Abstract
Tymus, primärorgan för generering av ap T-celler och ryggraden i det adaptiva immunsystemet hos ryggradsdjur, har länge ansetts vara den enda källan till αβT celler. Ändå börjar tymisk involution tidigt i livet leder till en drastiskt minskad produktion av naiva αβT celler i periferin. Ändå kan även hundraåringar bygga immunitet mot nyförvärvade patogener. Ny forskning tyder på extrathymic αβT cellutveckling, men vår förståelse av vägar som kan kompensera för thymic funktionsförlust är fortfarande rudimental. γδ T-celler är medfödda lymfocyter som utgör den huvudsakliga T-cellsunderuppsättning i vävnaderna. Vi har nyligen tillskrivits en hittills föga uppskattad enastående funktion till en γδ T-cellunderuppsättning genom att visa att den knappa enheten av CD4 + Vδ1 + γδ T-celler kan transdifferentiera in αβT celler i inflammatoriska tillstånd. Här, vi provide protokollet för isolering av denna föregångare från perifert blod och dess efterföljande odling. Vδ1 celler positivt anrikas från PBMC från friska humana donatorer med hjälp av magnetiska kulor, följt av ett andra steg, vari vi riktar den knappa fraktionen av CD4 + -celler med en ytterligare magnetisk märkningsteknik. Den magnetiska kraften av den andra märkningen överstiger en av de första magnetiska etiketten, och medger sålunda effektiv, kvantitativ och specifik positiv isolering av den intressanta populationen. Vi introducerar sedan skick för kloning och effektivt expandera cellerna och för identifiering av de genererade kloner genom FACS-analysteknik och kultur. Således tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för rening, kultur och ex vivo expansion av CD4 ^ Vδ1 + γδ T-celler. Denna kunskap är en förutsättning för studier som rör detta αβT cell progenitor`s biologi och för dem som syftar till IDEntify de molekylära triggers som är involverade i dess transdifferentiering.
Introduction
I ryggradsdjur, adaptiv immunitet som är strukturerad i cellulär och en humoral del av immunitet spelar en viktig roll i försvaret mot patogener. Erkännandet av ett brett spektrum av antigener medieras av hyperpolymorfa T- och B-cellreceptorer (TCR / BCR), som med hänsyn till T-celler antas produceras huvudsakligen i tymus ett. Därtill, hematopoetiska stamceller (HSCs), som härrör från benmärg, utsäde bräss och differentiera längs väldefinierade steg slutligen ger upphov till alla T cellinjer. Bräss sådd stamceller är CD4 - och CD8 - och därmed utgör omogna, dubbel negativ (DN) tymocyt fraktion. Bräss-härledda signaler inducerar då deras härstamning engagemang och differentieringen i antingen ap eller γδ T-celler. Uttrycket av funktionellt rearrangerade TCR-y och TCR-ö kedjegener i DN2 / 3 tymocyter leder till y δTCR komplex, som driver celldelning end främja differentiering till γ AT celler 2,3. Däremot ombildning av en funktionell TCR-β-kedjan, som kan koppla ihop med preTα att bygga en preTCR pT, inducerar transkriptionstyst av TCR-γ kedjan i DN3 tymocyter och deras övergång till CD4 + CD8 + dubbel positiva tymocyter 4 . I detta skede, rekombination av TCR-α-kedjan förekommer, ta bort TCR-δ-lokuset som ligger inbäddat i den TCR-α-lokuset, på så sätt att upphäva produktion en γδTCR i dessa celler oåterkalleligen 5-9. Ändrad αβTCRs därefter ut för att deras förmåga att binda själv MHC svagt (positiv selektion), som inte får överstiga en viss tröskel för att undvika autoimmunitet (negativ selektion). Enligt deras förmåga att binda MHC klass I eller II, de utvalda αβT cellerna utvecklas till en enda positiva CD4 + eller CD8 + T-celler, som exit bräss som naiva T-celler.
Men börjar involution av tymus tidigt i livet leder till exponentiellt minskad produktion av naiva T-celler som är nästan släckt efter tonåren 10. Trots storleken på cellpoolen T förblir konstant under hela livet, vilket kan förklaras endast delvis av post tymisk homeostatiska proliferation av T-celler och spridningen av långlivat immunologiskt minne 11. Följaktligen måste extrathymic cellutveckling T inträffa. Ny forskning har vunnit betydande attraktion som kännetecknas αβT cellföregångare, som-at extrathymic sites-gav upphov till funktionella ap T-celler 12-17. Ändå är detaljerad kunskap om extrathymic αβT cellprekursorer som oberoende av en tymus differentieras till αβT celler fragment som bakgrunden som vi har på väg de tar därmed.
Vi har nyligen identifierat lilla T-cells enhet Vδ1 + CD4 ^ γδT celler som en extrathymic αβT cell prognitor 18, som när den isoleras från perifert blod från friska humana donatorer kan transdifferentiera in αβT celler i en mild inflammatorisk miljö. Intressant och i motsats till den homeostatiska spridning av post-tymiska T-celler, transdifferentiering av Vδ1 CD4 + celler genererar nya T-cellreceptorer, vilket bredda repertoaren mångfald, så att potentiella nya antigener kan identifieras och får skydd värden mot nyförvärvade patogener. Detta bidrar till plasticiteten av T-celler och lägger till en hittills föga uppskattad ny väg för extrathymic cellutveckling T.
Den kvantitativa isolering från lymfocytiska källor, generering av encelliga klonade djur och deras effektiva expansionen är avgörande för målet att identifiera de markörer och molekyler som utlöser denna αβT cell precursor`s extrathymic utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethic uttalande: Alla förfaranden genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkändes av kliniska etiska kommittén vid universitetet i Tübingen (projekt 38 / 2009B02 och 470 / 2013B02).
1. Isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC)
- Ta 50-100 ml från en frisk frivillig via venpunktion med användning av en 50 ml spruta innehållande 1000 lU heparinsulfat och späd blodet 1: 2 med PBS (pH = 7,2).
- Skikt försiktigt 35 ml av blod: PBS-lösning på 15 ml blod separationslösning såsom Biocoll (d = 1,077 g / ml) i ett 50 ml koniskt rör. Centrifugera i 15 minuter vid 800 x g vid RT.
OBS: Broms får inte användas. - Samla cellerna hos lymfocytiska skiktet med en pipett och tvätta cellerna två gånger i åtminstone 50 ml PBS (Centrifugera i 12 min, vid 400 xg). Avlägsna supernatanten efter centrifugering med en pipett.
- Lyse kvarvarande erytrocyter genom att suspendera och incubrande av lymfatisk fraktionen med 1-5 ml av en hypotonisk buffertlösning för 2-4 minuter.
OBS: Exponeringens varaktighet och volym av lyseringsbuffert är beroende på den använda lyseringsbuffert och mängden röda blodkroppar kvar i lymfocytfraktionen. - Späd cellerna med PBS (01:10) och centrifugera vid 250 xg under 12 min och därefter återsuspendera och tvätta cellpelleten en gång i 10 ml PBS vid 300 xg under 12 minuter.
- Resuspendera lymfocyter i PBS och räkna cellerna i en Neubauer-räkningskammare med användning av trypanblått-lösning.
OBS: Vanligtvis är> 1 x 10 8-lymfocyter som erhållits från 100 ml nytaget perifert blod.
2. Isolering av Vδ1 T-celler
- Ta <1 x 10 6 isolerade lymfocyter för en inledande FACS bestämmer frekvensen av Vδ1 CD4 T-celler.
OBS: Befolknings storleken på denna T-cells enhet kan skilja sig kraftigt mellan individer och enligt deras immunologiska tillstånd. Typically, ca 1% av T-celler är Vδ1 + och ca 1-5% av Vδ1 + celler är CD4 +.- Späd cellerna med 1 ml FACS-buffert, som består av PBS innehållande 2% FCS och 5 mM EDTA. Centrifugera vid 660 x g under 2 minuter och dekantera supernatanten. Återflödes volym av ca 100 | il FACS-buffert är tillräcklig för den efterföljande färgning. Kortfattat virvel och inkubera cellerna med 5 pl Fc-Blocking Reagent för 5 minuter vid RT i ökad specificitet av FACS-färgning.
- Lägg till humana monoklonala antikroppar direkt till cellerna utan att ta bort Fc-Blocking Reagent. Se till att färga cellerna med antikroppar mot Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) och TCRαβ (01:25). Förbered isotypkontroll med motsvarande immunglobulinisotyperna. Inkubera cellerna med antikroppar under 20 min vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna i 1 ml FACS buffert (centrifug för 2 min, vid 660 xg), dekantera supernatant och fortsätt till FACS förvärv i den återstående buffertvolym.
- Pelletisera cellerna (som inte används i FACS-analys) genom centrifugering under 12 min; vid 300 g; 8 ° C. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellen pelletin 60 il MACS-buffert per 1 x 10 7 celler. Lägg 20 pl Fc-Blocking Reagent per 1 x 10 7 celler och inkubera under 5 min vid 4 ° C.
- Lägg 10 pl FITC-konjugerad anti-human-Vδ1 antikropp per 1 x 10 7 celler direkt till cellerna. Inkubera under 12 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna med användning av 14 ml MACS-buffert (centrifug under 12 min, vid 300 g, 8 ° C). Kassera supernatanten fullständigt och suspendera cellerna i 80 pl MACS buffert per 1x10 7 celler.
- Ta 1-2 x 10 5 celler och späda ut dem i 100 pl FACS buffert för kontroll av märkningen genom FACS-analys. Inga ytterligare tillsatser behövs för detta steg. Se till att det finns ett tillräck-ligt skillnad i ljusstyrka Vδ1 - och Vδ1 + celler. Om detta inte är fallet, upprepa steg 2,3) och 2,4).
- Lägg 20 pl anti-FITC mikropärlor per 1 x 10 7 celler till de kvarvarande cellerna, blanda väl och inkubera under 15 minuter i mörker vid 4 ° C. Därefter, tvätta cellerna med hjälp av åtminstone 10 ml MACS-buffert (centrifug för 12 min, vid 300 x g; 8 ° C).
- Under centrifugeringen, utjämna förkyld magnetisk kolonn placerades i en magnet med 500 pl MACS buffert.
- Resuspendera cellerna i 500 pl MACS-buffert (för cellantal högre än 1 x 10 8, skala upp denna volym därefter) och tillämpa cellerna försiktigt på kolonnen. Samla genomströmning innehåller Vδ1 - celler.
- Tvätta kolonnen tre gånger med 500 | il MACS-buffert och samla genomflödet igen i samma rör. Notera att behållaren måste vara tom före applicering buffert på kolonnen.
- Ta bort kolumnen från den magnetiska enheten och placera den i ett 15 ml koniskt rör. Snabbt spola kolonnen med 1 ml MACS buffert genom att försiktigt trycka kolven i kolonnen. Samla upp eluatet i ett rör.
OBS: För att erhålla en renhet av> 98%, är det oftast nödvändigt att upprepa steg 2,7-2,9) med en andra kolonn. - Verifiera renheten av cellerna genom FACS-analys 18 med samma antikropp panelen som tidigare (se 2.1.2) och räkna cellerna.
3. Isolering av Vδ1CD4 + T-celler
- Resuspendera 25 il CD4 pärlor med en virvel för> 30 sekunder. Tvätta pärlor (den minimala mängden som visat av tillverkaren) i 1 ml MACS-buffert i en 1,5 ml reaktionsröret genom att placera röret i en magnet för en minut. Kassera supernatanten försiktigt med en småskalig pipett (200 ul) och återsuspendera pärlorna i den ursprungliga volymen av MACS-buffert.
- Pelletisera Vδ1 + -celler (centrifug för ett2 min; vid 300 xg) och aspirera supernatanten och suspendera alla Vδ1 + cellerna i 500 l MACS-buffert och tillsätt dem till röret med pärlor. Blanda kraftigt och inkubera under 20 minuter vid 4 ° C med konstant lutning (t ex i en rotator).
- Placera röret innehållande cellerna i en magnet för 2 min. Kontrollera att det inte finns några rester i locket.
OBS: CD4 + celler kommer ha bundit de magnetiska pärlorna och fäst på sidan av röret som vetter mot magneten. - Öppna försiktigt locket samtidigt som röret inuti den magnetiska anordningen och samla supernatanten som innehåller CD4 - Vδ1 + celler med hjälp av en småskalig pipett. Placera CD4 - Vδ1 + celler i ett separat rör och placera detta rör in magneten igen för att undvika eventuellt kvarvarande CD4-celler eller pärlor från befolkningen.
- Tvätta CD4 - celler i 5 ml MACS-buffert (centrifug under 12 minuter, vid 300 xg) and resuspendera dem i en koncentration av 1 x 10 5 celler per 100 | il medium. CD4 - celler kan lätt odlas enligt de villkor som anges nedan (4.2).
- Placera röret med cellmålen CD4 + utanför magnetfältet, resuspendera cellerna i 500 mikroliter MACS-buffert och lägg tillbaka dem i den magnetiska anordningen. Upprepa steg 3,3-3,5 två gånger för att få en högre renhet. Avlägsna supernatanten genom pipettering
- Resuspendera CD4 + celler i 100 | il odlingsmedium (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin) och tillsätt 10 | il av en pärla avskiljningslösningen. Inkubera vid RT under 45 min med konstant lutning (t ex i en rotator).
- Placera cellerna i en magnet för en minut. Samla supernatanten innehållande däckfotsfritt Vδ1 + CD4 + -celler med användning av en småskalig pipett.
- Utanför av magneten, resuspendera pärlorna med 100 | il odlingsmedia och upprepasteg 3,6 och 3,7 två gånger för att få högre cellantal av CD4 + celler.
- Pelletisera cellerna (centrifugera vid 300 xg, för 12 min) och kassera supernatanten fullständigt genom pipettering. Resuspendera cellerna i färska, förvärmda media och räkna dem. Undersök renheten hos Vδ1 + CD4 + celler genom FACS-analys avbildas i steg 2.1.1-2.1.3.
4. Encelliga Kloning av Limited Späd
- Isolera perifera mononukleära blodceller (PBMC) från en allogen donator såsom avbildas i 1,1-1,6.
- Bestråla 2,5 x 10 7 allogena PBMCs med 80 Gy i 25 ml odlingsmedium med hjälp av γ-strålning.
- Lägg IL-2 (200 E / ml), IL-7 (20 ng / ml) och PHA (2 | ig / ml) för att de bestrålade matarceller och distribuera dem i 96-brunnars U-form-plattor, 5 x 10 4 matare celler i 50 fil per brunn.
- Späd Vδ1 + CD4 + celler till en koncentration av 0,3 celler per 50 pl. PipetTE 50 pl av cellösningen till varje brunn som hyser de bestrålade celler och cytokiner.
OBS: Således är cytokinema utspädes till den slutliga koncentrationen av 100 E / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 och 1 | ig / ml PHA. Inkubera 96-brunnsplattor i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 fuktad atmosfär.- Eventuellt, odla återstående renade Vδ1 + CD4 + -celler som bulkodling under samma odlingsbetingelser som klonerna.
- Förse cellerna var 3-4 dagar med cytokiner och nytt medium. För detta utbyte halv av mediet i brunnarna med 50 ul färskt medium genom pipettering. Lägg 2-faldig koncentration av cytokiner till varje tillskott. Lägg 5x10 4 bestrålade matarceller per brunn vartannat v utfodring.
- Med hjälp av ett mikroskop, observera första kloner blir synliga efter 3-4 veckor, eftersom de metabolisera och därmed ändra färgen på odlingsmediet och bildar kolonier.
OBS: För pälsfins odling, resuspendera klonerna väl och överföra dem till separata 96-brunnars plattor. Analysera cellerna via FACS såsom indikeras i 2.1.1-2.1.3. Kloner hålls under dessa förhållanden kan så småningom ändra sin TCR från Vδ1 till αβTCR. Tidpunkten för denna transdifferentiering varierar från klon till klon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar de olika etapperna och resultaten av isolering av Vδ1 T-celler från perifert blod. Figur 1A visar en typisk fördelning av Vδ1 + celler i CD3 + lymfocyter, såväl som den co-receptor expression av Vδ1 + -populationen. I denna givare, är frekvensen hos Vδ1 + celler (röd) 2,3% av de totala antalet lymfocyter och CD4-uttrycket (grön) av Vδ1 + -lymfocyter är 2,6%. Sammantaget, målgruppen för isolering utgör 0,06% av det totala antalet lymfocyter i denna givare. Figur 1B visar en optimal färgningsintensitet för Vδ1 + celler innan man magnetisk märkning. Färgning med den primära antikroppen bör resultera i klart åtskilda Vδ1 negativa och Vδ1 positiva befolkningar, så att Vδ1 + celler effektivt kan märkas och separeras med magnETIC pärlor. Figur 1C skildrar Vδ1 + -celler efter det att isoleringsförfarandet genom FACS-analys. Renheten hos Vδ1 + är vanligtvis> 99% av CD3 + celler. För att öka renheten, är isolerade celler applicerades på en andra isoleringskolonn. Detta resulterar i betydande cellförlust men detta steg leder till kvantitativ eliminering av potentiellt förorenande TCRαβ + CD4 + celler.
Resultaten av CD4 * isolering visas i figur 2. På grund av det låga antalet CD4 ^ Vδ1 + -celler, och eftersom cellerna expanderas i en begränsad utspädning encelliga kloning tillvägagångssätt renhet av CD4 + -celler mindre än 100% kan tolereras. I det experiment som visas här, renheten hos de Vδ1 + CD4 + celler var cirka 90% (Figur 2A, höger blöt) och efterföljande enkelcellkloning gav mer än 60 Vδ1+ CD4 + -T-cellkloner. I motsats, i Vδ1 + CD4 - fraktion nr CD4 + celler förblev (figur 2B), som belyser effektiviteten i denna isolering strategi. Notera CD4 + celler (blå) uttrycker Vδ1 på en urskiljbar lägre nivå än CD4 - celler (röd) (Figur 2A, båda blottar). Sålunda måste färgning av Vδ1 + -celler vara alltför stora såsom beskrivs i protokollet-under tillräcklig märkning och framgångsrik isolering av CD4 + -fraktionen i cellen poolen Vδ1 + T.
I figur 3A är den typiska fenotypen av en framväxande klon presenteras. TCR är sammansatt av en Vδ1 och en Vγ9 kedja och de klonala celler uttrycker CD3 och CD4. Figur 3B visar processen att transdifferentiering av en klon isolerad med den presenterade tekniken. Transdifferentiering innefattar downregulatipå av V'1-kedjan till en låg uttrycksnivå, som är parallellt med de novo-expression av en αβTCR. Detta leder till en övergående TCR-dubbelpositiva fenotypen som så småningom ger upphov till enkel-positiva αβTCR-uttryckande T-celler. Det co-receptor expression kan också ändras under loppet av transdifferentiering. I likhet med tymocyter, kan en CD4 + CD8 + DP fenotyp uppstå, som så småningom utvecklas till antingen SP CD4 + eller CD8 + αβ T-celler. Under de betingelser som kultur som presenteras här, är transdifferentiering endast händelse en sällsynt en av 50 kloner ändrat sin Vδ1 + TCR i αβTCR.
Figur 1. FACS-analyser övervaka alla stadier av isoleringsprocessen av V δ1 T-celler från perifert blod. (A </ strong>) Fördelning av Vδ1 + celler (röd) i CD3 + celler av perifert blod lymfocyter och deras co-receptor expression. CD4 + Vδ1 + celler indikeras i blått (cirkel). (B) Färgning av Vδ1 fraktionen innan du fortsätter till magnetisk märkning. (C) FACS-analys av Vδ1 + celler av positiva fraktionen efter isolering. Siffrorna anger andelen gated celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. FACS-analyser av V δ en CD4 ^ isolat (A) CD4 * fraktion och (B) CD4 -. Fraktionefter CD4 + cellisolering. Siffrorna anger andelen gated celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Fenotypisk analys av en klon direkt efter upptäckt. (A) TCR sammansättning och co-receptor expression av en nyligen isolerad klon. Vδ1 och Vγ9 TCR samuttryckas med CD3 och CD4. (B) Processen för transdifferentiering i en CD4 + Vδ1 + klon. Ändring av TCR uttryck (överst), och byte av co-receptor expression (botten) 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att studera fenotypen, biologi och funktion av en knapp (T-) cell enhet, nämligen Vδ1 + CD4 + T-celler, använde vi två markörer: Vδ1 och CD4 för dess positiva magnetisk cellisolering. Vδ1 är en föräldralös receptor, medan CD4 uttrycks på T-hjälparceller, på en lägre nivå på monocyter och dendritiska celler, och till en mycket låg nivå på hematopoietiska progenitorceller.
Tekniker för anrikning och val av celler i hög renhet inkluderar fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), en teknik som separerar en population av celler i underpopulationer baserade på fluorescensmärkning. Celler färgade med användning av fluoroforen-konjugerade antikroppar kan separeras från en annan beroende på vilken fluorofor (er) de har bundits. Sorterare kan uppnå renhet nära 98% 19, vilket är användbart om den enda nödvändighet sorterings själv. Nackdelar med denna teknik inkluderar det sorterade celler visar en minskning i cell VIförmåga, och i vår målgrupp också en minskad risk för transdifferention. En minskad cellviabilitet efter sortering är en hypotes bero på de skjuvkrafter och hydrodynamisk stress som FACS ålägger celler. Dessutom, för att hålla celler livskraftig och utan föroreningar för efterföljande kultur, bör försöket göras i aseptiska sterila förhållanden som är svårt att hantera. Dessutom rekommenderar FACS-sortering stort antal celler för att sortera.
Isolering Kit har utvecklats från flera företag för direkt magnetisk märkning och sortering av celler enligt flera ytmarkörer. Deras strategi bygger på att avlägsna den magnetiska etiketten från cellerna efter det första slaget med hjälp av ett släpp reagens, som antingen enzymatiskt eller konkurrens bort den magnetiska etiketten från strukturen som den var bunden. Detta medger en andra magnetisk märkning och separation av celler för en annan ytmarkör av intresse that uppnås genom att använda antingen direkt eller indirekt märkning med magnetiska kulor. Borttagning av etiketten rekommenderar arbetar vid låga temperaturer (på is, vid 2-8 ° C) under längre tidsperioder, exponering för en kemisk och upprepade tvättsteg. Behövs om målcellema i den andra parametern separationen är närvarande i en låg koncentration efter val (<10% målceller i positiva fraktionen efter den första separationen) även en andra omgång för att avlägsna ofany återstående magnetiskt märkta celler. Detta förfarande är-förutom att ha en betydande förlust av målceller på grund av upprepade tvättsteg-med hög risk för att inducera cellskador och funktionsförlust på grund av mekaniska och fysiologiska faktorer. Jämfört med FACS sortering dock cellpreparat förblir sterila och mindre cellantal kan sorteras.
Den strategi som vi eftersträva kombinerar två efter varandra utförda positiva val, men avlägsnandet av den första etiketten krävs inte som magnetic etiketter skiljer sig åt i den omfattning av deras magnetiska krafter av flera logg faser. Medan den första anti-fluorokrom magnetiskt märkt pärla typ är små, med en diameter på 50 nm, den andra anti-fluorokrom magnetiskt märkt pärla Åtgärder av typen 1 till 4,5 pm, vilket överstiger volymen / styrkan i första magnetiska etiketten 20 90-faldig. Dessutom utelämnar andra positiva sorteringscellstress, som är associerad med magnetisk kolonn behålla / release som celler kvar i en 1,5 ml flaska som sätts i en magnetisk anordning så att märkta celler är fästa på väggen i flaskan. Tvättprocedurer kan hållas i liten skala. Detta utarbetade protokoll minskar cellförlust och ökar cellviabiliteten eftersom cellerna upplever mindre manipulation och passera isoleringsprocessen snabbare än protokoll använder Multi isolering kit system.
Detta gör det möjligt protokoll för att separera även ett litet antal celler och en annan fördel: sorterade celler förblir sterile under hela förfarandet. Efterföljande klonings experiment med begränsande utspädning möjliggör effektiv utbyggnad av enskilda medlemmar i de isolerade celler, här mycket knappa Vδ1 + CD4 + γδ T-cell enhet 18. Sorterade celler uppvisar utmärkt livskraft och klonogenicitet och förblir fullt fungerande.
För framtida tillämpningar, använda denna strategi för att kvantitativt välja och framgångsrikt rena små T-cell enheter från olika humana källor, inklusive nytaget perifert blod, (mobiliseras) leukaferes produkter, navelsträngsblod och benmärg genom att kombinera två efter varandra utförda positiva val med hjälp av magnetiska etiketter som skiljer sig genom storlek i deras magnetiska krafter och därmed retentionskapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F.
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
