Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Mange undersøgelser søge at identificere og kortlægge områder af hjernen, der er involveret i specifikke fysiologiske regler. Proto-onkogen c-fos, en umiddelbart tidlig gen, udtrykkes i neuroner som reaktion på forskellige stimuli. Proteinproduktet kan let detekteres med immunhistokemiske teknikker fører til anvendelsen af c-fos detektion til kort grupper af neuroner, der viser ændringer i deres aktivitet. I denne artikel, vi fokuseret på identifikation af hjernestamme neuronal befolkninger er involveret i ventilatorisk tilpasning til hypoxi eller hyperkapni. To tilgange blev beskrevet at identificere involverede neuronale populationer in vivo i dyr og ex vivo i deafferented hjernestamme præparater. In vivo blev dyr udsat for Hyperkapni eller hypoxiske gasblandinger. Ex vivo blev deafferented præparater overhældt med hypoxiske eller Hyperkapni kunstig cerebrospinalvæske. I begge tilfælde, enten kontrol in vivo dyr eller ex vivo præparater blev holdt under normoxiske og normocapnic betingelser. Sammenligningen af disse to tilgange muliggør bestemmelse af oprindelsen af den neuronale aktivering dvs, perifer og / eller central. In vivo og ex vivo blev brainstems indsamlet, fast, og skåret i sektioner. Når sektioner blev fremstillet, blev immunhistokemisk detektion af c-fos-proteinet foretaget for at identificere hjernestammen grupper af celler aktiveret af hypoxiske eller Hyperkapni stimuleringer. Mærkede celler blev talt i hjernestamme respiratoriske strukturer. I sammenligning med kontrolgruppen tilstand, hypoxi eller hyperkapni øget antallet af c-FOS mærkede celler i flere specifikke hjernestamme websteder, der er således konstituerende for de nervebaner, der er involveret i tilpasningen af den centrale respiratoriske drev.
Den c-fos-genet blev identificeret for første gang i begyndelsen af 1980 1,2 og dets produkt blev karakteriseret i 1984 som en nuklear protein, der har gen-aktivator egenskaber 3,4. Den deltager i langsigtede mekanismer forbundet med neuron stimulering. Faktisk ændringer i neuronal aktivitet føre til andre messenger signaleringskaskader, der inducerer ekspressionen af de umiddelbare tidlige gen c-fos, der inducerer produktionen af transkriptionsfaktoren c-fos. Sidstnævnte initierer ekspressionen af sene gener og dermed deltager i adaptive responser i nervesystemet til mange forskellige typer af stimuli 4. Således eftersom udgangen af 1980 5,6, c-fos-proteinet afsløring er ofte blevet anvendt til at undersøge virkningerne af eksogene faktorer på gentranskription generelt 4 og på aktiviteten af det centrale nervesystem (CNS) til kortlægning ud nervebaner involveret i forskellige fysiologiskeal forhold.
Basal c-fos udtryk er blevet undersøgt i forskellige arter, herunder mus, rotte, kat, abe og menneske 4. Derved kinetik sit udtryk forholdsvis velkendt. Transkriptionsaktiveringsdomæne er hurtig (5 til 20 min) 7,8, og mRNA akkumulering når et maksimum mellem 30 og 45 min efter indtræden af stimulering 9 og falder med en kort halveringstid på 12 min. C-FOS-proteinsyntese følger mRNA akkumulering og kunne påvises ved immunhistokemi på 20 til 90 minutter efter stimulering 6.
Analyse af c-fos-ekspression er klassisk anvendes i in vivo-undersøgelser for at identificere den centrale respiratorisk netværk involveret i ventilatoriske reaktioner på hypoksi eller hyperkapni 10-14. For nylig blev dette værktøj også brugt i ex vivo hjernestamme forberedelser til at udforske centrale respiratoriske netværk tilpasninger til hypoxi eller hypercapnia 15-18. Faktisk er disse præparater generere en rytmisk aktivitet klassisk sidestilles med den centrale respiratoriske drev 19. Denne type præparat har således den fordel, at helt deafferented, og derfor resultater med hensyn c-fos udtryk kun afspejle konsekvenserne af en central stimulation uden indgriben af perifere strukturer.
C-FOS detektering kan foretages ved immunohistokemiske eller immunohistofluorescence tilgange. Indirekte immunpåvisning nødvendiggør anvendelsen af et primært antistof mod c-fos og et sekundært antistof rettet mod arter, hos hvilke det primære antistof blev produceret. For den immunhistokemiske metode er det sekundære antistof konjugeret med et enzym (peroxidase, for eksempel), der virker på et substrat (H 2 O 2 til peroxidase). Produktet fra den enzymatiske reaktion er udviklet af et chromogen (3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloride), der farver det og kan iagttages under lysmikroskopi. Reaktionen kan styrkes ved hjælp af nikkel ammoniumsulfat. Disse metoder muliggør påvisning af Actives neuroner under forskellige fysiologiske udfordringer, og derfor identifikation og / eller kortlægning af perifere og centrale involverede veje i de efterfølgende fysiologiske reaktioner.
C-fos er et umiddelbart tidligt gen, og påvisningen af det produkt, c-FOS-protein, er klassisk anvendes til at identificere neuronale populationer involveret i specifikke respiratoriske responser in vivo 11,13,25,28 og ex vivo 16-18, 27,32,33.
Kritiske skridt i protokollen
Vær forsigtig under perfusion trin. De 4% PFA løsning skal være godt forberedt og fiksering og post-fikse…
The authors have nothing to disclose.
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
(Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
Triton X100 | Sigma | T8787 | |
Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
Trisma Base | Sigma | T1503 | |
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
H2O2 | Sigma | H1009 | |
Xylene | Sigma | 33817 | |
Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
BSA | Sigma | A2153 |