Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليف Thermogelling بولي (N-isopropylacrylamide) المركبات كبريتات -graft-الكوندروتن مع الجيني المجهرية الدقيقة لهندسة الأنسجة

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

سقالة هندسة الأنسجة عن طريق الحقن تتكون من بولي (N-isopropylacrylamide) -graft-شوندروتن كبريتات أعد (PNIPAAm-ز-CS) المحتوية المجهرية الدقيقة الجينات. ويتم تحليل قوة لاصقة، وتورم الخصائص وفي توافق مع الحياة المختبر في هذه الدراسة. تقنيات توصيف وضعت هنا قد تكون قابلة للتطبيق لأنظمة thermogelling أخرى.

Abstract

يتم تعريف الحيوية عن طريق الحقن والمواد القابلة للزرع التي يمكن إدخالها في الجسم كسائل وترسيخ في الموقع. هذه المواد توفر مزايا السريرية ليتم زرعها الحد الأدنى جراحية وسهولة تشكيل المواد الصلبة ملء الفضاء في العيوب غير منتظمة الشكل. وقد تم التحقيق على نطاق واسع الحيوية عن طريق الحقن كما السقالات للهندسة الأنسجة. ومع ذلك، من أجل إصلاح بعض المناطق الحاملة في الجسم، مثل القرص الفقرية، السقالات ينبغي أن تمتلك خصائص لاصقة. وهذا التقليل من خطر التفكك أثناء الحركة وضمان اتصال حميم مع الأنسجة المحيطة، وتوفير نقل كاف من القوات. هنا، نحن تصف إعداد وتوصيف سقالة تتألف من حراريا بولي حساسة (N-isopropylacrylamide) كبريتات -graft-الكوندروتن (PNIPAAM-ز-CS) والمجهرية الدقيقة الجينات. كوبوليمر PNIPAAm-ز-CS تشكل حلا لزج في الماء عند RT، إلى التي alginatوالجسيمات العالقة الإلكترونية لتعزيز التصاق. فوق درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST)، حوالي 30 درجة مئوية، والبوليمرات تشكل مادة هلامية الصلبة في جميع أنحاء المجهرية الدقيقة. تكيفنا الإجراءات الحيوية توصيف القياسية لتأخذ في الاعتبار المرحلة الانتقالية عكسها من PNIPAAm-ز-CS. وتشير النتائج إلى أن إدراج جزيئات الجينات / 50 مل أو 75 ملغ إلى 5٪ (ث / ت) الحلول PNIPAAm-ز-CS اربعة اضعاف قوة لاصقة الشد من PNIPAAm-GCS وحده (ف <0.05). إدماج المجهرية الدقيقة الجينات أيضا إلى زيادة كبيرة في القدرة تورم PNIPAAm-ز-CS (ع <0.05)، مما يساعد على الحفاظ على هلام ملء الفضاء داخل عيوب الأنسجة. وأخيرا، نتائج المختبر في علم السموم عدة الفحص، 2،3-bis- (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-sulfophenyl) -2H-نتروبلو-5-carboxanilide (XTT) ولايف / فحص قابلية الميت تشير إلى أن لاصق غير قادرة على دعم بقاء وانتشار مغلفة الكلى الجنينية البشرية (كلوة) 293 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية أكثر من 5 أيام.

Introduction

المواد الحيوية عن طريق الحقن هي تلك التي يمكن أن يتم تسليم مريح في الجسم كسائل وترسيخ في الموقع. وقد طبقت هذه المواد على نطاق واسع في الطب التجديدي، حيث يتم استخدامها لتوصيل الخلايا مغلفة لموقع المتضررين 1-4 ويكون بمثابة المصفوفة خارج الخلية مؤقتة ثلاثية الأبعاد للخلايا 5. بالنسبة للمريض، الحيوية عن طريق الحقن هي مفيدة لأن العمليات الجراحية لزرع هي الحد الأدنى الغازية والصلبة مرحلة يمكن ملء شكل غير منتظم عيوب الأنسجة، مما يلغي الحاجة لزراعة ذي الحجم المخصص.

Injectability لا يمكن أن يتحقق من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. عوامل خارجية، مثل درجة الحموضة، وقد تم التحقيق بمثابة نقطة انطلاق لتشكيل المواد الهلامية التي تغلف الخلايا والجزيئات الحيوية النشطة 6-8. ومع ذلك، ودرجة الحموضة قد لا تكون على الزناد الأكثر ملائمة للاستخدام في جميع البيئات الفسيولوجية. ألترنا التقليدي آخرTIVE لتحقيق injectability يستخدم في الموقع البلمرة الكيميائية أو يشابك. وضعت مجموعة نظام الأكسدة القابلة للذوبان في الماء يتكون من فوق كبريتات الأمونيوم وN، N، N '، N' -tetramethylethylenediamine واستخدامها للتفاعل macromers يتكون من غليكول البولي إيثيلين والبولي (البروبيلين) غليكول 9،10. crosslinked زان وآخرون. 11 شبكات الشيتوزان البولي فينيل الكحول عن طريق الحقن المتقدمة مع غلوتارالدهيد. في مثل هذه الأنظمة، يجب النظر في السمية الخلوية من المكونات المتفاعلة، خاصة بالنسبة للتطبيقات التي تنطوي على تغليف الخلايا. أيضا، يمكن أن البلمرة الطاردة للحرارة ينتج درجة حرارة عالية كافية لتقديم تنازلات الأنسجة المحيطة، والتي تم الإبلاغ عن العظام البوليمر يعزز 12،13.

لا يزال تم وضع أنظمة البوليمر عن طريق الحقن الأخرى التي تظهر على التغيير من السائل إلى الحالة الصلبة مع درجة الحرارة كما الزناد. ما يسمى نظم thermogelling، وهذه هي aqueoلنا البوليمر الحلول التي لا تتطلب التحفيز الكيميائي، أحادية، أو crosslinkers لتحقيق في تشكيل الوضع الطبيعي 14. بدلا من ذلك، مرحلة انتقالية وعادة ما تحدث بالقرب درجة الحرارة الفسيولوجية الحث على تشكيل شبكة ثلاثية الأبعاد crosslinked جسديا. Poloxamers مثل Pluronic F127 هي من بين البوليمرات الأكثر دراسة على نطاق واسع لthermogelling تسليم المخدرات 15-17 وخلية التغليف 18،19. ومع ذلك، فمن المقبول تماما أن هذه المواد الهلامية تفتقر إلى الاستقرار في الظروف الفسيولوجية. وقد أظهرت الدراسات زيادة الاستقرار باستخدام موسعات سلسلة 20 أو crosslinkers الكيميائي 21،22. ومع ذلك، فإن استخدام هذه الكواشف قد تحد من إمكانات المواد لتغليف الخلايا.

بولي (N-isopropylacrylamide) هو thermogelling البوليمر الاصطناعية التي حظيت باهتمام كبير في هندسة الأنسجة والمخدرات تسليم 14. المحاليل المائية للبولي (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) تبدي درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST)، وعادة ما تحدث في جميع أنحاء 32-34 درجة مئوية 23،24. تحت LCST والماء يرطب سلاسل PNIPAAm. فوق درجة حرارة التحول، البوليمر يصبح مسعور، مما أدى إلى مرحلة الفصل المثير 25-27 وتشكيل هلام الصلبة دون استخدام أحادية السامة أو crosslinkers. ومع ذلك، homopolymers PNIPAAm يحمل خصائص المرونة الفقيرة وعقد شرب القليل من الماء في درجة حرارة الفسيولوجية بسبب للا مائية 28. في هذا العمل، نختار لدمج سلفات تساهمي في شبكة PNIPAAm، والذي يوفر إمكانية التحلل الأنزيمي 29، والنشاط المضادة للالتهابات 30،31، وزيادة المياه وامتصاص العناصر الغذائية 32. تم إعداد بوليمرات PNIPAAm مع CS في مختبرنا من قبل البلمرة وNIPAAm مونومر بحضور-functionalized ميتاكريليت CS لتشكيل البوليمرات المطعمة (PNIPAAm-ز-CS). بيكause من منخفض الكثافة يشابك من البوليمرات، PNIPAAm-ز-CS يشكل حل لزجة في الماء عند RT وهلام مرونة في درجة حرارة الفسيولوجية بسبب LCST 29. تصبح الحلول البوليمر flowable مرة أخرى على تبريد تحت LCST بسبب انعكاس حالة من التحول.

لقد أثبتنا أن PNIPAAm-ز-CS لديه القدرة لتكون بمثابة سقالة هندسة الأنسجة، بسبب الخواص الميكانيكية التي يمكن أن تكون مصممة، التحلل، وcytocompatibility مع الكلى الجنينية البشرية (كلوة) 293 الخلايا 29. ومع ذلك، في بعض المناطق الحاملة، مثل القرص الفقري، يجب أن يكون السقالات هندسة الأنسجة القدرة على تشكيل واجهة كبيرة مع الأنسجة المحيطة القرص للقضاء على خطر التفكك 33. هذه الواجهة هي ضرورية أيضا لنقل كافية من القوة عبر واجهة بين الزرع والنسيج 33. في عملنا، ونحن قد علقتالمجهرية الدقيقة lginate في المحاليل المائية من PNIPAAm-ز-CS ووجدت أن دبق يموضع في المجهرية الدقيقة، والتي توفر التصاق مع الأنسجة المحيطة 34. في هذه الورقة، ونحن الخطوط العريضة الخطوات لإعداد thermogelling البوليمر لاصقة. تم تكييف التقنيات القياسية لتوصيف المواد الحيوية، التصوير الخلية، والمقايسات للبقاء على أن تأخذ في الاعتبار حساسية درجة حرارة من البوليمر والعودة إلى الوراء لمرحلة انتقالية. البوليمر عن طريق الحقن وصفها في هذه الورقة لديها امكانات واسعة لتسليم المخدرات وهندسة الأنسجة التطبيقات خارج تلك الموضحة في هذه الورقة. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب توصيف الموصوفة هنا قد تكون قابلة للتطبيق لأنظمة thermogelling أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بولي (N-isopropylacrylamide) -g-شوندروتن كبريتات التجميعي

  1. قبل تركيب هيدروجيل bioadhesive، تنقية N-isopropylacrylamide (NIPAAm) مونومر وسلفات ميتاكريليت (CS).
    1. تزن بها لا يقل عن 10 غراما من NIPAAm وحل مونومر في 400 مل من ن الهكسان عند 60 درجة مئوية. إثارة الحاوية بشكل دوري حتى حل كامل. أعد بلورة الحل في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    2. إزالة مونومر تبلورت من الحاويات وفراغ مرشح ن الهكسين باستخدام القمع بوخنر. وضع مونومر في فرن فراغ في RT لمدة 24 ساعة لإزالة أي المتبقية ن الهكسان. تخزين مونومر في الثلاجة -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا (انظر الخطوة 1.2).
    3. تزن بها وتذوب 2.0 غرام من كبريتات شوندروتن في 8.0 مل من الماء منزوع الأيونات. تسخن بلطف الحل إلى 60 درجة مئوية.
    4. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 10 باستخدام ما يقرب من 10-40 ميكرولتر من 50٪ (ث / ث) هيدروكسيد الصوديوم.
    5. إضافة 0.298 مل من الخل ميثاكريليك (MA). الجزر لمدة 24 ساعة، مع التحريك عند 60 درجة مئوية.
    6. صب 400 مل من محلول الاسيتون في وعاء والبرد O / N في الثلاجة -20 درجة مئوية.
    7. بعد 24 ساعة انقضت، صب ببطء الحل بأكمله methacrylated CS (MCS) في 400 مل من الأسيتون البارد، مع التحريك مع شريط مغناطيسي.
    8. إزالة MCS من الأسيتون ووضع راسب في فرن فراغ. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة للحفاظ على دولة سليمة ومتماسكة لMCS. السماح للالأسيتون المتبقية لتتبخر تحت فراغ لا يقل عن 24 ساعة.
  2. شارك في حل 10 غرام من NIPAAm تنقيته و2.209 غرام من MCS في 232 مل من الماء منزوع الأيونات.
  3. تطهير حل الأكسجين باستخدام غاز النيتروجين الخامل. الحفاظ على القوي، ولكن انخفاض معدل تدفق الغاز لمنع الحل من السطح على مدى 15 دقيقة.
  4. تواصل تطهير حل مع غاز النيتروجين وإضافة 0.976 مل من tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. التالي، والشروع في رد فعل البلمرة عن طريق خلط 97.6 ملغ من فوق كبريتات الأمونيوم (APS).
  6. مزيج الحل لحوالي 20 ثانية وبسرعة ختم الحل لمنع أي الهواء من دخول السفينة. السماح للحل لتتبلمر تحت ضوء الفلورسنت لمدة 24 ساعة.
  7. بعد 24 ساعة، وضع وعاء التفاعل إلى 37 درجة مئوية الفرن. السماح للهيدروجيل للانتقال من الحالة السائلة إلى حالة تشبه الهلام. غمر هيدروجيل بلمرة في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ليصبح المجموع 7 أيام للسماح للنشر مونومر غير المتفاعل من هيدروجيل.
  8. باستخدام زوج من مقص، وقطع هيدروجيل إلى عدة قطع صغيرة، لا يزيد عن 5 سم في القطر. لمنع هيدروجيل من الانتقال من حالة تشبه الجل السائل، الزهر البوليمر داخل الحل C PBS 37 درجة. نقل أجزاء إلى 50 مل أنابيب مخروطية.
  9. تحضير عينات للتجفيد التفاف قممالأنابيب مع Kimwipes والأربطة المطاطية. تجميد الأنابيب عند -70 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
  10. وضع أنابيب مخروطية على مجفف تجميد لإزالة جميع المياه من هيدروجيل. قبل التشغيل، يحتاج مجفف تجميد للوصول إلى درجة الحرارة والضغط من حوالي -40 درجة مئوية و 0.04 م بار، على التوالي. مطلوب ما لا يقل عن 7 أيام لتجفيف كامل.
  11. طحن تجميد المجفف البوليمر إلى مسحوق ناعم وتخزينها في 4 درجات مئوية الثلاجة لاستخدامها لاحقا (راجع الخطوة 3.1).

2. الكالسيوم-الجينات Crosslinked Microparticle التجميعي

  1. إعداد 2٪ (ث / ت) حل الجينات عن طريق إذابة 400 ملغ في 20 مل من الماء منزوع الأيونات. الحرارة الحل إلى ما يقرب من 60 درجة مئوية لتسهيل حل.
  2. إعداد 2٪ (ث ت /) محلول كلوريد الكالسيوم بإضافة 400 ملغ إلى 20 مل من الماء منزوع الأيونات.
  3. خلق النفط في خليط المياه من خلال الجمع بين 100 مل من زيت الكانولا، 1.0 مل من توين 20، و 20 ملمن 2٪ (ث / ت) الجينات. استحلب الخليط لمدة 10 دقيقة مع الخالط في 15000 دورة في الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك، مع مزيج من شريط مغناطيسي في 200 دورة في الدقيقة أو 2000 دورة في الدقيقة لخلق المجهرية الدقيقة كبيرة أو صغيرة، على التوالي.
  4. نضح 2٪ (ث / ت) محلول كلوريد الكالسيوم باستخدام حقنة مع 18 G طرف الإبرة. ببطء إضافة كلوريد الكالسيوم قطرة من الحكمة في مستحلب.
  5. مرة واحدة وقد تم استنفاد 20 مل من كلوريد الكالسيوم، والسماح للالمجهرية الدقيقة داخل مستحلب لتشعبي لمدة 10 دقيقة.
  6. بالتساوي توزيع الدفعة المجهرية الدقيقة في توج أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لقوة من 1400 x ج لمدة 2 دقيقة لإزالة الطبقة الأولى من زيت الكانولا.
  7. على التوالي غسل، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي في المجهرية الدقيقة مع الأيزوبروبانول ما مجموعه ثلاث مرات في 1400 ز لمدة 2 دقيقة لإزالة أي زيت الكانولا المتبقية. تجاهل طاف الأيسوبروبانول بعد كل خطوة الطرد المركزي، ويغسل مع الأيزوبروبانول جديدة.
  8. وبمجرد أن منظمة اوكسفام الدوليةتمت إزالة لتر، كرر الإجراء الغسيل ثلاث مرات إضافية مع الماء منزوع الأيونات لإزالة أي الأيسوبروبانول المتبقية. تجاهل طاف منزوع الأيونات الماء بعد كل خطوة الطرد المركزي، ويغسل بالماء منزوع الأيونات الطازجة. إزالة ما يقرب من 100 ملغ من المجهرية الدقيقة الرطب وتخزينها في قارورة. سيتم استخدام المجهرية الدقيقة الرطب لقياس متوسط ​​قطر دفعة بواسطة المجهر الضوئي.
    1. باستخدام المجهر الضوئي، تفريق عينة صغيرة من المجهرية الدقيقة الرطب في الماء منزوع الأيونات على شريحة المجهر. اعتمادا على حجم المجهرية الدقيقة، واستخدام الهدف 10X أو 20X، وضبط الفتحة العددية حتى تتفتت الجزيئات إلى التركيز. تأكد من أن المجهر يتم معايرة للهدف الصحيح وضبط سطوع مصدر الضوء حسب الحاجة. استخدام أداة خط لقياس أطول قطر من 50 المجهرية الدقيقة الجينات عشوائي والحصول على متوسط ​​حجم الدفعة.
  9. إعداد المجهرية الدقيقة لتجفيد بذ التفاف عليها مع Kimwipes وتأمينها مع الأربطة المطاطية. تجميد المجهرية الدقيقة في -70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. وضع المجهرية الدقيقة على مجفاد والسماح للعينة لتجف لمدة لا تقل عن 24 ساعة. طحن تجميد المجهرية الدقيقة المجفف إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون ومدقة وتخزينها في 4 درجات مئوية الثلاجة لاستخدامها لاحقا (راجع الخطوة 3.3).

3. إعداد المواد اللاصقة

  1. باستخدام مسحوق البوليمر تجميد المجفف، إنشاء 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS حل عن طريق إذابة 50 ملغ من مسحوق هيدروجيل في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  2. مزيج الحل باستخدام الدوامة والبرد في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. وبمجرد أن أشكال حل لزجة، إنشاء مركب متجانس بإضافة 25 أو 50 ملغ من تجميد المجفف المجهرية الدقيقة الجينات إلى حل هيدروجيل ودوامة. تخزين المركبة في ثلاجة عند 4 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا (انظر الخطوات 4.3 و 4.8).

4. Bioadhesive الميكانيكيةاختبارات الشد anical

  1. قبل إجراء اختبارات الشد، استخراج الغضروف الركيزة من الأذن الخنزير.
    1. تذويب أذن الخنزير في حارة 0.9٪ (ث / ت) حل كلوريد الصوديوم. هذا سوف يساعد على تخفيف الأنسجة.
    2. باستخدام مشرط، عزل وقسم من منطقة مسطحة، مستطيلة من خلال خفض عموديا على الرغم من أن طبقة البشرة والأنسجة تحت الجلد، والغضاريف. تجنب قطع التلال منحنية الأذن الخنزير.
    3. فصل طبقة البشرة من الجلد من الغضروف عن طريق خفض مواز من خلال الأنسجة تحت الجلد. الغضروف هو والأنسجة الصلبة البيضاء الموجودة تحت الجلد الخنازير.
    4. كشط بعناية الأنسجة تحت الجلد التي يتم تركيبها في الغضروف مع الجانب من مشرط. تجنب قطع في أنسجة الغضروف مع شفرة المشرط.
    5. تأكد من جانب واحد فقط من الغضروف يتعرض وشقة خلال اختبار الشد. إذا لزم الأمر، تتسطح الغضروف بقطع الجلد متفاوتة على الجانب السفلي.
    6. قطع أنسجة الغضروف الى عدة قطع مع أبعاد 1 سم × 1 سم. تخزين الأنسجة الغضروف في أنابيب مخروطية مليئة 0.9٪ (ث / ت) كلوريد الصوديوم الحل في الثلاجة -20 درجة مئوية.
  2. تحضير 2.0 لتر من 0.9٪ (ث / ت) حل كلوريد الصوديوم. قبل تسخين المحلول الملحي إلى 37 درجة مئوية. فإن درجة حرارة هذا الحل يحتاج إلى الحفاظ عليها طوال الاختبار.
  3. تذويب الغضروف المجمدة. تبقي على حد سواء الغضروف الخنازير والعينات هيدروجيل في وعاء الستايروفوم مع كمادات الثلج.
  4. إرفاق قياس قوة ذراع موقف الاختبار. وضع موقد على أعلى من موقف قوة وضبط درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية.
  5. ألصق 1 سم × 1 سم قطعة من الغضروف إلى كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ مع الغراء cyanoacrylate وزوج من ملاقط. الغراء قطعة إضافية من الغضروف إلى الأسطوانة Delrin وإرفاق اسطوانة لقياس قوة. من المهم جدا أن كلا من أسطح الغضروف تواجه بعضها البعض والاتصال هيدروجيل.
  6. مكانحمام مائي زجاجي على أعلى لوحة الساخنة وإدراج كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ مع الركيزة الغضروف داخل الحمام.
  7. انخفاض ذراع موقف الاختبار ومحاذاة كل من ركائز الغضاريف مع بعضها البعض. رفع الذراع وترك مساحة كافية لتطبيق هيدروجيل.
  8. مع ماصة الإزاحة الإيجابية، الاستغناء عن 200 ميكرولتر من هيدروجيل bioadhesive إلى أسفل قطعة من الغضروف.
  9. انخفاض ذراع موقف قوة في 1 مم / دقيقة حتى الاتصالات هيدروجيل قطعة العلوي من الغضروف ويمارس قوة التحميل المسبق من 0.001 N.
  10. صب 37 ° C حل المالحة في الحمام حتى يصل حجم منسوب المياه المعينة. تحقق درجة حرارة الحل مع الحرارية.
  11. السماح للهيدروجيل لضبط ما مجموعه 5 دقائق. مرة واحدة وقد عززت هلام، ورفع الذراع بسرعة 2 مم / دقيقة. اكتمال الاختبار مرة واحدة يفصل bioadhesive من الركيزة الغضروف أو عندما يحدث انخفاض كبير في القوة،مما يشير إلى الفشل.
  12. جمع البيانات المسجلة ورفع ذراع موقف الاختبار. إزالة الاسطوانة Delrin من قياس قوة. صب محلول ملحي في حاوية السابقة ويسخن إلى 37 درجة مئوية.
  13. حساب الضغوط عن طريق طرح قوة من البوليمر المبذولة من قوة الطفو على "بياض"، المرفق Delrin مع عدم وجود غضروف أو لاصق، والتي أثيرت في نفس المعدل، وقسمة الناتج على منطقة السندات.

5. تورم دراسة PNIPAAm-ز-CS مع الجيني المجهرية الدقيقة

  1. إعداد قارورة زجاجية نظيفة والتسمية عليها بشكل مناسب مع نقطة زمنية، نوع العينة، وعدد العينة. يمكن أيضا إنشاء مواد لاصقة، كما هو موضح سابقا. إعداد ما مجموعه خمس عينات (ن = 5) لكل نوع العينة في نقطة زمنية.
  2. قبل تزن كل قارورة من الزجاج وتسجيل كتلتها الأولية في RT.
  3. باستخدام حقنة، الاستغناء عن حوالي 0.4 مل من عينة لاصقة مستعدة في كل من قارورة خمسة.كرر هذه الخطوة لكل نوع العينة في جميع النقاط الزمنية التي تم اختبارها.
  4. وزن وتسجيل كتلة كل قارورة مع لاصقة نوع العينة في RT.
  5. قبل تدفئة حاضنة المدارية و1 لتر من محلول برنامج تلفزيوني 1X إلى 37 درجة مئوية.
  6. تنظيم كل من القوارير على رف وإدراج رف في الحاضنة. السماح للمواد لاصقة للانتقال من الحالة السائلة إلى مادة هلامية ما يقرب من 5 إلى 10 دقيقة.
  7. إضافة 5.0 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل قارورة. تأكد من إضافة بعناية الحل برنامج تلفزيوني على طول الجانب من القارورة لمنع القرص هيدروجيل من التفكك.
  8. تتويج كل قارورة لمنع التبخر من الحل في برنامج تلفزيوني والحفاظ على درجة الحرارة الداخلية للحاضنة عند 37 درجة مئوية. وسيكون لكل مجموعة من أقراص هيدروجيل تحتاج أن تظل غارقة في برنامج تلفزيوني لفترة معينة من الزمن.
  9. مرة واحدة وقد تم التوصل إلى نقطة زمنية 7 أيام، إرفع قبعة مجموعة من قارورة وإزالة الحل برنامج تلفزيوني من كل قارورة. تزن كل قارورة مع عينة من المواد اللاصقة مرة أخرى في RT.
<ص الطبقة = "jove_title"> 6. النوعية بقاء الخلية باستخدام لايف / الفحص الميت

  1. قبل تنفيذ ايف / فحص الميت مع PNIPAAm-ز-CS، وتنمو في الكلى الجنينية البشرية 293 الخلايا (كلوة-293) إلى 80٪ التقاء.
    1. سريعة الذوبان المجمدة كلوة-293 تعليق الخلية عن طريق وضع cryovial في 37 ° C حمام الماء، ثم الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    2. لجعل متوسط ​​نمو الخلايا اول ممر، والجمع في ارتفاع نسبة الجلوكوز (4.5 جم / لتر) Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) إلى تركيز النهائي من 20٪ والحل البنسلين الستربتوميسين 100X ( القلم بكتيريا) إلى تركيز النهائي من 100 وحدة دولية / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل. لجميع المقاطع الأخرى، والتحول إلى DMEM مع 10٪ FBS و1X القلم بكتيريا.
    3. resuspend الكرية خلية في 10 مل من وسط النمو ونقل تعليق في واحدة 100 ملم طبق بتري قطر. د بالتساويistribute الخلايا عن طريق إمالة بلطف الجبهة طبق لدعم واليسار إلى اليمين عدة مرات كل اتجاه.
    4. ثقافة الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. إذا لزم الأمر، تغيير المتوسطة كل يومين.
    5. عندما تصل خلايا 80٪ confluency، تكرار الثقافة في أطباق متعددة. إزالة المتوسطة من لوحة.
    6. إضافة 1 مل من 0.5٪ التربسين إلى اللوحة. السماح لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحقق لمعرفة ما إذا كان فصل الخلايا من السطح يحوم بلطف لوحة.
    7. لتقسيم الثقافة 01:10، إضافة 9 مل من المتوسط ​​النمو المنتظم (DMEM مع 10٪ FBS) إلى الخلايا trypsinized وبلطف مزيج من قبل إمالة الطبق.
    8. الاستغناء 1 مل من تعليق خلية المخفف إلى كل طبق جديد وإضافة 9 مل من متوسط ​​النمو. المزيج بلطف عن طريق إمالة الطبق.
    9. ثقافة الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. إذا لزم الأمر، تغيير المتوسطة من أي وقت مضىذ يومين حتى خلايا تصل إلى 80٪ التقاء.
  2. إزالة وسائل الإعلام من أطباق ثقافة اثنين نمت إلى 80٪ التقاء.
  3. إضافة 1 مل من 0.5٪ التربسين إلى كل لوحة. السماح لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحقق لمعرفة ما إذا كان فصل الخلايا من السطح يحوم بلطف لوحة.
  4. غسل الخلايا كلوة-293 على لوحة مع 3 مل من متوسط ​​النمو مرتين وإضافة كل تعليق لنفس أنبوب مخروطي 15 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 15 مل لمدة 10 دقيقة في 400 x ج في 4 درجات مئوية.
  6. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 3 مل من المتوسط ​​من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  7. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية في عدادة الكريات وإجراء تعداد خلايا لتحديد كثافة الخلية. زيادة حجم تعليق متوسطة إذا كان تركيز الخلية الأولي مرتفع جدا، وعلى العكس من خفض مستوى الصوت إذا كان تركيز منخفض جدا، من أجل الحفاظ على تناسق الهدفالتموينية من 1 × 10 6 خلية / مل. الطرد المركزي الخلايا كلوة-293 في 400 x ج و resuspend بيليه خلية في حجم تصحيح من وسائل الاعلام وفقا لذلك.
  8. دوامة بلطف تعليق الخلية وتوزيعها بالتساوي على مزيج الخلية إلى أربعة أنابيب منفصلة 15 مل المخروطية لظروف الاختبار التالي: أحادي الطبقة مراقبة إيجابية، ومراقبة سلبية قتلوا في PNIPAAm-ز-CS باستخدام 70٪ (ت / ت) والميثانول، وكلوة-293 خلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS، وكلوة-293 الخلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات.
  9. إنشاء الطبقات الوحيدة مراقبة إيجابية من قبل pipetting متعددة من 300 مجلدا ميكرولتر من مزيج الخلية إلى 24 لوحة جيدا لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  10. إزالة وسائل الإعلام من الأنابيب المخروطية المتعلقة السيطرة قتل، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات.
    1. أنابيب الطرد المركزي المخروطية لمدة 5 دقائق في 400 x ج وإزالة طاف.
    2. الحفاظ على تركيز خلية نفسه عن طريق إعادة التعليق على جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في نفس الحجم من PNIPAAm-ز-CS كما وسائل الإعلام إزالتها. ماصة مزيج خلية البوليمر صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية حتى متجانسة.
      1. إذا البذر مع المجهرية الدقيقة الجينات، نقل تعليق PNIPAAm-ز-CS-الخلية (التي تم الحصول عليها كما هو موضح ل6.10.2) في طبق ثقافة 35 ملم وأعرض الجسيمات في هذا المزيج. ماصة مزيج خلية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية حتى متجانسة.
    3. باستخدام ماصة المصلية، الاستغناء متعددة 300 ميكرولتر من مزيج خلية البوليمر في كل من الآبار من أجل السيطرة قتل، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  11. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة، والسماح للPNIPAAm-ز-CS الانتقال من الحالة السائلة إلى مادة هلامية (البوليمر يشكل قرص معتم والأبيض).
  12. ضع شريحة دفئا في غطاء محرك السيارة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. استخدام الشريحة الأكثر دفئا للحفاظ على لوحة جيدادرجة الحرارة وماصة 600 ميكرولتر من وسائل الاعلام قبل تحسنت في كل بئر. لمزيد من منع الانتقال من البوليمر إلى الحالة السائلة، ضع مصباح مع لمبة الفلورسنت فوق طبق في عملية الاحماء في الهواء فوقه.
  13. احتضان الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  14. بعد انقضاء خمسة أيام، وإعداد مزيج صبغ لايف / الميت باستخدام homodimer إيثيديوم (EthD-1) وcalcein AM. كلا مواد خفيفة حساسة وأعد في يوم من الاستخدام.
    1. تذويب AM calcein وEthD-1 من عدة في RT.
    2. إضافة 5 مل من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X إلى أنبوب مخروطي الشكل والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم.
    3. إضافة 6.67 ميكرولتر من 2 ملي EthD-1 إلى أنبوب مخروطي الشكل. دوامة الخليط حل شامل.
    4. المقبل، إضافة 2.5 ميكرولتر من 4 مم calcein صباحا إلى أنبوب مخروطي الشكل. دوامة الخليط جيدا.
  15. إزالة وسائل الإعلام من آبار أحادي الطبقة (مراقبة إيجابية)، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS خفة دمالمجهرية الدقيقة ح الجينات. يغسل كل من الآبار بدقة، ولكن بلطف، مع برنامج تلفزيوني وإزالة برنامج تلفزيوني.
  16. السماح للأقراص هيدروجيل تحتوي على المجهرية الدقيقة الجينات لتسيل على RT وإضافة 2 مل من 50 ملي سيترات الصوديوم إلى كل من الآبار.
  17. إزالة وسائل الإعلام من الآبار خلية قتل (المراقبة السلبية). السماح للأقراص هيدروجيل لتسيل على RT وإضافة 300 ميكرولتر من 70٪ (V / V) الميثانول إلى كل بئر.
  18. احتضان لوحة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  19. إزالة سترات الصوديوم والحلول الميثانول من الآبار وماصة كل من الايقاف هيدروجيل إلى أنابيب microcentrifuge الفردية. أنابيب الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة لفصل الخلايا من تعليق هيدروجيل.
  20. إزالة بعناية تعليق من قبل pipetting الحل من أنبوب مخروطي الشكل، وترك وراء بيليه الخلية. Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقل إلى لوحة جيدا الأصلية.
  21. إضافة 300 ميكرولتر من رانه لايف / مزيج صبغ الميت إلى كل من الآبار. التفاف لوحة جيدا في رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة 45 دقيقة على الروك في RT.
  22. صورة كل من العينات تحت المجهر مضان مقلوب مع هدف 10X. والخلايا الحية والخلايا مقتل عرض مضان الأخضر والأحمر على التوالي.

7. الكمية بقاء الخلية باستخدام الفحص XTT

  1. تنمو كلوة-293 الخلايا إلى 80٪ التقاء. إزالة وسائط النمو من أطباق ثقافة اثنين.
  2. إضافة 1 مل من 0.5٪ التربسين إلى كل لوحة. السماح لوحات لاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تحقق لمعرفة ما إذا كان فصل الخلايا من السطح يحوم بلطف لوحة.
  3. غسل الخلايا كلوة-293 على لوحة مع 3 مل من وسائل الاعلام مرتين وإضافة كل تعليق لنفس أنبوب مخروطي 15 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 15 مل لمدة 10 دقيقة في 400 x ج في 4 درجات مئوية.
  5. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 3 مل من وسائل الاعلامpipetting صعودا وهبوطا.
  6. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية في عدادة الكريات وإجراء تعداد خلايا لتحديد كثافة الخلية. كما هو موضح سابقا، والحفاظ على تركيز الهدف من 1 × 10 6 خلية / مل. الطرد المركزي الخلايا كلوة-293 في 400 x ج و resuspend بيليه خلية في حجم تصحيح من وسائل الاعلام وفقا لذلك.
  7. دوامة بلطف تعليق الخلية وتوزيعها بالتساوي على مزيج الخلية إلى أربعة أنابيب منفصلة 15 مل المخروطية لظروف الاختبار التالي: أحادي الطبقة مراقبة إيجابية، ومراقبة سلبية قتلوا في PNIPAAm-ز-CS باستخدام 70٪ (ت / ت) والميثانول، وكلوة-293 خلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS، وكلوة-293 الخلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات.
  8. إنشاء الطبقات الوحيدة مراقبة إيجابية من قبل pipetting 300 ميكرولتر من مزيج الخلية إلى 24 لوحة جيدا لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  9. إزالة وسائل الإعلام من الأنابيب المخروطية المتعلقة السيطرة قتل، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات.
    1. أنابيب الطرد المركزي المخروطية لمدة 5 دقائق في 400 x ج وإزالة طاف.
    2. الحفاظ على تركيز خلية نفسه عن طريق إعادة التعليق الخلايا في نفس الحجم من PNIPAAm-ز-CS كما وسائل الإعلام إزالتها. ماصة مزيج خلية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية حتى متجانسة.
      1. إذا البذر مع المجهرية الدقيقة الجينات، نقل تعليق PNIPAAm-ز-CS-خلية في صحن الثقافة 35 مم وإدخال الجزيئات في هذا المزيج. ماصة مزيج خلية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة المصلية حتى متجانسة.
    3. باستخدام ماصة المصلية، الاستغناء عن 300 ميكرولتر من مزيج خلية البوليمر في كل من الآبار من أجل السيطرة قتل، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  10. مرة واحدة فقط من العينات التي تحتوي على الخلايا التي تمت إضافتها إلى لوحة 24-جيدا، الاستغناء متعددة من 300 مجلدا ميكرولتر من PNIPAAm-ز-CS وPNIPAصباحا-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات دون الخلايا في الآبار المجاورة لتوليد 4-6 عينات تكرار.
  11. احتضان لوحة 24-جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة، والسماح للPNIPAAm-ز-CS الانتقال من الحالة السائلة إلى مادة هلامية (البوليمر يشكل قرص معتم والأبيض).
  12. ضع شريحة دفئا في غطاء محرك السيارة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. استخدام الشريحة الأكثر دفئا للحفاظ على درجة حرارة جيدا لوحة وماصة 600 ميكرولتر من DMEM واضحا قبل تحسنت في كل بئر. لمزيد من منع الانتقال من البوليمر إلى الحالة السائلة، ضع مصباح مع لمبة الفلورسنت فوق طبق في عملية الاحماء في الهواء فوقه.
  13. احتضان الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
  14. بعد انقضاء خمسة أيام، وإعداد 2،3 bis- (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-sulfophenyl) -2H-نتروبلو-5-carboxanilide (XTT) كاشف من الشركة المصنعة. كاشف XTT هو ضوء حساسية واستعداد في يوم من الاستخدام.
    1. إزالة زجاجة العنبر تحتوي علىجي مسحوق XTT من الثلاجة. باستخدام محقنة معقمة وإبرة، حقن 5 مل من DMEM واضح (لا أحمر الفينول) من خلال الحاجز المطاطي في زجاجة العنبر.
    2. حرارة الكاشف إلى 56 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقيقة أو حتى يذوب.
    3. وعلاوة على ذلك تمييع كاشف XTT إلى 20٪ (ت / ت) في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل ملفوفة في رقائق الألومنيوم. قسامة كاشف XTT الزائد في أنابيب microcentrifuge ووضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  15. إزالة وسائل الإعلام من الآبار خلية قتل (المراقبة السلبية) وإضافة 300 ميكرولتر من 70٪ (V / V) الميثانول إلى كل بئر. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وإزالة الميثانول من الآبار.
  16. إزالة وسائل الإعلام من الآبار المتبقية من أحادي الطبقة (مراقبة إيجابية)، PNIPAAm-ز-CS، وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات. يغسل كل من الآبار بدقة، ولكن بلطف، مع برنامج تلفزيوني ثم قم بإزالة برنامج تلفزيوني.
  17. إضافة 300 ميكرولتر من 20٪ XTT كاشف لكل من الآبار. التفاف 24 لوحة جيدا في رقائق الألومنيوم واحتضان لمدة 24 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
  18. بعد 24 ساعة، إضافة 200 ميكرولتر من 50 ملي سيترات الصوديوم إلى كل من الآبار واحتضان على الروك لساعة إضافية واحدة.
  19. نقل كل من الايقاف البوليمر لأنابيب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
  20. نقل 200 ميكرولتر من طاف من كل أنبوب microcentrifuge لوحة 96-جيدا. باستخدام لوحة القارئ عيار مكروي، الحصول على قراءات الامتصاصية محددة في 450 قراءات الامتصاصية نانومتر وغير محددة في 690 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم توليفها واستجابة حراريا المطعمة البوليمر المشترك بنجاح وتميز لقوتها bioadhesive، وتورم الخصائص، وفي cytocompatibility المختبر. اخترنا للتحقيق في الجينات نظرا لخصائص mucoadhesive راسخة لها. والمخلوطة المجهرية الدقيقة الجينات، مع متوسط ​​قطرها 59.7 ± 14.9 ميكرون، مع 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS بتركيزات 25، 50، و 75 ملغ / مل. واستندت هذه التركيزات على نصف واحد، أي ما يعادل، وضعف ما يعادل الوزن الجاف للPNIPAAm-ز-CS في محلول مائي. تركيزات Microparticle فوق 75 ملغ / مل أظهرت اللزوجة المفرطة ولم التحقيق. الحد الأقصى لقوة الشد لاصقة من 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS مع قورنت تركيزات مختلفة من المجهرية الدقيقة الجينات إلى هيدروجيل وحدها. إضافة 50 أو 75 ملغ / مل من المجهرية الدقيقة الجينات علقت في 5٪ (ث / ت) أدى PNIPAAm-ز-CS في المؤتمر الوطني العراقي أربعة أضعافrease في قوة الشد (ع <لم 0.05)، كما هو مبين في الشكل 1. وهناك تركيز microparticle من 25 ملغ / مل لا تظهر زيادة كبيرة في قوة الشد مقارنة مع 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS (ع> 0.05). لم يكن هناك تغيير كبير في قوة الشد من 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS عند زيادة تركيز المجهرية الدقيقة الجينات 50-75 ملغ / مل (P> 0.05).

تميزت خصائص تورم في هيدروجيل bioadhesive عن طريق غمر الصياغات المختلفة في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية. تم اختبار تركيزات microparticle الجينات بين 25 و 50 ملغ / مل لتحديد أي اختلافات في تورم السلوك. تم قياس المجهرية الدقيقة الجينات باستخدام المجهر الضوئي، وكان متوسط ​​قطرها 25.0 ± 14.4 ميكرون. بعد 7 أيام، وقد حسبت كتلة الرطب الأولية والنهائية كانت سجلت أقراص هيدروجيل وتغيير في كتلة لعينات متعددة في formulatio لاصقةن (ن = 5). ويبين الشكل 2 الفرق الكبير في التغيير في الكتلة بين جميع الصيغ. تظاهر اللاصقة تحتوي على كل من 25 و 50 ملغ / مل من المجهرية الدقيقة الجينات تغييرات إيجابية في الكتلة، بينما 5٪ (ث / ت) انخفض PNIPAAm-ز-CS في الكتلة. تم العثور على جميع العينات لتكون مختلفة كثيرا عن بعضها البعض (ع <0.05) مع لاصقة تحتوي على 50 ملغ / مل من المجهرية الدقيقة الجينات التي تبين الأثر الأكبر تورم.

وكان التحقيق في توافق مع الحياة لاصقة المقترحة كما ونوعا من خلال استخدام لايف / الميت وXTT فحص السمية الخلوية. كانت مغلفة كلوة-293 الخلايا في كل من 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS و 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS تحتوي على 50 ملغ / مل من المجهرية الدقيقة الجينات مع متوسط ​​قطرها 59.7 ± 14.9 ميكرون . ويعتبر أحادي الطبقة من الخلايا وخلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS قتل مع 70٪ الميثانول الإيجابية ونيجاTIVE ضوابط، على التوالي. وتميزت تركيبات المصنف مع الخلايا بعد 5 أيام من النمو في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. وأشار كل اختبار بقاء الخلية جيدة لكلا PNIPAAm-ز-CS وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة. صور من الشكل (3) توضح الخلايا الحية الاستشعاع الأخضر في كل من التصاق (ألواح A و B) وأحادي الطبقة الخلية، بوصفه السيطرة الايجابية (لوحة C). خلايا قتل (لوحة D) يتألق اللون الأحمر، وتظهر موت الخلايا. وأكدت نتائج اختبارات السمية الخلوية XTT نتائج لايف / فحص الميت. بقاء الخلية النسبية لاصقة تحتوي على 50 ملغ / مل من المجهرية الدقيقة انخفضت 1.3 أضعاف مقارنة PNIPAAm-ز-CS كما هو موضح في الشكل (4)، ولكن هذا الانخفاض لا يعتد به إحصائيا (P> 0.05). وكان كل من PNIPAAM-ز-CS وPNIPAAM-ز-CS مع المجهرية الدقيقة أيضا صلاحية مماثلة لأحادي الطبقة الخلية (P> 0.05). خلايا مغلفة في HYDRتم العثور على تركيبات ogel وأحادي الطبقة الخلية لتكون مختلفة بشكل كبير مقارنة مع سيطرة سلبية (P <0.05). وعموما، تشير هذه النتائج إلى أن لاصقة تحتوي على المجهرية الدقيقة ليس المعارض الوحيد زادت قوة لاصقة، ولكن توافق مع الحياة جيدة كذلك.

شكل 1
الشكل 1. تأثيرات على قوة الشد بعد دمج متباينة تركيزات الجيني المجهرية الدقيقة إلى 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS. قوة الشد من PNIPAAm-ز-CS تضاعف أربع مرات مع إضافة 50 أو 75 ملغ / مل من المجهرية الدقيقة الجينات (ص <0.5). تمثل أشرطة الخطأ محسوب فاصل الثقة 95٪ (ن = 5). كان المجهرية الدقيقة الجينات متوسط حجم 59.7 ± 14.9 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. و>

الشكل 2
الشكل 2. تأثير تغيير تركيزات الجيني المجهرية الدقيقة على القدرات تورم 5٪ (ث / ت) PNIPAAm-ز-CS. بعد 7 أيام الغمر في 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني، وانخفاض PNIPAAm-ز-CS في الكتلة الرطبة نظرا ل خصائص مسعور من PNIPAAm فوق LCST. PNIPAAm-ز-CS مع 25 أو 50 ملغ / مل من المجهرية الدقيقة الجينات عرضت تورم القدرة. زيادة تركيز المجهرية الدقيقة بشكل ملحوظ (ف <0.05) التغير في كتلة هيدروجيل أكثر من 7 أيام، ويعزى ذلك إلى امتصاص الماء. تمثل أشرطة الخطأ محسوب فاصل الثقة 95٪. كان المجهرية الدقيقة الجينات متوسط حجم 25.0 ± 14.4 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

gether.within الصفحات = "1"> الشكل (3)
الشكل 3. صور الممثل لايف / الميت الإسفار من مثقف كلوة-293 الخلايا على مدى 5 أيام. كانت مغلفة الخلايا في الفقرة (أ) PNIPAAm-ز-CS و (ب) PNIPAAm-ز-CS مع 50 ملغ / مل من الجينات المجهرية الدقيقة. كانت تزرع الخلايا أيضا في (C) أحادي الطبقة و (D) قتل مع الميثانول في PNIPAAm-ز-CS لتمثيل تحكم إيجابية وسلبية، على التوالي. كانت تجربة لايف / الميت جدوى تتكرر ثلاث مرات مع ثلاثة مكررات لكل تجربة. تمثل الحانات مقياس 100 ميكرون. كان المجهرية الدقيقة الجينات متوسط حجم 59.7 ± 14.9 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ftp_upload / 53704 / 53704fig4.jpg "/>
تم تقييم شخصية الجدوى 4. قصير الأجل من كلوة-293 الخلايا في PNIPAAm-ز-CS مع الجيني المجهرية الدقيقة. البقاء على قيد الحياة من مغلفة كلوة-293 الخلايا داخل PNIPAAm-ز-CS مع وبدون المجهرية الدقيقة الجينات ومقارنة باستخدام XTT بعد 5 أيام. وتم استخدام أحادي الطبقة الخلية والخلايا مغلفة في PNIPAAm-ز-CS قتل مع 70٪ الميثانول كما الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي. سواء أظهرت PNIPAAm-ز-CS وPNIPAAm-ز-CS مع المجهرية الدقيقة الجينات أي انخفاض معنوي (p> 0.05) في بقاء الخلية مقارنة أحادي الطبقة الخلية، ولكن أظهرت انخفاض معنوي (p <0.05) في بقاء الخلية مقارنة مع قتل الخلايا. إضافة المجهرية الدقيقة الجينات لا يضر بشكل كبير في بقاء الخلية من PNIPAAm-ز-CS (P> 0.05). تمثل أشرطة الخطأ محسوب فاصل الثقة 95٪ (ن = 3، وستة مكررات لكل تجربة). كان المجهرية الدقيقة الجينات متوسط ​​حجم 59.7 ± 14.9 ميكرون.المرجع = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك العديد من الخطوات الهامة في توليف مركب هيدروجيل-microparticle وتقييم قوتها لاصقة، وتورم القدرة، وتوافق مع الحياة الخلوية. بلمرة الجذور الحرة من PNIPAAm-ز-CS تتطلب methacrylation ناجحة من سلفات، والحل الكامل للمكونات مونومر، وظروف التفاعل خالية من الأكسجين. وقد تم اختيار نسبة NIPAAm مونومر لسلفات methacrylated في خليط التفاعل لأنه تم التدليل عليه، في عملنا السابق، لتوليد بوليمرات ذات خصائص ميكانيكية مشابهة لفقرات الأم القرص الأنسجة 29. وزيادة كمية سلفات في هيدروجيل لحد من فقدان الماء أثناء دبق، وبالتالي يقلل من تصلب الضغط من هلام. ومع ذلك، أثبتت درجة مختارة من methacrylation لإنتاج الهلاميات المائية مع خصائص معالجة مواتية لinjectability من خلال إبرة 18 G عندما يذوب في محلول مائي <سوب> 29. هناك درجة متزايدة من استبدال ميتاكريليت من CS سوف تزيد من كثافة تشعبي من شبكة البوليمر، مما تسبب في زيادة اللزوجة حل دون LCST والحد من هلام تورم القدرة. حققت الآخرين مناهج مختلفة في تجميع الهلاميات المائية PNIPAAm مثل نقل ذرة البلمرة الراديكالية (ATRP) 35 أو عكس بالإضافة-تجزئة نقل سلسلة (الطوافة) 36. وقد أدى البلمرة عبر ATRP لتطوير الضيقة، الهلاميات المائية polydisperse مع تغريمه الوزن الجزيئي ضبطها عن طريق تغيير مونومر لالبادئ النسبة. المجموعات الوظيفية يمكن المطعمة بطريقة تشبه المشط باستخدام الطوافة البلمرة، مما يؤثر التورط سلسلة البوليمر وفصل المرحلة.

ومتجانسة خليط الماء في النفط ضروري في خلق موحدة، المجهرية الدقيقة عبر ربط الجينات. تقنية مستحلب بسيطة لأداء ولا تتطلب استخدام المواد الكيميائية الخطرة، ولكن كلا micropaشكل وتوزيع rticle يصعب السيطرة عليها. حجم Microparticle يمكن تغييرها عن طريق زيادة سرعة ضجة مستحلب، وبالتالي خلق جسيمات أصغر والعكس بالعكس. في هذه الدراسة بالذات، وكان التحقيق الجينات حجم microparticle كخاصية المحتملة التي قد تؤثر تورم، والميكانيكا، أو الجدوى الخلوية. تشتت الضوء ويمكن أيضا أن تستخدم كبديل لقياس متوسط ​​حجم microparticle. سوف خصائص مستحلب أخرى مثل نوع السطحي وتركيز الجينات تؤثر حجم microparticle وتشكيل الكلي 37. خفض تركيز الجينات سوف يقلل من حجم microparticle، لكن المجاميع هي أكثر عرضة للتشكيل. والاختلافات في طبيعة المائية ومسعور السطحي يؤثر التوتر السطحي بين مراحل النفط والمياه، وبالتالي تغيير حجم القطيرات داخل مستحلب. قد بدلا من أن تنتج المجهرية الدقيقة الجينات باستخدام جهاز ميكروفلويديك، والذي يسمح لparticl موحدشكل الإلكترونية وتوزيع حجم الضيق 38. وتنطوي هذه التقنية تفريق مرحلة الجينات في مرحلة النفط المستمرة التي تتدفق من خلال قناة ويدخل حمام كلوريد الكالسيوم. رذاذ التنشيف هو أسلوب آخر التي تنتج المجهرية الدقيقة صغيرة جدا 39. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن الجينات قد تكون محملة البروتينات أو عوامل النمو ويمكن أن يكون عبر ربط مع الأيونات ثنائية التكافؤ الأخرى مثل الزنك أو الباريوم.

في هذا العمل، ونحن تميز نظام لاصق مع التطبيقات المحتملة في هندسة الأنسجة. يهدف لدينا اختبار الشد على وجه التحديد لقياس قوة لاصقة من المركب عندما تكون في اتصال مع الغضروف الخنازير. وقد تم اختيار هذا النوع من الركيزة لتقليد التصاق مركب هيدروجيل إلى لوحات نهاية غضروف القرص الفقرية. ركائز الأنسجة الأخرى، مثل الجلد الخنازير، يمكن أن تستخدم كبديل لقياس قوة لاصقة 40، ولكن نوع الأنسجة سوفتختلف اعتمادا على التطبيق المقصود. الحفاظ على التحكم في درجة الحرارة المناسبة للحمام المياه المالحة وما قبل التبريد المركبة قبل استخدامها تشكل عاملا حاسما في قياس بدقة الخواص الميكانيكية. وارتفاع درجات الحرارة حمام الماء فوق 37 درجة مئوية تسبب هيدروجيل أن يتقلص بسرعة وتشديد، في حين أن المركبات التي يتم اختبارها ميكانيكيا دون 37 درجة مئوية سوف يحمل انخفضت قوة الشد ويرجع ذلك إلى عدم وجود فصل المرحلة. حاليا، نحن نعمل على تطوير وسائل للتحقيق في قوة لاصقة القص من الصيغ المختلفة لاصقة طريق الحقن. وسيشمل العمل في المستقبل أداء المجراة سابقا الاختبارات الميكانيكية مع IVDs الخنازير لتحديد ما إذا كانت لاصقة يقاوم قذف من خلال عيب حلقي ويعيد وظيفة النشاط الحيوي للقطاع الحركة في العمود الفقري.

فوق 32 درجة مئوية، PNIPAAm-ز-CS ينكمش ويطرد الماء من مصفوفة هيدروجيل بسبب سلوك LCST من PNIPAAm، مما أدى إلى انخفاض أكثر من كتلةفترة 7 أيام في برنامج تلفزيوني (الشكل 2). على العكس من ذلك، إضافة المجهرية الدقيقة الجينات يضفي تأثير تورم ولاصقة زيادة كبيرة في كتلة (ع <0.05) في تركيز microparticle من 25 ملغ / م وحتى أكثر من ذلك في 50 ملغ / مل. في هذه الدراسة تورم، والتغيرات في الكتلة الرطبة للهيدروجيل من المرجح تعزى إلى تبادل المياه مع البيئة المحيطة، حيث تبين PNIPAAm-ز-CS أن تكون قابلة للتحلل بشكل انتقائي في وجود الانزيمات 29. كانت العديد من الخطوات بروتوكول المتقدمة لدراسة تورم تكييفها على أساس thermoreversibility من PNIPAAm-ز-CS. يجب أقراص هيدروجيل الانتقال بشكل كامل عند 37 درجة مئوية قبل إضافة حل قبل تحسنت برنامج تلفزيوني، وإلا فإن جل سوف تفريق. بعد تورم لمدة أسبوع واحد، يجب أن يكون الحل في برنامج تلفزيوني إزالتها بسرعة وبدقة من قارورة قبل تعود الهلاميات المائية مرة أخرى إلى حالة تشبه السائل. وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول تورم وصفها في هذه الورقة لا تحاكي تمامافي بيئة الجسم الحي من الخاص بالتحاليل المخبرية الأصلي. سوف خصائص تورم في سقالة في الجسم الحي تعتمد على الضغط الاسموزي للأنسجة المحيطة 41 والسلوك تدهور هلام. ومع ذلك، في العام، وزيادة القدرة تورم مع التأسيس microparticle الجينات تعتبر مواتية، لأنها سوف تساعد هيدروجيل حقن للبقاء الفضاء ملء في درجة حرارة الفسيولوجية. يمكن حساب الخصائص مثل تورم ونسبة المحتوى المائي مع قياسات الكتلة الجافة إضافية. وسوف تشمل مستقبل الدراسات تورم غمر أقراص هيدروجيل ضد البولي ايثيلين جلايكول (MW = 20000 جم / مول) الحمام، والتي سيتم تطبيقها على الضغط الاسموزي وتحاكي البيئة في الجسم الحي من الخاص بالتحاليل المخبرية.

وبصرف النظر عن الخواص الميكانيكية وتورم، ويجب على لاصق يحمل توافق مع الحياة الخلوية من أجل اعتبار سقالة مناسبة. وقد أظهرت دراسات سابقة بقاء encapsulaخلايا تيد في المواد الجينات 42،43 ومقرها PNIPAAm-44،45. النتائج من كل من المقايسات لايف / الميت وXTT تتفق مع هذه النتائج السابقة، مما يدل على بقاء الخلية المناسبة على مدى فترة من 5 أيام (الشكلان 3 و 4). أجرى مختبرنا أيضا التحقيقات الأولية للبقاء على دورة زمنية أطول (21 يوما)، ولاحظ سلوك مماثل. بشكل عام، وجود فائض من PNIPAAm-ز-CS والمجهرية الدقيقة يجب أن تكون على استعداد لحساب أي خسارة مادية أثناء نقل ماصة. مرة أخرى، فمن الأهمية بمكان للغاية في الحفاظ على الهندسة سقالة من خلال الحفاظ على درجات الحرارة المناسبة عند 37 درجة مئوية. إذا عادت شبكة سقالة من هلام إلى سائل يشبه الدولة، مرفق الخلية وقدرتها على البقاء قد تصبح خطر. وفيما يتعلق ايف / فحص الميت، سيترات الصوديوم يلعب دورا هاما في إزالة وتفكيك المجهرية الدقيقة الجينات. سيترات الصوديوم عكس العمل عبر ربط بين كالسيأم والجينات ويسبب الطين لتشكيل 46. يغسل إضافية مع برنامج تلفزيوني لإزالة PNIPAAm-ز-CS أو قد يتم تنفيذ الجينات لتحسين جودة الصور. خلال الفحص XTT، يتم إنشاء عينات البوليمر التي لا تحتوي على خلايا في لوحات جيدا. هذه مكررات تخدم المعايير كما فارغة ومطلوبة لحساب قيمة الامتصاصية دقيقة. تستند لدينا دراسات الجدوى الأولية بدقة على استخدام كلوة-293 الخلايا. في الدراسات المستقبلية، وسوف أثبت تمايز الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية المشتقة مغلفة (AD-MSC) إلى خلايا النواة اللبية. وقد تجلى AD-MSC التمايز نحو NP-تشبه النمط الظاهري باستخدام ضغط ديناميكي 47 و نقص الأكسجة 48،49.

وعموما، فإن لاصقة المقترح يوضح الوعد للتطبيقات هندسة الأنسجة في المناطق الحاملة، مثل القرص الفقري، حيث نجاح استراتيجية تجديد سيعتمد على قدرة سقالة إلى الدقةالمحكمة الخاصة العراقية خلع أثناء الحركة والتحميل. هذا النظام هو تنوعا للغاية لأنه من المحتمل أن يكون تكييفها لتطلق بروتينات المصفوفة خارج الخلية أو عوامل نمو معينة إلى التطبيق المطلوب. الأهم من ذلك أن الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تتكيف مع أي دراسة توصيف مع البوليمرات thermogelling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أن نعترف بامتنان المساعدة من الدكتورة جنيفر Kadlowec في تطوير لاصقة الشد اختبار البروتوكول.

وأيد البحث عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية والمعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية من المعاهد الوطنية للصحة تحت بجائزة عدد 1R15 AR 063920-01. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 116، هيدروجيل، bioadhesive وهندسة الأنسجة والهندسة الطبية الحيوية، سقالة، thermogelling، عن طريق الحقن
توليف Thermogelling بولي (N-isopropylacrylamide) المركبات كبريتات -graft-الكوندروتن مع الجيني المجهرية الدقيقة لهندسة الأنسجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christiani, T. R., Toomer, K.,… More

Christiani, T. R., Toomer, K., Sheehan, J., Nitzl, A., Branda, A., England, E., Graney, P., Iftode, C., Vernengo, A. J. Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (116), e53704, doi:10.3791/53704 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter