Summary

C-FOS белка Обнаружение иммуногистохимического: Полезный инструмент в качестве маркера Центральной путей, участвующих в конкретных физиологических реакций<em> В Vivo</em> и<em> Ex Vivo</em

Published: April 25, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

Многие исследования пытаются определить и сопоставить участки мозга, связанные с конкретными физиологическими нормами. Протоонкоген с-ФОС, немедленно раннего гена, выражается в нейронах в ответ на различные стимулы. Белковый продукт можно легко обнаружить с иммуногистохимических методов, приводящих к использованию обнаружения C-FOS к карте группы нейронов, которые отображают изменения в их активности. В этой статье мы сосредоточились на выявлении популяций нейронов ствола головного мозга, участвующих в респираторной адаптации к гипоксии или гиперкапнии. Два подхода были описаны для идентификации вовлеченных популяции нейронов в естественных условиях у животных и ех в естественных условиях деафферентированной препаратов ствола головного мозга. В естественных условиях, животных подвергали гиперкапнических или гипоксических газовых смесей. Ex естественных условиях, деафферентированной препараты были орошали гипоксических или гиперкапнической искусственной спинномозговой жидкости. В обоих случаях, либо контроль в естественных условиях животных или ех естественных условиях препараты содержали в нормоксических и normocapnic условиях. Сравнение этих двух подходов позволяет определить происхождение нейронов , т.е. активации, периферической и / или центральной. В естественных условиях и бывших естественных условиях, brainstems были собраны, фиксированные, и нарезанные на отрезки. После того, как участки были подготовлены, иммуногистохимическое определение белка C-FOS было сделано для того, чтобы идентифицировать стволе мозга группы клеток, активированных гипоксических или гиперкапнических раздражений. Меченые клетки подсчитывали в стволовых дыхательных структур. По сравнению с контрольной группы, гипоксии или гиперкапнии увеличилось количество с-FOS меченых клеток в нескольких конкретных участков ствола головного мозга, которые, таким образом, конститутивный нейрональных путей, участвующих в процессе адаптации центрального дыхательного привода.

Introduction

C- ФОС ген был идентифицирован впервые в начале 1980 – 1,2 и его продукт был охарактеризован в 1984 году как ядерный белок , имеющий ген-активатор свойства 3,4. Она участвует в долгосрочных механизмов, связанных с нейрон стимуляции. Действительно, изменения в активности нейронов приводит к вторичным мессенджером сигнальных каскадов , которые индуцируют экспрессию непосредственных ранних генов с-FOS, который индуцирует выработку фактора транскрипции с-FOS. Последнее инициирует экспрессию поздних генов и , таким образом , участвует в адаптивных реакций нервной системы ко многим различным типам раздражителей 4. Таким образом, с конца 1980 г. 5,6, обнаружение белка с-ФОС был часто используется для изучения влияния экзогенных факторов на транскрипции генов в общем 4 и на деятельности центральной нервной системы (ЦНС) для картирования из нейронных путей участвует в различных физиологическихAl условия.

Базальный C-FOS выражение было изучено у различных видов , включая мышей, крыс, кошки, обезьяны и человека 4. Таким образом, кинетика его экспрессии относительно хорошо известны. Активация транскрипции происходит быстро ( от 5 до 20 мин) 7,8, а накопление мРНК достигает максимума от 30 до 45 мин после начала стимуляции 9 и уменьшается с коротким периодом полураспада 12 мин. Синтез белка с-ФОС следующим образом накопление мРНК и может быть обнаружен с помощью иммуногистохимии при 20 до 90 мин после стимуляции 6.

Анализ с-FOS выражение классически используется в исследованиях в естественных условиях для определения центральной дыхательной сети , участвующих в вентиляторной реакции на гипоксии или гиперкапнии 10-14. Совсем недавно, этот инструмент был также использован в естественных условиях ех препаратов для изучения стволовых центральных органов дыхания сети адаптации к гипоксии или чypercapnia 15-18. В самом деле, эти препараты генерировать ритмическую активность классически приравнено к центральной респираторной привода 19. Таким образом, этот тип препарата имеет преимущество , так как полностью деафферентированной, и , следовательно, результаты в отношении с-FOS выражение лишь отражают последствия центральной стимуляции без какого – либо вмешательства периферических структур.

Обнаружение с-ФОС могут быть сделаны иммуногистохимических или immunohistofluorescence подходов. Косвенное иммунологического делает необходимым использование первичного антитела против с-FOS и вторичным антителом, направленным против этого вида, в котором производилось первичное антитело. Для иммуногистохимического метода, вторичное антитело , конъюгированное с ферментом (пероксидазой, например) , который действует на подложке (H 2 O 2 для пероксидазы). Продукт ферментативной реакции разработан хромоген (3,3-диаминобензидина tetrahydrochloridд), которая окрашивает его и можно наблюдать при световой микроскопии. Реакция может быть усилена с помощью сульфата никеля аммония. Эти методы позволяют обнаруживать активных веществ нейронов при различных физиологических проблем, и, следовательно, идентификации и / или отображение периферических и центральных путей, участвующих в последовательных физиологических реакций.

Protocol

Примечание: обнаружение C-FOS представляет собой стандартизированную процедуру с участием нескольких этапов (рисунок 1). Все эксперименты проводились на крысах или мышах. Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по этике в животных Эксперимент Чарльза Дарвина (CE5 / 20…

Representative Results

Обнаружение с-ФОС является полезным инструментом , который позволяет идентифицировать группы активированных клеток при определенных условиях , таких как гипоксия и гиперкапния в естественных условиях (рис 2А) или в ситуациях , которые имитируют эти усло…

Discussion

C-FOS является непосредственным раннего гена, и обнаружение его продукта, белок C-FOS, классически используется для идентификации популяции нейронов , участвующих в конкретных дыхательных реакций в естественных условиях 11,13,25,28 и исключая виво 16-18, 27,32,33.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).

Materials

Cell culture plate 12-Well Costa 35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane Corning 3477 The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) Santa Cruz Biotechnology sc-52
Vectastain Elite ABC KIT  Vector laboratories PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O Sigma 71505
Na2HPO4 Sigma S7907
Paraformaldehyde Sigma P6148
NaOH 0.1N Sigma 43617
Polyvinyl-Pyrrolidone Sigma PVP-360
Sucrose Sigma S7903
NaCl Sigma S7653
Ethylene-glycol Sigma 33068
Triton X100 Sigma T8787
Trisma HCl Sigma T5941
Trisma Base Sigma T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride  Rockland DAB50
Nickel ammonium sulphate Alfa Aesar 12519
H2O2 Sigma H1009
Xylene Sigma 33817
Entellan Neo Merck Millipore 107961
Slide  Thermo-scientific 1014356190 Superfrost ultraplus
Cover glass Thermo-scientific Q10143263NR1 24 x 60mm
BSA Sigma A2153

References

  1. Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
  2. Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
  3. Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
  4. Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
  5. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
  6. Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
  7. Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
  8. Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
  9. Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
  10. Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
  11. Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
  12. Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat’s neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
  13. Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
  14. Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
  15. Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
  18. Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
  19. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
  21. Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
  22. Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
  23. Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
  24. Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
  25. Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
  26. Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
  27. Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
  28. Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
  29. Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
  30. Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
  31. Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
  32. Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
  33. Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
  34. Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
  35. Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
  36. Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
  37. Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).

Play Video

Cite This Article
Perrin-Terrin, A., Jeton, F., Pichon, A., Frugière, A., Richalet, J., Bodineau, L., Voituron, N. The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo. J. Vis. Exp. (110), e53613, doi:10.3791/53613 (2016).

View Video