Summary
Under bananflue kamper, atferdsmønstre observert, kjempe dynamikk, og tilknyttet læring og hukommelse er påvirket av eksperimentelle betingelser. Protokollen presenteres her beskriver en roman prosedyre som helt eliminerer håndtering av fluer under forsøkene. Dette forbedrer kampen dynamikk og tillater dannelsen av sterke "taper" effekter.
Abstract
Aggressiv oppførsel i Drosophila melanogaster er sammensatt av de sekvensielle ekspresjon av stereotypisk adferd mønstre (for analyse se 1). Dette komplekset atferd påvirkes av genetiske, hormonelle og miljømessige faktorer. Som i mange organismer, påvirker forrige kampopplevelse kampstrategi av fluer og utfallet av senere konkurranser: å miste en kamp øker sannsynligheten for å tape senere konkurranser, avslører "taper" effekter som trolig involverer læring og hukommelse 2-4. Læring og hukommelse som følger uttrykk for komplekse sosiale atferd som aggresjon, er følsom for pre-test håndtering av dyr 5,6. Mange eksperimentelle prosedyrer brukes i forskjellige laboratorier for å studere aggresjon 7-9 imidlertid ikke rutinemessig brukt protokoll som utelukker håndtering av fluene er for tiden tilgjengelig. Her rapporterer vi en ny atferds apparat som eliminerer håndtering av fluer, ved hjelp instead sine medfødte negative geotactic svar å flytte dyrene inn i eller ut av kamp kamre. I denne protokollen, er små sirkulære kamparenaer som inneholder en mat cup delt i to like halvdeler av en flyttbar plastglidebryteren før innføring av fluer. Fluer skriv kamre fra sine hjem isolasjon ampuller via skyvekammerdører og geotaxis. Ved fjerning av glidere plast, fluer står fritt til å samhandle. Etter bestemte tidsperioder, er fluer igjen separert ved glidebrytere for påfølgende eksperimentering. Alt dette er gjort lett uten håndtering av individuelle fluer. Dette apparatet har en ny tilnærming for å studere aggresjon og tilhørende læring og hukommelse, inkludert dannelsen av "taper" effekter i flue kamper. I tillegg kan denne nye generell atferdsapparat brukes til å studere andre sosiale atferd av fluer og bør generelt være av interesse for å undersøke erfaringsmessige endringer i fundamentale atferdsprosesser.
Introduction
Aggresjon i dyre systemer er sterkt knyttet til oppkjøpet og beholdning av ressurser som mat, territorium og mates. Gitt den viktige rollen dette spiller i trenings av enkeltpersoner, er det ikke overraskende at aggresjon har utviklet seg over dyreriket. Som en adaptiv egenskap som direkte fordeler enkeltpersoner, er en sterk læring og hukommelse komponent forbundet med aggresjon. I konkurransen om sosial rang, påvirker forrige kampopplevelse utfallet av senere konkurranser. Generelt tidligere tapende erfaring øker, og vinne erfaring minsker sannsynligheten for å miste senere konkurranser (kalt "taper" og "Vinner" effekter). "Loser" effekter har blitt observert i et bredt spekter av arter, og noen rapporter tyder på at disse kan vare i flere dager mens "Vinner" effekter vanligvis er av kortere varighet 2,10,11.
Den første rapporten av aggressiv atferdi fruktfluer (D. ampelophila) var Sturtevant i 1915 i en opptatt av sex anerkjennelse og kjønnsseleksjon 12 papir. Et halvt århundre senere, mer komplette undersøkelser av mannlig bananflue aggresjon ble gjort, som beskrev de fleste av atferdsmønstre observert under fruktflue kamper. Disse eksperimentene ble for det meste utført i små grupper av mannlige og kvinnelige fluer observert i løpet av timer 13-15. Nylig, med tillegg av kraftige genetiske verktøy, dyadic enkelt sex kampoppsett og kortere perioder med observasjon, D. melanogaster har dukket opp som en viktig modellsystem for å studere biologi aggresjon 1,16. Analyse av kamper mellom samme kjønn par av mannlige og kvinnelige fluer vist at aggresjon innebærer stereotype atferdsmønstre som overgangen fra den ene til den andre i en statistisk pålitelig måte 1,17. Noen av de atferdsmønstre observert er kjønnsspesifikk mens andre er observert i kampens i begge kjønn. Mann kamper går til høyere intensitetsnivåer enn kvinnelige kamper og resultat i dannelsen av dominans relasjoner med klare "vinnere" og "tapere". I dag har mange laboratorier begynt å undersøke biokjemiske 18, nevrale 7,19-21, og genetiske 22 fundamentet for aggresjon. Dessverre, til en meta-analyse av studier få innsikt i kampen dynamikk og dannelse og vedlikehold av dominans relasjoner er problematisk på grunn av bruk av et mangfold av eksperimentelle prosedyrer i forskjellige laboratorier. Hovedsak alle de teknikkene som er beskrevet i litteraturen bære håndtering og manipulering av fluer å introdusere dem til arenaer 19,23,24 og i løpet av atferdseksperiment 3,4 overføre fluer ut av arenaer. Forsiktig aspirasjon er den vanligste måten å manipulere fluer 3,4,23-25, men kald eller CO 2 anestesi brukes også 9,26, selv om porrige studier allerede har rapportert at disse prosedyrene har skadelige effekter på fly atferd 27,28. En periode på minst 24 timer anbefales etter bruk av bedøvelsesmidler for å redusere sine effekter på atferd 29,30.
Fluer lære av tidligere kamperfaring og endre deres atferds bruksmønster i nye situasjoner, noe som tyder på at læring og hukommelse følge og er en konsekvens av agonistiske møter. I den forstand, fly kamper ligner til operant betinging læringssituasjoner der flyr lære at en strategi har fungert, og deretter bruke det mer og oftere under påfølgende møter. Fluer endre sine kampstrategier etter dominans relasjoner er etablert i løpet av kamper, med vinnere utagerer mer og mer og tapere mindre og mindre. Etter en periode med separasjon, tidligere tapere viser mye mer underdanig atferd og er svært sannsynlig å miste 2 nd kjemper da sammen med naive fltallet eller tidligere vinnere 3,4. Imidlertid har fraværet av en eksperimentell prosedyre som utelukker håndtering av fluer gjort detaljerte studier av "taper" effekter vanskelige. I en fersk undersøkelse, vi sammenlignet to eksperimentelle prosedyrer brukes rutinemessig i laboratorier (aspirasjon og kald-bedøvelse) å innføre fluer i atferds kamre til ny prosedyre som fjerner håndtering. Resultatene viste at kald-anestesi hadde langt større negative effekter på aggresjon enn håpet, men selv aspirasjon redusert nivå av aggressivitet av fluer. Aspirasjon gjorde imidlertid føre til svært betydelige effekter på læring og hukommelse som følger aggresjon. Etter identisk protokoll med to eksperimentelle prosedyrer (aspirasjon og ingen håndtering), en robust "taper" effekten ble bare observert ved håndteringen av fluer ble eliminert fra den eksperimentelle prosedyren 5,6.
Ideelt sett studier av Drosophila aggresjon i Laborier bør inneholde miljø situasjoner som flyr normalt møter i naturen (konkurranse om ressurser, territorium for å forsvare og plass til å flykte). I tillegg bør forsøksbetingelser bli optimalisert for å indusere en pålitelig måte, å observere og tolke oppførsel som undersøkes (forsøker å minimere dyr håndtering, begrense bruken av CO 2 som bedøvelse, og standardisere de eksperimentelle prosedyrer). I forsøket på å løse de fleste eller alle av disse problemene, har vi designet en ny atferds apparat som eliminerer håndtering av fluer før, under og etter introdusere dem til atferds arenaer. Med disse apparater, fluer bruke sine medfødte negative geotaxis å bli flyttet og overføres inn i og ut av kampen kamre. Ved å eliminere håndtering av fluer, har som mål protokollen til: (a) redusere atferds variasjonen mellom individer; (b) redusere tiden som er nødvendig for fluer å samhandle og generere klare dominans relasjoner (hanner); og (c) på en pålitelig måte å indusere sterk nok behavioRAL endringer for å tillate dannelsen av "taper" effekter.
Denne protokollen beskriver en ny eksperimentell apparatur og en trinnvis fremgangsmåte for å analysere aggresjon og for å tillate dannelsen av en sterk "taper" effekt i D. melanogaster. Vi forventer at dette atferds apparat kan enkelt tilpasses for studiet av andre sosiale atferd utvist av fruktfluer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Følgende er en steg-for-steg beskrivelse av den eksperimentelle protokollen vi bruker for å tillate pålitelig utløser aggresjon mellom par av mannlige fruktfluer (D. melanogaster). Denne prosedyren induserer dannelsen av en "taper" effekt. Ved hjelp av denne protokollen, en kortsiktig "vinner" effekt også har nylig blitt rapportert 5,6. Figur 1 viser tidslinjen av de atferdsmessige eksperimenter.
Figur 1. Tidslinje aggresjon eksperiment. På dag 1, blir sent stadium mannlige puppe (når vingene blir svart) isolert i nylagde isolasjon ampuller. På dag 5 etter dukker opp som voksne, er 4 dager gamle mannlige fluer bedøvet med CO 2 og malt med ulike farger for identifikasjon. På dag 7, mat kopper og kamp kamre erforberedt på å sette opp de atferdsmessige eksperimenter. To 6-7 daggamle voksne menn er lastet inn i kamrene og er i stand til å samhandle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. Dag 1: Sosial Isolering av puppe
- Heve og opprettholde fluebestanden i et miljøkontrollert 12 timers lys / 12 timers mørk syklus-inkubator ved 25 ° C og 50% relativ fuktighet.
- Forbered isolasjon hetteglass: Varm fersk fly mat til smeltet. Ved hjelp av en Pasteur pipette, overføre om lag 1,5 ml smeltet fly mat til enkelt tomme glass prøverør (1,6 x 10 cm). La maten å stivne.
- Isolere puppe: Med en fin pensel, forsiktig fjerne et sent stadium mannlige puppe (når vingene blir svart) fra aksjehetteglasset og legg den på siden av en nylaget mat som inneholder reagensrør. Nære isolasjon ampuller med bomull (figur 2).
Figur 2. sosial isolasjon. En sent stadium mannlige puppe er plassert på siden på en nylaget isolasjon hetteglass. Isolation hetteglass som inneholder puppe er plassert i 12 timers lys / 12 timers mørke inkubator ved 25 ° C og 50% relativ luftfuktighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Dag 5: Maleri Fluenes for individuelle identifikasjonsformål
- Utfør dette trinnet på dag 5 med 4 daggamle mannlige fluer og to dager før de atferdsmessige eksperimenter for å minimere den negative effekten av CO 2 anestesi.
- Bedøve fly med CO 2. Med en fin tannpirker, plasserer en liten prikk av akrylmaling på thorax. Unngå å plassere maling på hodet, vingene, magen eller beina (figur 3).
- La malingen tørke i ca 10 sek, og forsiktig overføre fluer tilbake til sine opprinnelige isolasjon ampuller.
- Returner isolasjon ampuller til 12 timers lys / 12 timer mørke-inkubator ved 25 ° C og 50% relativ fuktighet.
Figur 3. Individuell identifikasjon. Etter bedøvelse en flue med CO 2, en liten dråpe av akrylmaling er brukt på thorax. For individuell identifikasjon formål, forskjellige farger brukes (hvit og blå her). Se omtale nedenfor om bruk av CO 2 på dette trinnet. Klikk her for å se en større versjon av denne Figure.
3. Dag 7: Klar Apparatus
- Forbered Mat Cups:
- Varm fersk flue mat før den smelter.
- Ved hjelp av en Pasteur-pipette, overføres omtrent 0,8 ml mat til lokket på en med skrulokk (1,5 cm diameter, 1 cm høyde) og avkjøl. Unngå luftbobler.
- Gjøre fersk gjær pasta ved å blande tørrgjær med et par dråper vann. Når tykk, bruke en liten dråpe gjær lim til midten av maten cup overflaten med en tannpirker (figur 4).
Figur 4. Klar maten cup. En mat cup er tilberedt med fersk flue mat. Etter maten stivner, er en prikk av gjær lime plassert i sentrum av maten cup overflaten. Vennligst klikk her for å view en større versjon av dette tallet.
- Forbered Individuelle Fighting Chambers:
- Grundig vask apparater og individuelle kamp kamre med vann før bruk hver gang. Tørk med papirhåndkle før bruk.
- Plasser en mat cup i midten av hver kjemper kammeret og fest på plass med en dråpe kitt.
- Dekk kamp kamre med apparatets lokk (figur 5).
- Plasser apparatet inn i en høy luftfuktighet (60%) ved 25 ° C.
- Plasser en lyskilde over apparatet for å belyse de stridende kamre og sette et videokamera for opptak ovenfra.
Figur 5. Klargjøring av enkelte kampkammeret. Den tilberedes mat kopp med en prikk av gjær lim på overflaten er fast i vasket enkelte fighting kamre. Chambers er lukket med to-delt deksel slik at innsetting av en ugjennomsiktig plast skillelinjen i individuelle kamp kamre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Dag 7: Behavioral Experiment
- Utfør atferdseksperimenter med 6-7 dager gamle mannlige fluer.
- Sett plast skillevegger i hver kjemper kammer.
- Fjern det bomull pluggen fra isolasjonsrøret og posisjonere røret under et åpent hull på siden av apparatet.
- La fly inn i kammeret bekjempelse av negative geotaxis, vanligvis i løpet av noen få sekunder.
- Lukke skyvevegg etter at flua har forlatt røret og inn i kammeret.
- Gjenta fremgangsmåten for å innføre den andre fly inn i kampen kammeret på den andre siden av apparatet.
- Plasser apparatet tilbake i den opplyste videotaping posisjon.
- Begynn videoopptak og fjern plast skillet for å tillate fluer til å samhandle.
- For Aggresjon Experiments:
- I disse eksperimentene, kjemper posten i minst 20 min for å sikre dannelsen av sterke dominans relasjoner.
- Etter ønsket tid, stoppe videoopptak.
- Fjern fluer fra kamp kamrene ved å reversere prosedyren beskrevet ovenfor.
- Grundig vask atferds apparat med mild såpe og vann etter hver bruk, og skyll.
- For "Loser" Effekt Experiments:
Merk: I disse forsøk blir først kamper betraktes som kondisjoneringsfasen og den andre kamper som testfasen. Den hvileperiode mellom kamper kan variere, men 10 min tillater dannelsen av en sterk "taper" effekt.- Følg prosedyren beskrevet ovenfor for å utføre en første kamp.
- KRITISK STEP: Å indusere dannelsen av en "taper" mentalitet, eONTROLLER at første kamper er minst 20 min lang for å etablere sterke dominans relasjoner. Etter 20 min, sett inn plast skillelinjen i kamp kamre for å skille fluene.
- Etter en 10 min periode med hvile, forsiktig fjerne plasten skillet for å tillate fluer å samhandle for andre kamper.
- På slutten av den andre 20 min kamp, stoppe videoopptak.
- Fjern fluer fra atferds kamre som ovenfor.
- Igjen, rengjør atferdsapparat.
- For Aggresjon Experiments:
5. Behavioral Analysis
- Overføre filmer
- Koble kameraer til datamaskinen.
- Konverter fluer MTS til .mov fluer og bli med filmer klipp sammen, ved hjelp av video konvertering programvare og alternativet "bli med utvalgte klipp".
- Observere og analysere hver film med video-leser programvare.
- Scoring Behavior
Merk: Dette kan gjøres manuelt eller ossing atferdsanalyse program programvare hvis det er tilgjengelig. Illustrasjonen nedenfor beskriver en mulig manuell analyse for en "taper" effekt.- Resultat tidspunktet for det første møtet mellom de flyr på mat cup (møter er interaksjoner mellom par av fluer som varer minst 2 sek) og tidspunktet for utseendet på første utfall (et atferdsmønster der en flue stiger høyt på sin bakbena og snaps ned på og forsøker å ta tak i motstanderen). Deretter scorer latency å gynge (intervallet mellom første møte og første utfall).
- Telle det totale antall møter og lunges løpet av en kamp.
Merk: Dersom det er ønskelig, kan man også scorer andre atferdsmønstre, som fløy trussel, boksing, fekting, retrett eller antall møter før den første utfall, for eksempel. - Resultat tidspunktet for etablering av dominans (tid mellom første møte og tiden når man flyr retretter for tre ganger av maten cup akteruter mottatt lunges). Notat som fly er vinneren og som taperen av kampen.
- Beregne en "Loser" Effect
- Del antall kamper der tidligere tapere taper 2 nd kamper (tapere som mister: LL) av det totale antall kamper, og multipliser med 100. Den oppnådde prosent representerer "taperen" effekt:
[(# Fluer LL) / (# totalt kamp)] x 100 - Bruk en Chi-kvadrat test for å sammenligne om "taperen" effekten er statistisk forskjellig fra forventet verdi på 50%.
- Del antall kamper der tidligere tapere taper 2 nd kamper (tapere som mister: LL) av det totale antall kamper, og multipliser med 100. Den oppnådde prosent representerer "taperen" effekt:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette avsnittet viser utformingen av atferdskammeret og analyse av et typisk sett av adferdsforsøk etter den protokoll som er beskrevet ovenfor, som måler aggresjon og dannelsen av en "taper" effekt. Illustreres også er eksempler på andre atferd som kan måles ved hjelp av dette apparatet.
Figur 6 viser en skjematisk fremstilling av det nye apparat. Apparatet består av tre sylindriske brønner (dimensjon: 22,86 mm diameter, 17 mm høyde), som er de kamp kamre. Den todelte lokket lukker kamp kamre på toppen og tillater innsetting av en tynn gjennomsiktig plast barriere som deler kamrene i to like deler. På hver side av apparatet, skyvevegger med tre hull (mm diameter 15.88) tillate lasting av fluer inn i kamp saler med negative geotaxis direkte fra deres isolasjon ampuller. Etter fluer inn kamp kamre, skyvevegger er brukd for å lukke sidene av alle kamrene. På dette punktet, de to fluene er innenfor kamparenaer, men kan ikke kommunisere på grunn av skillevegger. Ved å fjerne disse, fluene står fritt til å samhandle og den påfølgende atferdsmønstre kan observeres og registreres.
Aggresjon eksperimenter: 38 kamper mellom par av villtype CS hanner ble utført. Ulike atferdsparametre ble scoret mens fluer var på mat kopper og dynamikken i kamper ble analysert (tabell 1). Et gjennomsnitt på 24 møter (korte møter mellom fluer), 54 lunges (en indikator på høyere intensitet fighting) ble observert i løpet av en 20 min periode, med første utfall vanligvis leveres i løpet av 2. møte. I gjennomsnitt ble det en st møte, den 1. utfall og tid til å etablere dominans sett 2, 4 og 8 min etter starten av opptaket. I de fleste tilfeller de siste 12 min av kamper består av repeterende sekvenser med høy intensitet encounters med underordnede dyr nærmer seg, blir angrepet og trekker seg tilbake, forsterke dominans eller underkastende status for hvert dyr.
"Loser" effekt eksperimenter: For å søke etter dannelsen av en "taper" effekt, 21 1 st kamper av 20 min varighet ble utført mellom par av villtype CS hanner. Kammeret glid deleren deretter ble satt inn for å skille fluer. Etter 10 min var 2 nd 20 min kamper utført mellom (a) tidligere tapere og kjente vinnere eller (b) tidligere tapere og ukjente vinnere og disse ble analysert som ovenfor (figur 7). I begge forholdene, 20 tidligere tapere tapt sine 2 nd kamper (95,5%), viser en robust "taper" effekt. Kampen-resultatene ble sammenlignet med forventet verdi av 50-50 med en to-tailed Chi-kvadrat analyse og en svært signifikant "taper" effekten ble funnet. Andre atferdsendringer ble observert i å miste enkeltpersonermellom 1 og 2. kjemper medfølgende dannelsen av "taperen" effekt 5.
Annen atferd enn aggresjon kan studeres i apparatet: å illustrere, ble frieri og locomotion eksperimenter utført (T stand 2). For frieri, ble mannlige og kvinnelige fluer lastet av negative geotaxis inn i atferdskamrene, ble delere fjernet og atferds frieri mønstre ble scoret. 34 eksperimenter ble utført og ventetider til bane (tid mellom første møtet og den første frieri atferd = 7 sek) og for å parre seg (tid mellom første møtet og copulation = 4 min) ble analysert. Bare to hanner lyktes ikke i copulating løpet av 15 min observasjonstiden. Frieri Vigor Index (brøkdel av tiden at menn brukte frierføtter kvinner i løpet av en 15 minutters periode etter første frieri atferdsmønster) ble scoret på 75% (tabell 2). For bevegelse enten syndgle fluer eller gruppe på 10 fluer ble innført i kammere, og det totale antall midtlinjeoverganger i løpet av 5 minutter ble tellet. Enkelt fluer krysser midtlinjen av kammeret gjennomsnittlig 73 ganger i løpet av 5 min, mens individuelle flyr i grupper krysser midtlinjen i gjennomsnitt 45 ganger / 5 min (Tabell 2). Denne reduksjonen observert når fluene er i grupper kan forklares med redusert plass per fly og etter den tid de tilbringer i samspill med hverandre i stedet for å utforske territoriet.
Figur 6. Skjematisk fremstilling av atferds kammeret. (A) fra siden av apparatet. Det nye apparat består av tre separate deler: (a) en plastblokk som inneholder tre individer slåss kamre; (b) to skyvevegger med tre hull (15,88 mm diameter) i hver; og (c) den todelte lokket på toppen. (B) Topriss av apparatet. Dimensjonene av plast blokken (a) er 36,83 mm x 123.19 mm. Hver enkelt kamp kammer har en diameter på 22,86 mm og en høyde på 17 mm. Hullene på siden som gjør at lasting av fluene har en diameter på 15,88 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Dannelsen av en robust "taper" effekt. En betydelig "taper" effekt (andel av tapere som mister 2 nd kjemper observeres når tidligere tapere ble paret (a) med kjente vinnerne (n = 21, *** p <0,0001) eller (b) med ukjente vinnerne for deres 2 nd kamper (n = 21, *** p <0,0001) (Lose: 95,5%, Win. 4,5%, No trekker) Pllette klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Atferdsparametre | Enhet | Tid (sek) | n |
| Encounters | 24 ± 2 | 38 | |
| Lunges | 54 ± 6 | 38 | |
| Antall møter før første utfall | 2 ± 0,3 | 38 | |
| Tid til første møte | 145 ± 20 | 38 | |
| Tidspunktet for første utfall | 229 ± 26 | 38 | |
| Tidspunkt for dominans | 475 ± 56 | 34 | |
| Ventetid å gynge | 87 ± 20 | 38 | |
| Ventetid til dominans | 342 ± 51 | 34 |
Tabell 1:. Dynamics av agonistiske interaksjoner mellom par av mannlige fluer gjennomsnittsverdier ± SEM beregnes for hver parameter scoret som indikatorer på aggressivitet. Det totale antall møter og lunges, og antalletav møter før første utfall ble scoret. Tider på første møte, første utfall og dominans, og ventetider å gynge og dominans er presentert i sek ± SEM (n> 34).
| Atferdsparametre | Tid (sek) | Enhet | (%) | n |
| Frieri atferd | ||||
| Ventetid til retten | 7 ± 3 | 34 | ||
| Ventetid for å parre | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Frieri Vigor Index | 75 ± 0.05 | 34 | ||
| Locomotion | ||||
| Totalt midtlinje kors (enkelt flue) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Totalt midtlinje kors (gruppe av fluer) | 45 ± 3 | 20 |
Tabell 2:. Analyse av frieri atferd og locomotion gjennomsnittsverdier ± SEM er beregnet for ventetider til retten og parre seg (i sek). Et frieri vigør index(i% av tid brukt frierføtter etter første frieri display) ble scoret etter menn og kvinner ble lastet inn i atferds kamre av negative geotaxis (n> 32). Bevegelse, hvis enkelt fluer eller grupper på 10 fluer ble lastet inn i kamrene, ble scoret ved å telle det totale antall midtlinjeoverganger i løpet av 5 min (n = 48 og 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den moderne æra av å bruke Drosophila med sin kraftige genetiske metoder som modellorganisme for studier av aggresjon begynte omtrent et dusin år siden med innføringen av nye eksperimentelle arenaer hvor pålitelig slåss atferd kan oppnås med enkle par fluer 1,7, 8,17,19. Disse arenaene inkludert ønskede ressurser (en mat cup, potensielle partnere) og en plass for loser flyr å trekke inn. Når resultatene oppnådd med disse arenaer ble tilsatt til tidligere kunnskap om fruktflue kjempe adferd, ble Drosophila melanogaster godt etablert som en svært ønskelig modellsystem for å undersøke et kompleks oppførsel som aggresjon og brukes i mange laboratorier. De oppsummerte resultatene oppnådd avslørte at: (a) flyr utstillings aggresjon i konkurranse om matressurser, tilgang til kamerater eller for forsvar av territorium 14,15; (b) kamper er sammensatt av en sekvensiell serie av stereotype atferdsmønstre 1; (c)mannlige og kvinnelige fluer kjempe i samme kjønn motstandere (noen mønstre er mann bestemt, noen er kvinner spesifikke og noen er delt av begge kjønn) 17; (d) bare mannlige kamper går til høy intensitet nivåer og føre til dannelse av hierarkiske relasjoner med klar «vinner» og «taperen» flyr 17; (e) et enkelt gen resultatløst, av kjønnsbestemmelse hierarki, avgjør om fluer slåss som menn eller kvinner 16 og (f) flere hormonelle stoffer inkludert aminer og peptider påvirke aggresjon hos bananfluer 7,8,19,20.
Her blir en ny fremgangsmåte som er beskrevet for studiet av bananflue aggresjon der håndtering av fluene i løpet av forsøkene elimineres. Dette gir en betydelig forbedring i den eksperimentelle protokollen som alle atferdsmessige målinger blir forbedret 5,6, ny informasjon vedrørende oppførselen er blitt oppnådd og læring og hukommelse som følgermannlige flue kamper er kraftig forbedret. For å illustrere, er kun to tidligere studier rapporterte dannelsen av "taper" effekter i dette modellsystemet 3,4. I begge disse ble større kamre enn de som er beskrevet i denne protokoll som brukes, fluer ble overført inn og ut av kamparenaer ved aspirasjon, og lengre kamptider og intervaller mellom kamper var nødvendig å generere klare "taper" effekter. Våre siste studien viste at eliminere håndtering fra den eksperimentelle protokollen, klare dominans relasjoner mellom par av D. melanogaster mannlige fluer er observert etter bare 20 minutter av interaksjon. Denne tid er tilstrekkelig til å fremkalle vesentlige endringer i kampstrategier i begge fluer under 1 st kamper og å pålitelig observere dannelsen av sterke "taper" effekter i 2 nd kamper. I tillegg, for første gang, klare kortsiktige "Vinner" effekter også ble observert under 2 ndkjemper 5,6.
For suksess med denne protokollen, noen kritiske punkter må være registrert. Å indusere og observere robuste aggressive atferdsmønstre Vi anbefaler å bruke 6-7 dager gammel mannlige fluer som har blitt holdt i sosial isolasjon siden slutten pupal scenen. Generelt tilgjengeligheten av ressurser som flyr er villige til å konkurrere over (mat, mates) er svært ønskelig for å oppnå sterk kamp atferd og etablering av dominans relasjoner. I løpet av denne protokollen, fluer malt etter anestesi ved hjelp av CO 2, og som kan være av interesse som vår nylig publisert studie viser at bedøvelse fluer alvorlig forstyrrer påfølgende oppførsel fem. Mulige måter å unngå anestesi kan være å ikke male dyr dersom det ikke er viktig å holde styr på enkeltpersoner. Ved maling er imidlertid nødvendig anestesi bør brukes 48 timer før dyrene blir brukt til eksperimenter, eller alternative fremgangsmåter for å identifisereenkeltpersoner også kan brukes 31. Å indusere sterk "taper" og "vinner" effekter, er det avgjørende at fluer etablere og opprettholde et dominans forhold under første kamper. I den protokoll som presenteres her, ved hjelp av villtype-CS-stammen ved 25 ° C, er tilstrekkelig til å generere store "vinnere" og "taper" og å observere endringer i kampen strategier for begge individer 20 min for interaksjon. I forsøk utført ved forskjellige temperaturer enn 25 ° C eller med andre genotyper enn CS, derimot, kan den gjennomsnittlige tiden for å etablere en robust dominans forholdet være annerledes. Følgelig bør kampperioden justeres ved å utføre sett av preliminære eksperimenter. Til slutt, hvordan par fluer skilles etter sine første kamper kan være viktig for å bevare minnet om kampen utfall. Det er sannsynligvis viktig for å redusere bevegelse av apparatet, og for å være milde under innføringen av plasten deleren i rekkefølgefor å minimere forstyrrelse av dyrene.
Utformingen av apparatet og den todelte deksel slik at separasjon av atferds kamre i to like avdelinger, gjør det enkelt å skille de to fluer etter første kamper og å innføre nye motstandere i 2. kamper. Også, som vist i tabell 2, med små justeringer av den eksperimentelle protokollen, det samme apparat kan brukes til å studere frieri, bevegelse eller faktisk de fleste bananflue atferd i hva som bør være mindre stressende betingelser for forsøksdyrene. Mulige ytterligere forbedringer på prosedyren kan være å innføre en form for termostatstyring i apparatet (piezoelektrisk element eller en coil å sirkulere temperaturkontrollert væske) for enkel bruk av temperatursensitive reagenser (shibire ts1, dTRPA1 kanal).
I sammendrag er det utviklet en ny anordning som gir en ny strategi for studiet av aggresjon in fruktfluer der håndtering av fluer før, under og etter forsøkene ble eliminert. Alle atferdsmessige tiltak er forbedret med den nye anordning i forhold til en rekke andre vanlige måter å håndtere fluer. Kanskje en mer generell kommentar å gjøre er at i hovedsak alle atferds eksperimenter i laboratoriet miljøer involverer forskere plukke opp eller på andre måter, håndtering dyr. Til tross for forsøk på å være mild i denne håndteringen, er dette trolig være stressende for dyrene. Det kan være nyttig å utvikle metoder for å eliminere denne håndtering når det er mulig, slik at dyrene kan observeres under svakt mer normale betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra National Institute of General Medical Sciences (GM099883 og GM074675) til EAK De organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker folk fra vårt verksted ved Harvard Medical School for utformingen av atferds apparat (kontakt: http://mikesmachine.com).
Forfatter bidrag: ST, BC utviklet atferdsapparat. ST utviklet og optimalisert den eksperimentelle protokollen. ST og BC utført og analysert eksperimentene. ST, EAK og BC skrev avisen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
