La protéine c-FOS détection immunohistologique: Un outil utile comme marqueur des voies centrales impliquées dans les réponses physiologiques spécifiques<em> In Vivo</em> et<em> Ex Vivo</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
De nombreuses études cherchent à identifier et cartographier les régions du cerveau impliquées dans les règlements physiologiques spécifiques. Les c-fos proto-oncogène, un gène précoce immédiat, est exprimé dans les neurones en réponse à divers stimuli. Le produit protéique peut être facilement détectée par des techniques d'immunohistochimie conduisant à l'utilisation de la détection c-FOS pour cartographier des groupes de neurones qui affichent des changements dans leur activité. Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur l'identification des populations du tronc cérébral neuronales impliquées dans l'adaptation ventilatoire à l'hypoxie ou hypercapnie. Deux approches ont été décrites pour identifier les populations neuronales impliquées in vivo chez l' animal et ex vivo dans les préparations du tronc cérébral déafférenté. In vivo, les animaux ont été exposés à des mélanges de gaz hypercapniques ou hypoxiques. Ex vivo, les préparations déafférenté ont été perfusées avec hypoxiques ou liquide céphalo – rachidien artificiel hypercapnique. Dans les deux cas, soit le contrôle des animaux in vivo ou ex vivo préparations ont été maintenues dans des conditions normoxiques et normocapnie. La comparaison de ces deux méthodes permettent la détermination de l'origine de l'activation neuronale ie, périphérique et / ou central. In vivo et ex vivo, tronc cérébral ont été prélevés, fixés et découpés en sections. Une fois que les sections ont été préparées, la détection immunohistochimique de la protéine c-FOS a été faite afin d'identifier les groupes de cellules activées tronc cérébral par des stimulations hypoxiques ou hypercapnie. Les cellules marquées ont été comptées dans les structures respiratoires du tronc cérébral. Par rapport à la condition de contrôle, l'hypoxie ou hypercapnie augmenté le nombre de cellules marquées c-fos dans plusieurs sites du tronc cérébral spécifiques qui sont donc constitutive des voies neuronales impliquées dans l'adaptation de l'entraînement respiratoire centrale.
Introduction
Le gène fos c- a été identifié pour la première fois au début de 1980 1,2 et son produit a été caractérisé en 1984 comme une protéine nucléaire ayant des propriétés gène activateur 3,4. Elle participe à des mécanismes à long terme associés à la stimulation des neurones. En effet, les variations de l' activité neuronale conduisent à des seconds messagers de signalisation en cascade qui induisent l'expression du gène précoce immédiat c-fos, ce qui induit la production du facteur de transcription c-fos. Ce dernier initie l'expression des gènes tardifs et participe ainsi à des réponses adaptatives du système nerveux à différents types de stimuli 4. Ainsi, depuis la fin de 1,980 5,6, la détection de la protéine c-fos a été fréquemment utilisé pour étudier les effets de facteurs exogènes sur la transcription des gènes en général 4 et sur l'activité du système nerveux central (SNC) pour cartographier les voies neuronales impliqués dans différents physiologiqueles conditions al.
Expression de c-fos Basal a été étudié dans diverses espèces , y compris les souris, le rat, le chat, le singe, et humain 4. De ce fait, la cinétique de l'expression est relativement bien connue. L'activation de la transcription est rapide (5 à 20 min) 7,8, et l'accumulation d'ARNm atteint un maximum entre 30 et 45 min après le début de la stimulation 9 et diminue avec une courte demi-vie de 12 min. La synthèse de la protéine c-fos suite à l' accumulation de l' ARNm et peut être détectée par immunohistochimie à la stimulation post 20-90 min 6.
Analyse de c-fos expression est classiquement utilisé dans des études in vivo pour identifier le réseau respiratoire central impliqué dans les réponses ventilatoire à l' hypoxie ou hypercapnie 10-14. Plus récemment, cet outil a également été utilisé dans des préparations ex vivo du tronc cérébral pour explorer centrales adaptations du réseau des voies respiratoires à l' hypoxie ou hypercapnia 15-18. En effet, ces préparations génèrent une activité rythmique classique assimilé à l'entraînement respiratoire centrale 19. Ainsi, ce type de préparation a l'avantage d'être complètement déafférenté et, par conséquent, les résultats concernant l' expression de c-fos ne reflètent que les conséquences d'une stimulation centrale sans aucune intervention des structures périphériques.
La détection c-FOS pourrait être faite par des approches immunohistochimiques ou immunohistofluorescence. immunodétection indirect nécessite l'utilisation d'un anticorps primaire contre le c-fos et un anticorps secondaire dirigé contre l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été produit. Pour la méthode immunohistochimique, l'anticorps secondaire est conjugué à une enzyme (peroxydase, par exemple) qui agit sur un substrat (H 2 O 2 pour la peroxydase). Le produit de la réaction enzymatique est développée par un chromogène (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride), qui colore et on peut l'observer en microscopie optique. La réaction pourrait être renforcé en utilisant du sulfate de nickel d'ammonium. Ces méthodes permettent la détection des neurones actif au cours des différentes difficultés physiologiques et donc l'identification et / ou la mise en correspondance des voies périphériques et centraux impliqués dans les réponses physiologiques consécutifs.
Protocol
Representative Results
Discussion
C-fos est un gène précoce immédiat, et la détection de son produit, la protéine c-fos, sont classiquement utilisés pour identifier les populations de neurones impliqués dans la réponse des voies respiratoires spécifiques in vivo et ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33.
Étapes critiques Dans le Protocole
Soyez prudent lors de l'étape de perfusion. La solution PFA 4% d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat’s neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
