Detta protokoll ger en metod för att utföra kvantitativ, encelliga in situ analys av proteinuttryck för att studera härstamning specifikation mus preimplantatorisk embryon. De förfaranden som krävs för insamling av blastocyster, hela montering immunofluorescens detektion av proteiner, är avbildning av prov på en konfokalmikroskop och kärnsegmentering och bildanalys som beskrivits.
Detta protokoll ger en metod för att utföra kvantitativ, encelliga in situ analyser av proteinuttryck för att studera härstamning specifikation i mus preimplantatorisk embryon. De förfaranden som krävs för embryosamlings, immunofluorescens, avbildning på en konfokalmikroskop och bildsegmentering och analys beskrivs. Denna metod tillåter kvantifiering av uttrycket av multipla kärnmarkörer och den rumsliga (XYZ) koordinaterna för alla celler i embryot. Det drar nytta av min, en bild segmentering verktyg speciellt utvecklat för analys av konfokala bilder av preimplantatorisk embryon och embryonala stamcells (ESC) kolonier. MIN utför obevakad kärnsegmentering över X, Y och Z dimensioner och ger information om cellposition i tredimensionell rymd, liksom kärn fluorescens nivåer för alla kanaler med minimal användarinmatning. Även om detta protokoll har optimerats för att analysera bilderav preimplantatorisk skede musembryon, kan det lätt anpassas till analys av andra prover som uppvisar en bra signal-brusförhållande och där hög nukleär densitets utgör ett hinder för bildsegmentering (eg., uttryck analys av embryonala stamceller (ESC ) kolonier, differentierande celler i odling, embryon från andra arter eller steg, etc.).
Musen preimplantationsembryot är ett paradigm för att studera uppkomsten och upprätthållandet av pluripotens in vivo, samt en modell för studier av cell öde specifikation och de novo epitelbildning hos däggdjur. Preimplantationsperioden utvecklingsstadier däggdjur är avsedda för fastställandet av de tre cellinjer som utgör blastocysten, nämligen pluripotenta epiblast – som ger upphov till de flesta somatiska vävnader och könsceller – och två extraembryonic härstamningar, trophectoderm (TE) och primitiv endoderm (PRE) (Figur 1A) 1,2. Detta protokoll beskriver förfaranden för att (1) skörd och fixa preimplantatorisk skede musembryon, (2) utför immunofluorescens att märka proteiner av intresse, (3) utföra hela montering avbildning med en konfokalmikroskop med z-sektione kapacitet och (4) utföra kärnsegmentering av konfokala bilder och efterföljande kvantitativa bild analyser. Denna pipeline möjliggör than objektiva mätningar av proteinnivåer för tilldelning av cellidentiteter till karakterisera subpopulationer av celler in situ. Detta protokoll kan utföras i så lite som 3-4 dagar för en enda kull (i allmänhet upp till 10 musembryon), från embryosamlings till dataanalysen (Figur 1B). Samtidig analys av flera kullar skulle öka avbildning och dataanalys annan belastar, och därigenom förlänga den totala längden av protokollet.
Preimplantationsperioden steget musembryo är en experimentellt lätthanterligt system som, med tanke på dess ringa storlek och stereotypa morfologi 3, är väl lämpad för in toto avbildning av cellulära processer med encelliga upplösning. För att utföra en opartisk analys systemnivå av en statistiskt relevant antal embryon, är önskvärt en automatiserad, kvantitativ pipeline analys. Emellertid, tack vare den höga kärndensitet av den inre cellmassan (ICM) av blastocysten ( <stRong> Figur 1A, 2D), konventionella bildsegmente plattformar inte ger tillräcklig noggrannhet för att upprätta en automatisk eller halvautomatisk arbetsflöde. Å andra sidan, manuell segmentering, medan korrekt, inte tillåter bearbetning av stora grupper av celler och embryon, inte heller är det lämpligt för en reproducerbar, objektiv bestämning av cellidentiteter – vilket är särskilt viktigt när man studerar utvecklingsstadier där mönster markör uttryck har inte helt löst (t.ex. inte uppvisar en binärdistribution över en befolkning). Vi har nyligen utvecklat och validerat en bild segmentemetod anpassad för mus preimplantatorisk skede embryon och för mus embryonala stamceller (ESC) som uppnår hög noggrannhet, samtidigt som den kräver minimal användarinmatning 4-8.
Rörledningen analys som presenteras här kretsar kring MATLAB-baserad bild segmentering verktyg Modular Interactive Nuclear Segmente (min) 4. MINS performs obevakad kärnsegmente på stora partier av konfokala Z-stackar efter att användaren har etablerat ett minimalt antal bildegenskaper, med hjälp av ett grafiskt användargränssnitt (GUI) (tabell 1) 4. Denna rörledning har visat sig vara effektiv för generering av hög kapacitet data om proteinuttryck och cell lokalisering i både vildtyp, experimentellt behandlade och genetiskt modifierade embryon och ESCs 5-7. I det nuvarande protokollet beskriver vi tillämpningen av minuter till segmentering av preimplantatorisk skede embryo bilder. För exempel på MINS prestanda på ESC hänvisas till 4,7. Den automatiserade kärnsegmente steg minskar avsevärt tiden bördan av cellidentifikationsprocessen, medan de rumsliga och fluorescensmätningar intensitet tillåter en opartisk bestämning av cellidentiteter och generering av tredimensionella kartor över genuttryck domäner och cellposition i embryot (Figur 1C </strong>). Dessutom skalbarheten detta arbetsflöde gör det som gäller för analys av enskilda kullar genom stora kohorter av experimentellt behandlade embryon, eller embryon från olika genetiska bakgrunder 5,6. MIN är fritt tillgänglig på http://katlab-tools.org (programmet kräver en MATLAB licens).
Ingen metod utvecklats hittills tillåter alstring av sådana djupgående uppgifter om proteinuttryck och cell lokalisering i mus preimplantatorisk embryon. Alla försök hittills på att kvantifiera dessa typer av data har begränsats till den manuella bestämning och kvantifiering av cellantal för olika populationer i embryot (antingen helt manuellt eller mjukvaru assisterad) 9-19. Detta tillvägagångssätt (införliva MINS programvara) har skräddarsytts för och testats på mus preimplantatorisk embryon och ESC; ändå dess prestanda på andra system med hög nukleär densitets, men ännu oprövad, förväntas vara likvärdig.
Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att utföra en kvantitativ analys av hela montera immunofluorescens på preimplantatorisk skede musembryon. En robust immunofluorescens protokoll 22 följs av hög upplösning, hela montering konfokal avbildning och bildsegmentering med hjälp av en skräddarsydd mjukvara 4. Även valet av immunofluorescens-protokollet är inte kritisk, finner vi det som presenteras här 22 att vara snabb, pålitlig och att tillhandahålla robust signal f…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Embryo collection | |||
Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
Forceps | Roboz | RS-4978 | |
Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
M2 | Millipore | MR-015-D | |
FHM | Millipore | MR-024-D | |
Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunofluorescence | |||
96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Glycine | Sigma | G7403 | |
Horse serum | Sigma | H0146 | |
Primary antibodies | Concentration | ||
CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Imaging | |||
35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Segmentation | |||
Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |