Abstract
Brissel, primære organ til generering af ap T-celler og rygraden i det adaptive immunsystem hos hvirveldyr, har længe været betragtet som den eneste kilde til αβT celler. Alligevel thymusinvolution begynder tidligt i livet fører til en drastisk reduceret produktion af naive αβT celler i periferien. Ikke desto mindre kan endda centenarians opbygge immunitet mod nyerhvervede patogener. Nyere forskning tyder extrathymic udvikling αβT celle, men vores forståelse af veje, der kan kompensere for thymisk tab af funktion er stadig rudimental. γδ T-celler er medfødte lymfocytter, som udgør den vigtigste T-celle delmængde i vævene. Vi har for nylig tilskrives en hidtil unappreciated enestående funktion til en γδ T-celle delmængde ved at vise, at den knappe enhed af CD4 + Vδ1 + γδ T-celler kan transdifferentiate ind αβT celler i inflammatoriske tilstande. Her har vi srovide protokollen til isolering af denne stamfader fra perifert blod og efterfølgende dyrkning. Vδ1 celler er positivt beriget fra PBMCer fra sunde humane donorer under anvendelse af magnetiske perler, efterfulgt af et andet trin, hvor vi målrette knappe fraktion af CD4 + -celler med et yderligere magnetisk mærkning teknik. Den magnetiske kraft af den anden mærkning overstiger en af de første magnetiske etiket og tillader således effektiv, kvantitative og specifik positiv isolation af populationen af interesse. Vi derefter indføre teknikken og dyrkningsbetingelser nødvendige for kloning og effektivt udvide cellerne og til identifikation af de genererede kloner ved FACS-analyse. Således giver vi en detaljeret protokol til rensning, kultur og ex vivo ekspansion af CD4 + Vδ1 + γδ T-celler. Denne viden er forudsætningen for undersøgelser, der relaterer sig til denne αβT celle progenitor`s biologi og for dem, der har til formål at IDEntify de molekylære udløsere, der er involveret i sin transdifferentiering.
Introduction
I hvirveldyr, adaptiv immunitet, som er struktureret i cellulær og en humoral del af immunitet spiller en vigtig rolle i forsvaret mod patogener. Anerkendelse af en lang række antigener medieres af hyperpolymorphic T- og B-celle receptorer (TCR / BCR), som med hensyn til T-celler antages primært at blive produceret i thymus 1. Dertil, hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), der stammer fra knoglemarv, frø thymus og differentiere langs veldefinerede faser endelig giver anledning til alle T-celle slægter. Thymus seeding progenitorer er CD4 - og CD8 - og dermed udgøre umodne, dobbelt negative (DN) thymocyt fraktion. Thymus-afledte signaler derefter fremkalde deres slægt engagement og differentiering til enten ap eller γδ T-celler. Ekspressionen af funktionelt omlejrede TCR-y og TCR-A kædegener i DN2 / 3 thymocytter fører til y δTCR komplekser, der øger cellulær proliferation end fremme differentiering til γ AT celler 2,3. I modsætning hertil omlejring af et funktionelt TCR-β-kæde, der kan parre med preTα at opbygge en preTCR pT, inducerer den transkriptionelle inaktivering af TCR-γ-kæde i DN3 thymocytter og deres overgang til CD4 + CD8 + dobbelt-positive thymocyter 4 . På dette stadium rekombination af TCR-α-kæden forekommer, sletning af TCR-δ locus som putter i TCR-α locus, således ophæver produktionen en γδTCR i disse celler uigenkaldeligt 5-9. Omarrangerede αβTCRs efterfølgende udvalgt for deres evne til at binde selv-MHC svagt (positiv selektion), som ikke må overstige en vis tærskel for at undgå autoimmunitet (negativ selektion). Ifølge deres evne til at binde MHC klasse I eller II, af det valgte αβT celler i single-positive CD4 + eller CD8 + -T-celler, som exit thymus så naive T-celler.
Imidlertid involution af thymus starter tidligt i livet fører til eksponentielt faldende produktion af naive T-celler, der er næsten slukket efter puberteten 10. Ikke desto mindre, størrelsen af T-celle pool forbliver konstant gennem hele livet, hvilket kan forklares kun delvis med post-thymus homeostatiske proliferation af T-celler og spredning af langlivede immunologisk hukommelse 11. Følgelig må extrathymic T-celleudvikling forekomme. Nyere forskning har fået betydelig attraktion, der prægede αβT-stamceller, som-at extrathymic steder-gav anledning til funktionel ap T-celler 12-17. Alligevel detaljeret viden om extrathymic αβT celleforstadier at uafhængig fra en thymus differentiere ind αβT celler er så fragmentarisk som baggrund, at vi har på ruten de tager derved.
Vi har for nylig identificeret den lille T-celle enhed i Vδ1 + + γδT celler som en extrathymic αβT celle prognitor 18, som når det isoleres fra perifert blod fra raske humane donorer kan transdifferentiate ind αβT celler i en mild inflammatorisk miljø. Interessant og i modsætning til den homeostatiske spredning af post-thymiske T-celler, transdifferentiering af Vδ1 CD4 + celler genererer nye T-celle-receptorer, og dermed udvide repertoiret mangfoldighed, således at potentielt nye antigener kan anerkendes og kan beskyttelse værten mod nyerhvervede patogener. Det bidrager til plasticitet af T-celler og tilføjer et hidtil unappreciated ny vej for extrathymic T-celle udvikling.
Den kvantitative isolation fra lymfocytiske kilder, generering af single-celle-kloner og deres effektive ekspansion er afgørende for målsætningen om at identificere de markører og molekyler, der udløser denne αβT celle precursor`s extrathymic udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og blev godkendt af den kliniske etiske komité ved universitetet i Tübingen (projekter 38 / 2009B02 og 470 / 2013B02).
1. Isolering af perifere mononukleære blodceller (PBMC'er)
- Tag 50-100 ml fra en rask frivillig via venepunktur under anvendelse af en 50 ml sprøjte indeholdende 1.000 IE heparin sulfat og blodet fortyndes 1: 2 med PBS (pH = 7,2).
- Forsigtigt lag 35 ml blod: PBS-opløsning på 15 ml blod adskille opløsning såsom Biocoll (d = 1,077 g / ml) i en 50 ml konisk rør. Centrifuger i 15 minutter ved 800 xg ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Bremse må ikke anvendes. - Indsamle cellerne i lymfatisk lag med en pipette og vaskes cellerne to gange i mindst 50 ml PBS (centrifuge i 12 min; ved 400 xg). Fjern supernatanten efter centrifugering med en pipette.
- Lyse resterende erythrocytter ved at suspendere og incubating af lymfatisk fraktion med 1-5 ml af en hypotonisk bufferopløsning i 2-4 min.
BEMÆRK: Varighed af eksponering og omfanget af lyseringsbuffer afhænger af den anvendte lyseringsbuffer og på mængden af røde blodlegemer tilbage i lymfocytfraktionen. - Fortynd cellerne med PBS (1:10) og centrifugeres ved 250 xg i 12 min og derefter resuspenderes og vaskes cellepelleten gang i 10 ml PBS ved 300 x g i 12 min.
- Resuspender lymfocytterne i PBS og tælle cellerne i et Neubauer-tællekammer under anvendelse af Trypan blå opløsning.
BEMÆRK: Normalt er> 1 x 10 8 lymfocytter modtaget fra 100 ml frisk udtaget perifert blod.
2. Isolering af T-celler Vδ1
- Tag <1 x 10 6 isolerede lymfocytter til en indledende FACS bestemmer frekvensen af Vδ1 CD4 T-celler.
BEMÆRK: Befolkning størrelsen af denne T-celle enhed kan variere meget mellem individer og i henhold til deres immunologiske tilstand. Typicallierede, omkring 1% af T-celler er Vδ1 + og ca. 1-5% af Vδ1 + celler er CD4 +.- Fortynd cellerne med 1 ml FACS-puffer, der består af PBS indeholdende 2% FCS og 5 mM EDTA. Centrifuger ved 660 x g i 2 minutter og dekanter supernatanten. Tilbagesvalingstemperaturen volumen på ca. 100 pi FACS buffer er tilstrækkelig til efterfølgende farvning. Kort fortalt vortexes og inkuberes cellerne med 5 pi Fc-blokerende reagens i 5 minutter ved stuetemperatur for øget specificitet af FACS-farvning.
- Tilføj humane monoklonale antistoffer direkte til cellerne uden at fjerne Fc-blokerende reagens. Sørg for at plette cellerne med antistoffer mod Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) og TCRαβ (01:25). Forbered isotypekontrol med de tilsvarende immunoglobulinisotyper. Cellerne inkuberes med antistoffer i 20 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vask cellerne i 1 ml FACS-buffer (centrifuge i 2 min, ved 660 xg), dekanteres supernatant og fortsæt til FACS opkøb i de resterende buffer volumen.
- Pelletering cellerne (som ikke bruges i FACS-analyse) ved centrifugering i 12 min; ved 300 g; 8 ° C. Fjern supernatanten og resuspender cellen pelletin 60 pi MACS-buffer pr 1 x 10 7 celler. Tilsæt 20 pi Fc-blokerende reagens pr 1 x 10 7 celler og inkuberes i 5 minutter ved 4 ° C.
- Tilsæt 10 pi FITC konjugeret anti-humant antistof Vδ1 pr 1 x 10 7 celler direkte til cellerne. Inkuber i 12 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vask cellerne under anvendelse af 14 ml MACS-buffer (centrifuge i 12 min; ved 300 g; 8 ° C). Supernatanten kasseres helt og resuspender cellerne i 80 pi MACS buffer pr 1x10 7 celler.
- Tag 1-2 x 10 5 celler og fortyndes dem i 100 pi FACS-buffer til verifikation af mærkningen ved FACS-analyse. Er behov for yderligere tilsætningsstoffer til dette trin. Sørg for, at der er en tilstrækkelig forskel i lysstyrken for Vδ1 - og Vδ1 + celler. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du gentage trin 2.3) og 2.4).
- Tilsæt 20 gl anti-FITC mikroperler pr 1 x 10 7 celler til de resterende celler, bland godt og inkuberes i 15 minutter i mørke ved 4 ° C. Derefter vaskes cellerne under anvendelse af mindst 10 ml MACS buffer (centrifuge i 12 min, ved 300 xg, 8 ° C).
- Under centrifugeringen, ækvilibrere forkølede magnetisk søjle placeres i en magnet med MACS 500 pi buffer.
- Resuspender cellerne i 500 pi MACS-buffer (for celleantal højere end 1 x 10 8, opskalere denne mængde i overensstemmelse hermed) og anvende cellerne forsigtigt på søjlen. Opsaml gennemløbet indeholdende Vδ1 - celler.
- Vask kolonnen tre gange med 500 pi MACS-buffer og indsamle gennemløbet igen i det samme rør. Bemærk, at reservoiret skal være tom før påføring buffer på søjlen.
- Fjern kolonne fra den magnetiske indretning og placere den i et 15 ml konisk rør. Skylle hurtigt kolonnen med 1 ml MACS buffer ved fast at trykke stemplet ind i søjlen. Eluatet opsamles i et rør.
BEMÆRK: For at opnå en renhed på> 98%, er det sædvanligvis nødvendigt at gentage trin 2,7-2,9) med en anden kolonne. - Verificer renheden af cellerne ved FACS-analyse 18 med det samme antistof panel som før (se 2.1.2) og tælle cellerne.
3. Isolering af Vδ1CD4 + T-celler
- Resuspender 25 pi CD4 perler med en vortex for> 30 sek. Vask perlerne (den minimale mængde som afbildet af fabrikanten) i 1 ml MACS buffer i et 1,5 ml reaktionsrør ved at placere røret i en magnet for 1 min. Kassér supernatanten forsigtigt med en lille skala pipette (200 ul) og resuspender perlerne i det oprindelige volumen af MACS-buffer.
- Pelletering Vδ1 + -celler (centrifuge i 12 min; ved 300 xg), og aspirere supernatanten og resuspender alle Vδ1 + celler i 500 pi MACS-buffer og tilføje dem til rør indeholdende perlerne. Bland kraftigt og inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C med konstant hældning (fx i en rotator).
- Placer røret indeholdende cellerne i en magnet i 2 minutter. Sørg for at der ikke er rester i låget.
BEMÆRK: CD4 + -celler vil have bundet de magnetiske perler og vedhæfte til siden af røret mod magneten. - Åbn forsigtigt låget samtidig holde slangen ind i magnetiske indretning og indsamle supernatanten, der indeholder CD4 - Vδ1 + -celler ved hjælp af en lille målestok pipette. Placer CD4 - Vδ1 + celler i et separat rør og placere dette rør ind magneten igen for at undgå eventuelt resterende CD4-celler eller perler fra populationen.
- Vask CD4 - celler i 5 ml MACS-buffer (centrifuge i 12 min; ved 300 xg) and resuspendere dem i en koncentration på 1 x 10 5 celler pr 100 pi medier. CD4 - celler kan let dyrkes under nedenstående betingelser (4.2).
- Glasset anbringes med CD4 + celle mål uden for det magnetiske felt, opblande cellerne i 500 pi MACS-buffer og sætte dem tilbage i den magnetiske indretning. Gentag trin 3,3-3,5 to gange for at opnå en højere renhed. Fjern supernatanten ved pipettering
- Resuspender CD4 + celler i 100 pi dyrkningsmedier (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin), og der tilsættes 10 pi af en perle-afmontering opløsning. Inkuber ved stuetemperatur i 45 minutter under konstant hældning (fx i en rotator).
- Placer cellerne i en magnet for 1 min. Indsamle forsigtigt supernatanten indeholdende perle-fri Vδ1 + CD4 + -celler ved hjælp af en lille målestok pipette.
- Uden for magnet, resuspender perlerne med 100 pi dyrkningsmedier og gentagtrin 3.6 og 3.7 to gange for at opnå højere celleantal af CD4 + -celler.
- Pelletering cellerne (centrifugeres ved 300 xg i 12 minutter), og kassér supernatanten fuldstændigt ved pipettering. Resuspendér celler i friske, forvarmet medier og tælle dem. Undersøg renheden af Vδ1 + CD4 + -celler ved FACS-analyse afbildet i trin 2.1.1-2.1.3.
4. Single-celle Kloning af Limited Fortynding
- Isoler perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) fra en allogen donor som afbildet i 1,1-1,6.
- Bestråle 2,5 x 10 7 allogene PBMC'er med 80 Gy i 25 ml dyrkningsmedier under anvendelse af γ-stråling.
- Tilføj IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) og PHA (2 ug / ml) til de bestrålede fødeceller og distribuere dem i 96-brønds U-form plader, 5 x 10 4 feeder celler i 50 pi per brønd.
- Fortynd Vδ1 + CD4 + cellerne til en koncentration på 0,3 celler pr 50 pi. Pipette 50 pi af cellen opløsning til hver brønd huser de bestrålede celler og cytokiner.
BEMÆRK: Således er cytokinerne fortyndet til en slutkoncentration på 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 og 1 ug / ml PHA. Inkubér 96-brønds plader i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 befugtet atmosfære.- Eventuelt dyrke resterende oprensede Vδ1 + CD4 + celler som bulk-kultur under samme dyrkningsbetingelser som de kloner.
- Levere cellerne hver 3-4 dage med cytokiner og friske medier. Til dette, udveksling halvdelen af mediet i brøndene med 50 pi frisk medium ved pipettering. Der tilsættes 2-fold koncentration af cytokiner til alle tilskud. Tilføj 5x10 4 bestrålede feeder celler per brønd hver anden runde af fodring.
- Ved hjælp af et mikroskop, observere første kloner bliver synlige efter 3-4 uger, da de metabolisere og dermed ændre farven på kolonierne kultur medium og form.
BEMÆRK: pelsTher dyrkning, resuspendere klonerne godt og overføre dem til at adskille plader med 96 brønde. Analyser cellerne via FACS som angivet i 2.1.1-2.1.3. Kloner holdes under disse betingelser i sidste ende kan ændre deres TCR fra Vδ1 til αβTCR. Tidspunktet for denne transdifferentiering varierer fra klon til klon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser de forskellige trin og resultatet af isoleringen af Vδ1 T-celler fra perifert blod. Figur 1A viser en typisk fordeling af Vδ1 + -celler i CD3 + lymfocytter, samt co-receptor ekspression af Vδ1 + populationen. I denne donor frekvensen af Vδ1 + celler (rød) er 2,3% af de samlede lymfocytter og CD4-ekspression (grøn) i Vδ1 + lymfocytter er 2,6%. Tilsammen repræsenterer målgruppen til isolering 0,06% af de samlede lymfocytter i denne donor. Figur 1B viser en optimal farvning for Vδ1 + celler intensitet før man går videre til den magnetiske mærkning. Farvning med det primære antistof bør resultere i klart adskilte Vδ1 negative og positive Vδ1 populationer således at Vδ1 + -celler kan effektivt mærkes og adskilt med magnETIC perler. Figur 1C viser Vδ1 + celler efter isolering proceduren ved FACS-analyse. Renheden af Vδ1 + er normalt> 99% af CD3 + celler. For at øge renheden er isolerede celler anvendes på en anden adskillelse kolonne. Dette resulterer i betydelige tab celle men dette trin fører til kvantitativ eliminering af potentielt forurenende TCRαβ + CD4 + celler.
Resultaterne af CD4 + isolation er vist i figur 2. På grund af det lave antal af CD4 + Vδ1 + -celler, og da cellerne ekspanderes i et begrænset fortynding encellede kloning tilgang renhed af CD4 + celler mindre end 100% kan tolereres. I eksperimentet vist her, renheden af Vδ1 + CD4 + -celler var ca. 90% (figur 2A, højre blot) og encellede kloning efterfølgende resulterede i mere end 60 Vδ1+ CD4 + T-cellekloner. Modsat, i Vδ1 + CD4 - fraktionen ingen CD4 + celler forblev (figur 2B), som fremhæver effektiviteten af denne isolation strategi. Af note, CD4 + celler (blå) udtrykker Vδ1 ved en skelnelig lavere niveau end CD4 - celler (rød) (figur 2A, begge blots). Således må farvning af Vδ1 + -celler være uforholdsmæssigt store som beskrevet i protokollen-en tilstrækkelig mærkning og vellykket isolering af CD4 + fraktionen i Vδ1 + T-celle pool.
I figur 3A, er den typiske fænotype af en ny klon fremlagt. TCR er sammensat af en Vδ1 og en Vγ9 kæde og den klonale celler udtrykker CD3 og CD4. Figur 3B afbilder processen med transdifferentiering af en klon isoleret med den præsenterede teknik. Transdifferentiering omfatter downregulatipå af V'1-kæden til et lavt ekspressionsniveau, som er parallelt med de novo ekspression af et αβTCR. Dette fører til en transient TCR-double-positive fænotype som i sidste ende giver anledning til single-positive αβTCR-udtrykkende T-celler. Co-receptor-ekspression kan også ændre sig i løbet af transdifferentiering. Svarende til thymocytter kan en CD4 + CD8 + DP fænotype forekommer, som i sidste ende udvikler sig til enten SP CD4 + eller CD8 + T-celler αβ. Under de dyrkningsbetingelser præsenteres her, transdifferentiering er en kun-begivenhed én ud af 50 kloner sjældne ændret deres Vδ1 + TCR ind αβTCR.
Figur 1. FACS analyser overvågning af alle stadier af isolering processen med V δ1 T-celler fra perifert blod. (A </ strong>) Fordeling af Vδ1 + celler (rød) i CD3 + celler i perifert blod lymfocytter og deres co-receptor-ekspression. CD4 + Vδ1 + -celler er vist i blåt (cirkel). (B) Farvning af Vδ1 fraktionen før du fortsætter til magnetisk mærkning. (C) FACS-analyse af Vδ1 + celler fra positive fraktion efter isolering. Tal angiver procentdelen af gated celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. FACS analyser af V δ 1 CD4 + isolater (A) CD4 + fraktion og (B) CD4 -. Fraktionefter CD4 + celle isolation. Tal angiver procentdelen af gated celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fænotypisk analyse af en klon lige efter detektion. (A) TCR sammensætning og coreceptor ekspression af et frisk isoleret klon. Vδ1 og Vγ9 TCR er co-udtrykkes med CD3 og CD4. (B) Processen med transdifferentiering i en CD4 + Vδ1 + klon. Ændring af TCR-ekspression (øverst), og skift af co-receptor-ekspression (nederst) 18. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at undersøge fænotypen, biologi og funktion af en knap (T) celle enhed, nemlig Vδ1 + CD4 + T-celler anvendte vi to markører: Vδ1 og CD4 for dets positive magnetiske celleisolering. Vδ1 er en orphan-receptor, mens CD4 udtrykkes på T-hjælperceller, på et lavere niveau på monocytter og dendritiske celler, og på et meget lavt niveau på hæmatopoietiske progenitorceller.
Teknikker til berigelse og selektion af celler med høj renhed omfatter fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), en teknik, der adskiller en population af celler i sub-populationer baseret på fluorescerende mærkning. Celler farvet ved anvendelse af fluorofor-konjugerede antistoffer kan adskilles fra hinanden afhængigt af hvilken fluorofor (er) de har bundet. Sorteringsanlæg kan opnå renhed tæt på 98% 19, hvilket er nyttigt hvis den eneste nødvendighed sorteringsanlægget selv. Ulemperne ved denne teknik omfatter, at sorterede celler viser et fald i celle VIevne, og i vores målgruppe også en reduceret potentiale for transdifferention. En reduceret celle levedygtigheden efter sortering antages at skyldes de forskydningskræfter og hydrodynamiske understrege, at FACS pålægger celler. Desuden, for at holde cellerne levedygtige, og uden forurening til efterfølgende kultur, bør forsøget foretages under aseptiske sterile betingelser, som er svært at håndtere. Desuden FACS-sortering anbefaler et stort antal celler til sortering.
Isolation Kits er udviklet fra flere virksomheder til direkte magnetisk mærkning og sortering af celler i henhold til flere overflademarkører. Deres strategi bygger på fjernelse af den magnetiske etiket fra cellerne efter den første sortering ved hjælp af en frigivelse reagens, som enten enzymatisk eller kompetitivt fjerner magnetiske etiket fra strukturen, som den var bundet. Dette giver et andet magnetisk mærkning og separation af cellerne for en anden overflade markering af interesse that opnås ved anvendelse af enten direkte eller indirekte mærkning med magnetiske perler. Fjernelse af etiketten anbefaler arbejder ved lave temperaturer (på is, ved 2-8 ° C) i længere perioder, eksponering for et kemisk og gentagne vasketrin. Hvis målcellerne af den anden parameter separation er til stede i en lav koncentration efter selektion (<10% målceller i den positive fraktion efter den første separation) endnu en anden runde til fjernelse ofany resterende magnetisk mærkede celler er nødvendig. Denne procedure er-ud over at have et betydeligt tab af målceller på grund af gentagne vasketrin-med høj risiko for at inducere cellulær skade og tab af funktion på grund af mekaniske og fysiologiske stressfaktorer. Sammenlignet med FACS-sortering men cellepræparater forbliver sterilt og mindre celletal kan sorteres.
Den strategi, som vi forfølger kombinerer to fortløbende henrettet positive markeringer, men fjernelse af den første etiket er ikke påkrævet, da magnetisk etiketter forskellige i størrelsen af deres magnetiske kræfter med flere log faser. Mens den første anti-fluorochrom magnetisk mærkede perletype er lille, med en diameter på 50 nm, det andet anti-fluorochrom magnetisk mærkede perletype foranstaltninger 1 til 4,5 um, hvilket overstiger mængden / styrken af det første magnetiske etiket 20 til 90-fold. Derudover andet positive slags udelader celle stress, er det forbundet med magnetisk søjleretentionstid / frigivelse som celler forbliver i en 1,5 ml hætteglas, der er sat i en magnetisk indretning, således at mærkede celler fastgjort til væggen af hætteglasset. Vaskeprocedurer kan holdes på en lille skala. Det udarbejdede protokol reducerer celletab og øger cellernes levedygtighed, da celler oplever mindre manipulation og videregive isolation processen hurtigere end protokoller hjælp multisort isolation kit-systemer.
Følgelig denne protokol gør det muligt at adskille selv en lille antal celler og en anden fordel: sorterede celler forbliver sterile hele proceduren. Efterfølgende kloning eksperimenter ved hjælp begrænsende fortynding tillader effektiv udbygning af de enkelte medlemmer af de isolerede celler, her den meget sparsomme Vδ1 + CD4 + γδ T-celle enhed 18. Sorteret celler viser fremragende levedygtighed og clonogenicity og forbliver fuldt funktionsdygtig.
For fremtidige applikationer, bruge denne strategi til kvantitativ vælge og held rense små T-celle enheder fra menneskets forskellige kilder, herunder frisktappet perifert blod, (mobiliserede) leukapherese produkter, navlestrengsblod og knoglemarv ved at kombinere to fortløbende udførte positive valg ved hjælp af magnetiske etiketter, der adskiller sig af størrelsesorden i deres magnetiske kræfter og dermed fastholdelse kapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F. Lymphocyte life-span and memory. Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
