Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Многие исследования пытаются определить и сопоставить участки мозга, связанные с конкретными физиологическими нормами. Протоонкоген с-ФОС, немедленно раннего гена, выражается в нейронах в ответ на различные стимулы. Белковый продукт можно легко обнаружить с иммуногистохимических методов, приводящих к использованию обнаружения C-FOS к карте группы нейронов, которые отображают изменения в их активности. В этой статье мы сосредоточились на выявлении популяций нейронов ствола головного мозга, участвующих в респираторной адаптации к гипоксии или гиперкапнии. Два подхода были описаны для идентификации вовлеченных популяции нейронов в естественных условиях у животных и ех в естественных условиях деафферентированной препаратов ствола головного мозга. В естественных условиях, животных подвергали гиперкапнических или гипоксических газовых смесей. Ex естественных условиях, деафферентированной препараты были орошали гипоксических или гиперкапнической искусственной спинномозговой жидкости. В обоих случаях, либо контроль в естественных условиях животных или ех естественных условиях препараты содержали в нормоксических и normocapnic условиях. Сравнение этих двух подходов позволяет определить происхождение нейронов , т.е. активации, периферической и / или центральной. В естественных условиях и бывших естественных условиях, brainstems были собраны, фиксированные, и нарезанные на отрезки. После того, как участки были подготовлены, иммуногистохимическое определение белка C-FOS было сделано для того, чтобы идентифицировать стволе мозга группы клеток, активированных гипоксических или гиперкапнических раздражений. Меченые клетки подсчитывали в стволовых дыхательных структур. По сравнению с контрольной группы, гипоксии или гиперкапнии увеличилось количество с-FOS меченых клеток в нескольких конкретных участков ствола головного мозга, которые, таким образом, конститутивный нейрональных путей, участвующих в процессе адаптации центрального дыхательного привода.
C- ФОС ген был идентифицирован впервые в начале 1980 – 1,2 и его продукт был охарактеризован в 1984 году как ядерный белок , имеющий ген-активатор свойства 3,4. Она участвует в долгосрочных механизмов, связанных с нейрон стимуляции. Действительно, изменения в активности нейронов приводит к вторичным мессенджером сигнальных каскадов , которые индуцируют экспрессию непосредственных ранних генов с-FOS, который индуцирует выработку фактора транскрипции с-FOS. Последнее инициирует экспрессию поздних генов и , таким образом , участвует в адаптивных реакций нервной системы ко многим различным типам раздражителей 4. Таким образом, с конца 1980 г. 5,6, обнаружение белка с-ФОС был часто используется для изучения влияния экзогенных факторов на транскрипции генов в общем 4 и на деятельности центральной нервной системы (ЦНС) для картирования из нейронных путей участвует в различных физиологическихAl условия.
Базальный C-FOS выражение было изучено у различных видов , включая мышей, крыс, кошки, обезьяны и человека 4. Таким образом, кинетика его экспрессии относительно хорошо известны. Активация транскрипции происходит быстро ( от 5 до 20 мин) 7,8, а накопление мРНК достигает максимума от 30 до 45 мин после начала стимуляции 9 и уменьшается с коротким периодом полураспада 12 мин. Синтез белка с-ФОС следующим образом накопление мРНК и может быть обнаружен с помощью иммуногистохимии при 20 до 90 мин после стимуляции 6.
Анализ с-FOS выражение классически используется в исследованиях в естественных условиях для определения центральной дыхательной сети , участвующих в вентиляторной реакции на гипоксии или гиперкапнии 10-14. Совсем недавно, этот инструмент был также использован в естественных условиях ех препаратов для изучения стволовых центральных органов дыхания сети адаптации к гипоксии или чypercapnia 15-18. В самом деле, эти препараты генерировать ритмическую активность классически приравнено к центральной респираторной привода 19. Таким образом, этот тип препарата имеет преимущество , так как полностью деафферентированной, и , следовательно, результаты в отношении с-FOS выражение лишь отражают последствия центральной стимуляции без какого – либо вмешательства периферических структур.
Обнаружение с-ФОС могут быть сделаны иммуногистохимических или immunohistofluorescence подходов. Косвенное иммунологического делает необходимым использование первичного антитела против с-FOS и вторичным антителом, направленным против этого вида, в котором производилось первичное антитело. Для иммуногистохимического метода, вторичное антитело , конъюгированное с ферментом (пероксидазой, например) , который действует на подложке (H 2 O 2 для пероксидазы). Продукт ферментативной реакции разработан хромоген (3,3-диаминобензидина tetrahydrochloridд), которая окрашивает его и можно наблюдать при световой микроскопии. Реакция может быть усилена с помощью сульфата никеля аммония. Эти методы позволяют обнаруживать активных веществ нейронов при различных физиологических проблем, и, следовательно, идентификации и / или отображение периферических и центральных путей, участвующих в последовательных физиологических реакций.
C-FOS является непосредственным раннего гена, и обнаружение его продукта, белок C-FOS, классически используется для идентификации популяции нейронов , участвующих в конкретных дыхательных реакций в естественных условиях 11,13,25,28 и исключая виво 16-18, 27,32,33. …
The authors have nothing to disclose.
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
(Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
Triton X100 | Sigma | T8787 | |
Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
Trisma Base | Sigma | T1503 | |
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
H2O2 | Sigma | H1009 | |
Xylene | Sigma | 33817 | |
Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
BSA | Sigma | A2153 |