर रहे हैं:।। 5 हर 10-12 दिनों मानव गैस्ट्रिक संस्कृतियों 1 विभाजित कर रहे हैं: 5 हर 14 दिनों के एकल कक्षों से शुरू किए गए हैं, तो मानव गैस्ट्रिक organoids भी ठीक से फार्म के लिए 20 दिनों का समय लग सकता है कि यह नवोदित संरचनाओं केंद्रीय लुमेन चारों ओर यदि इस प्रोटोकॉल में, organoids में विभाजित कर रहे हैं एक अच्छा संकेत है।।। organoids के microinjection। रखरखाव के लिए 4 अच्छी तरह प्लेटें ही प्रोटोकॉल का अनुसरण करता है, लेकिन इस तरह के मानक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के रूप में किसी भी अन्य सेल संस्कृति की थाली, उपयोग कर सकते हैं।

  1. सामग्री की तैयारी
    1. आटोक्लेव पाश्चर pipettes।
    2. दिन पारित होने से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक 4 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट जगह है। 4 अच्छी तरह प्लेटें कम किनारों है और micromanipulation अनुमति देते हैं।
    3. 'निर्माताओं सिफारिश के अनुसार तहखाने मैट्रिक्स तैयार करें। Passagi के दिनएनजी, बर्फ पर तहखाने मैट्रिक्स पिघलना।
    4. तैयार है और निर्माताओं की सिफारिशों के अनुसार सभी विकास कारकों पतला।
    5. कूल बेसल बर्फ पर मध्यम और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेंट्रीफ्यूज शांत।
  2. Organoid संस्कृतियों के पारित
    1. इनक्यूबेटर से organoids साथ थाली ले लो। एक अच्छी तरह से मध्यम निकालें।
    2. कुएं में तहखाने मैट्रिक्स को ठंड बेसल के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें। 1 मिलीलीटर micropipette का उपयोग करना, सख्ती विंदुक ऊपर और तहखाने मैट्रिक्स टूट जाता है जब तक नीचे। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण। बर्फ पर रखें।
    3. एक गिलास पाश्चर विंदुक और एक लेम्प बर्नर के रूप में इस तरह के एक आग स्रोत लो।
      1. टिप के उद्घाटन के बारे में 0.5 मिमी (चित्रा 1) के लिए 1.5 मिमी से सीमित कर लिया है जब तक आग में पिपेट की नोक पकड़ो। आरटी के लिए शांत पिपेट करते हैं।
      2. बेसल मध्यम में पिपेट गीले। एक बेहतर संकुचित पिपेट एक संयुक्त राष्ट्र के संकुचित पिपेट से दिख धीमी मध्यम तक ले जाएगा, लेकिन यह अभी भी सब होगाओउ अच्छी तरह से pipetting।
    4. पिपेट में organoids हाथ में ले लिया और सख्ती से ऊपर और नीचे 10x विंदुक। organoids के टूटने आंखों से देखा जा सकता है।
    5. 200 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंड बेसल मध्यम और सेंट्रीफ्यूज के 9 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. ध्यान से सभी सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 250 μl तहखाने मैट्रिक्स में गोली निलंबित। बर्फ पर रखें।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस गर्म 4 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली ले लो और अच्छी तरह से प्रत्येक में 50 μl organoids / तहखाने मैट्रिक्स की एक बूंद जगह है।
    8. ध्यान से वापस इनक्यूबेटर की थाली स्थानांतरण। तहखाने मैट्रिक्स 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जमना।
    9. कदम 1.3.6 के रूप में सूचीबद्ध माउस या मानव या तो organoids के लिए उचित माध्यम से तैयार करें।
    10. इनक्यूबेटर से थाली ले लो और 500 μl मध्यम के साथ प्रत्येक तहखाने मैट्रिक्स बूंद उपरिशायी।
    11. इनक्यूबेटर की थाली स्थानांतरण।
    12. हर 2-3 दिनों मध्यम प्रति सप्ताह 3 बार रिफ्रेश (1.3.8 देखें।)।
    13. Organoids की ठंड, mechan के लिएइस प्रोटोकॉल में बंटवारे के लिए के रूप में वर्णित ically organoids बाधित (कदम 2.2.1-2.2.5।)। ठंड मध्यम 500 मिलीलीटर में organoid टुकड़े को निरस्त करने और सी का उपयोग cryotubes और एक ठंड कंटेनर ° -80 को फ्रीज। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, तरल नाइट्रोजन के लिए ट्यूबों स्थानांतरण।
    14. कदम 1.1.2, 1.1.3।, 1.1.5।, 1.1.6।, 1.1.7 के रूप में रेखांकित organoids का विगलन के लिए, संस्कृति की थाली, तहखाने मैट्रिक्स, वृद्धि कारक है, ठंडे और गर्म मध्यम तैयार करते हैं। तुरंत 10 मिलीलीटर ठंड बेसल मध्यम के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब विगलन के बाद जमे हुए पानी के स्नान का उपयोग कर शीशी, और हस्तांतरण कोशिकाओं को गर्म। 2.2.12 को 2.2.5 के रूप में रेखांकित अपकेंद्रित्र थाली कोशिकाओं और।
      नोट: organoids के microinjection श्रमसाध्य है, लेकिन अद्वितीय संभावना 3 डी में बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है।
    15. 3 डी अध्ययन की जरूरत नहीं कर रहे हैं, दो आयामों में organoids बीज। कदम 2.2.6 के लिए 2.2.1 में बाहर रखी रूप में इस के लिए, organoids बाधित। तहखाने मा के 250 μl करने के लिए सभी विकास कारकों के साथ 2,250 μl ठंड मध्यम जोड़ेंorganoid टुकड़े के साथ ट्रिक्स।
      1. अच्छी तरह से प्रति 500 ​​μl के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली के 5 कुओं में बीज। अबाधित प्लेट के नीचे तहखाने मैट्रिक्स रखने के लिए, ध्यान से केवल ऊपरी 400 μl की जगह के साथ, मध्यम 3 बार एक सप्ताह बदलें।
        नोट: Organoids सेल कल्चर प्लेट को देते हैं और 2 डी में विस्तार होगा। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं के शिखर की ओर अच्छी तरह से मध्यम सामना करना पड़ता है कि दिखाया गया है (डेटा) नहीं दिखाया।
      2. संक्रमण से पहले, बैक्टीरिया की कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए, तहखाने मैट्रिक्स सहित सभी मध्यम विनिमय। इसी तरह की एक प्रोटोकॉल भी एच के साथ संक्रमण के लिए वर्णित किया गया है पाइलोरी 14। 2 डी सेल परतों नहीं 3D organoids में मौजूद हैं कि सभी प्रकार की कोशिकाओं हो सकती है।

Organoid संस्कृति 3. Microinjection।

नोट: इस प्रोटोकॉल organoids में बैक्टीरिया microinject के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह organoids साथ इंजेक्शन शुरू करने के लिए सहायक हो सकता हैmicroinjection के लिए और अधिक अनुमोदक हैं। उदाहरण के लिए, माउस गैस्ट्रिक organoids लक्षित करने के लिए आसान कर रहे हैं कि बहुत बड़े पित्ताशय organoids के रूप में विकसित कर सकते हैं।

  1. सामग्री की तैयारी
    1. 'निर्माताओं सिफारिश के अनुसार, एक micropipette खींचने का उपयोग करते हुए दो इंजेक्शन सुई में एक गिलास केशिका खींचो। micropipette खींचने बीच में कांच केशिका गर्मी होगी और इस तरह दो गिलास सुई पैदा करने, दो भागों में केशिका खींच जाएगा। यह कई सुई खींचने के लिए और एक साफ पेट्री डिश में उन्हें स्टोर करने के लिए व्यावहारिक है।
    2. जीवाणु संक्रमण की अनुमति देने के लिए कम से कम 3 मध्यम परिवर्तन (= एक सप्ताह) के लिए सभी मीडिया से एंटीबायोटिक दवाओं को दूर करने के लिए। इस तहखाने मैट्रिक्स से एंटीबायोटिक दवाओं कमजोर होगी। एक विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोधी है कि एक जीवाणु तनाव का उपयोग करते हैं, तो प्रदूषण के लिए अवसरों को कम करने के लिए इस विशिष्ट एंटीबायोटिक जोड़ें।
    3. Microinjections के लिए काम बेंच तैयार करें। विभिन्न जैव सुरक्षा स्तरों पर काम करने के लिए यह एक स्टीरियो जगह के लिए आवश्यक हो सकता हैएक बाँझ बेंच अंदर माइक्रोस्कोप। इस प्रोटोकॉल में, एच इंजेक्षन 2 शर्तों एक बाँझ बेंच के अंदर एक stereomicroscope के तहत जैव सुरक्षा के स्तर के नीचे पाइलोरी।
    4. संस्कृति मानक प्रोटोकॉल 13,23 के अनुसार बैक्टीरिया।
    5. बैक्टीरिया की संख्या और organoid प्रति कोशिकाओं की संख्या नीचे उल्लिखित के रूप में: संक्रमण (MOI) की बहुलता का अनुमान है, दो मापदंडों का अनुमान है। MOI मेजबान टीम आईएल -8 mRNA अभिव्यक्ति 13 के साथ उदाहरण के लिए, परिणाम के साथ संबंध स्थापित कर सकते हैं।
      1. संक्रमण समाधान में बैक्टीरिया घनत्व की गणना करने के लिए, पहली मानक प्रोटोकॉल 24 के अनुसार ऑप्टिकल घनत्व और कॉलोनी बनाने इकाइयों के मानक वक्र (सीएफयू) की स्थापना। 550 एनएम पर 0.1 की एक ऑप्टिकल घनत्व लगभग 10 7 CFU / एमएल उपज चाहिए।
      2. Organoid प्रति कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए, अच्छी तरह से एक में organoids की संख्या गिनती। कदम के रूप में रेखांकित organoids बाधित 2.2.1-2.2.4। Centrifugation के 5 मिनट के लिए 200 XG पर बाद और 4 डिग्री सेल्सियस,एंजाइमी हदबंदी समाधान और resuspend के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
        1. बार-बार 5-10 मिनट के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। कोशिकाओं (10X बढ़ाई ऐसे लीका DMIL के रूप में औंधा माइक्रोस्कोप) माइक्रोस्कोप के तहत एकल कक्षों में अलग है कि निर्धारित करते हैं। यदि आवश्यक हो ऊष्मायन लम्बा।
        2. एक hemocytometer का उपयोग organoid प्रति कोशिकाओं की गणना और organoid प्रति कोशिकाओं की संख्या की गणना। लगभग 200 माइक्रोन की एक व्यास के साथ मानव गैस्ट्रिक organoids लगभग 4000 कोशिकाओं है। 50 की एक अनुमानित Moi में मिलीलीटर परिणामों के अनुसार 1 एक्स 10 9 बैक्टीरिया के साथ एक जीवाणु समाधान के 0.2 μl इंजेक्शन।
  2. Organoids इंजेक्शन।
    नोट: microinjection के लिए, कांच सुई एक micromanipulator द्वारा 3 आयामों में चतुराई जा सकता है, जो एक धारक, में स्थिर है। Organoids अच्छी तरह से भीतर तहखाने मैट्रिक्स के भीतर रहते हैं। कारण अच्छी तरह से आकार और स्थिति के लिए है, न कि सभी organoids समान रूप से एक हैंइंजेक्शन के लिए menable। आमतौर पर, एक अच्छी तरह से में 30 सबसे बड़े organoids 5 मिनट में निशाना बनाया जा सकता है।
    1. हार्वेस्ट बैक्टीरिया और मानक प्रोटोकॉल 24 के अनुसार बेसल माध्यम में उन्हें धोने।
    2. ऑप्टिकल घनत्व के अनुसार मिलीलीटर प्रति बैक्टीरिया की संख्या की गणना (कदम 3.1.5.1 देखें)। बेसल मध्यम में प्रति मिलीलीटर 1 एक्स 10 9 बैक्टीरिया को बैक्टीरिया पतला।
    3. एक गिलास सुई ले लो। उद्घाटन लगभग 10 माइक्रोन विस्तृत हो जाएगा तो संदंश का प्रयोग टिप टूट गया।
    4. इंजेक्शन धारक में सुई डालें और यह micromanipulator से तय कर लो।
    5. सुई में लगभग 10 μl बैक्टीरियल समाधान ऊपर ले लो।
    6. Stereomicroscope के तहत organoid संस्कृतियों युक्त कम किनारों के साथ एक 4 अच्छी तरह से थाली रखें।
    7. Micromanipulator के साथ नेविगेट, सुई के साथ एक एकल organoids लक्ष्य। Organoid के करीब सुई की स्थिति और फिर एक स्विफ्ट आंदोलन के साथ organoid में सुई डालने। Approximatel इंजेक्षनप्रत्येक में वाई 0.2 μl बैक्टीरियल समाधान microinjector का उपयोग कर organoid।
  3. किसी भी विश्लेषण के लिए हार्वेस्ट Organoids।
    1. उदाहरण के रूप में, 4 घंटे के बाद organoids तय कर लो। तैरनेवाला निकालें और 1 मिलीलीटर 2% formaldehyde जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन पर 20 मिनट सेते हैं। Organoids मानक प्रक्रियाओं 25 के अनुसार immunohistochemistry के लिए कार्रवाई की जा सकती।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल गैस्ट्रिक ग्रंथियों (चित्रा 2) के अलगाव की अनुमति देता है। ग्रंथियों organoids में ग्रंथियों बढ़ने की अनुमति देने के laminin और कोलेजन में अमीर एक 3 आयामी ढांचे (चित्रा 3) उपलब्ध कराने, एक अच्छी तरह से भीतर बूंद के रूप में solidifies जो तहखाने मैट्रिक्स, में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। Organoids आम तौर पर छोटे अल्सर शुरू करते हैं और 12-16 दिनों के भीतर, वे 50-300 माइक्रोन (चित्रा 4) की एक व्यास के साथ क्षेत्रों में विस्तार। कुछ organoids कुछ छोटे buddings का विकास होगा, सिस्टिक रहना होगा। बाद आम तौर पर एक स्वस्थ बढ़ती संस्कृति का एक संकेत है। इस प्रोटोकॉल में एक 24 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से 100 ग्रंथियों, तहखाने मैट्रिक्स के 50 μl और मध्यम के 500 μl के लिए प्रयोग किया जाता है। बहरहाल, यह ऊपर या downscaled हो सकता है।

बादल छाए रहेंगे, बैक्टीरियल समाधान organoid (चित्रा 5) भरता रूप microinjection की सफलता आसानी से stereomicroscope के तहत देखा जा सकता है। पर्याप्त ऊष्मायन समय के बाद, organoids कर सकते हैंवांछित किसी भी विश्लेषण पद्धति के लिए कार्रवाई की जा सकती है। उदाहरण के लिए, organoids पैराफिन में एम्बेडेड जा सकता है, वर्गों में कटौती और मानक इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री तकनीक का उपयोग कर कलंकित किया जा सकता। Immunostained organoids का सूक्ष्म विश्लेषण (चित्रा 6) बैक्टीरिया के सफल इंजेक्शन प्रदर्शित करता है।

चित्र 1
चित्रा organoids के पारित होने के लिए इस्तेमाल किया पाश्चर विंदुक के 1. छवि। प्रत्येक पैनल में, ऊपरी पिपेट, इससे पहले कि आग से कम करने के बाद कम पिपेट है। ऊपरी और सही पैनल में स्केल सेमी और मिमी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि छवि पृथक मानव गैस्ट्रिक ग्रंथियों की। स्केल बार 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा कुओं और मानव गैस्ट्रिक organoids के प्रतिनिधि छवि 3. योजना। पृथक मानव गैस्ट्रिक ग्रंथियों तहखाने मैट्रिक्स में तिरस्कृत और एक 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में बूंदों के रूप में रखा गया था। निचले बाएँ: 11 दिनों बोने के बाद एक प्रतिनिधि अच्छी तरह का अवलोकन। निचले सही: संकेत क्षेत्र की वृद्धि। स्केल बार 100 माइक्रोन। गैस्ट्रिक माउस organoids 18 तेजी से विस्तार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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मानव गैस्ट्रिक organoids की चित्रा 4. ठेठ विकास। ग्रंथियों तहखाने मैट्रिक्स और एक ही organoid की छवियों में वरीयता प्राप्त थे 12 दिनों की अवधि में ले जाया गया। स्केल बार 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
गैस्ट्रिक organoids की चित्रा 5. Microinjection। से पहले (बाएं) और लुमेन में बैक्टीरिया की (दाएं) microinjection के दौरान एक गैस्ट्रिक organoid की स्टिरियोस्कोप छवियों। जीवाणु organoid अंदर बादल के रूप में दिखाई दे रहे हैं। स्केल बार 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 6 immunostained organoids। मानव गैस्ट्रिक organoids एच के साथ microinjected थे पाइलोरी। 4 घंटे के बाद, organoids paraformaldehyde में तय किया गया और पैराफिन में एम्बेडेड। धारा मानक ऊतक विज्ञान के तरीकों 25 के अनुसार बैक्टीरियल प्रोटीन cytotoxicity जुड़े जीन ए (CagA) को निशाना एंटीबॉडी का उपयोग दाग रहे थे। ऊपरी बाएँ: एक प्रतिनिधि organoid की छवि। लोअर पैनल: बॉक्सिंग क्षेत्र के उच्च बढ़ाई। ऊपरी सही:। उपकला कोशिकाओं के करीब एक जीवाणु के साथ बॉक्सिंग क्षेत्र के उच्च बढ़ाई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium
HEPES Invitrogen 15630-056
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-028
Matrigel, GFR, phenol free BD 356231
GlutaMAX Invitrogen 35050-079 Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
B27 Invitrogen 17504-044 Stock concentration 50 x, final concentration 1x
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Murine recombinant EGF Invitrogen PMG8043 Stock concentration 500 µg/ml, final concentration 50 ng/ml
Human recombinant FGF10 Peprotech 100-26 Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 200 ng/ml
TGFβi A-83-01 Tocris 2939 Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM 
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM 
[Leu15]-Gastrin Sigma-Aldrich G9145 Stock concentration 100 µM, final concentration 1 nM
RHOKi Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Wnt3A conditioned medium Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.
R-spondin1 conditioned medium Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.
Noggin conditioned medium Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.
R-spondin3 R&D 3500-RS/CF Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 µg/ml), but not yet on gastric organoids.
Noggin Peprotech 120-10 Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids.
TrypLE express Life Technologies 12605036 Enzymatic dissociation solution 
CoolCell® Alcohol-free Cell Freezing Containers biocision BCS-405
Recovery Cell Culture Freezing Medium Invitrogen 12648-010
Antibiotics
Primocin Invivogen ant-pm-1 An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.
Other
Tweezers Neolabs 2-1033 Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.
4 Well Multidishes Thermo Scientific 144444 You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.
Micromanipulator Narishige M-152
Microinjector Narishige IM-5B
Stereomicroscope Leica MZ75
Workbench Clean Air Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition
Capillaries Harvard Apparatus GC100T-10 1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter.
Micropipette Puller Sutter Instruments Flaming Brown Micropipette Puller
anti Cag A antibody Santa Cruz sc-25766

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References

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संक्रमण अंक 105 प्राथमिक सेल संस्कृति संक्रमण मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पेट microinjection हेलिकोबैक्टर।
संक्रामक रोगों के लिए मॉडल के रूप में Organoids: हेलिकोबेक्टर के मानव की संस्कृति और murine पेट Organoids और microinjection
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Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori. J. Vis. Exp. (105), e53359, doi:10.3791/53359 (2015).

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