Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese av Thermogelling Poly (N-isopropylakrylamid) -graft-chondroitin sulfate Composites med Alginat Mikropartikler for Tissue Engineering

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

En injeksjon tissue engineering stillaset består av poly (N-isopropylakrylamid) -graft-chondroitin sulfate (PNIPAAm-g-CS) holdige alginat mikropartikler ble utarbeidet. Den klebestyrke, svellende egenskaper og in vitro biologisk forenelighetsmiddel er analysert i denne studien. De karakterisering teknikker utviklet her kan være aktuelt for andre thermogelling systemer.

Abstract

Injiserbare biomaterialer er definert som implanterbare materialer som kan innføres i legemet som en væske og stivner in situ. Slike materialer vil gi de kliniske fordelene ved å være implantert minimal invasiv og lett danner plass fylle faste stoffer i uvanlig form defekter. Injiserbare biomaterialer har vært mye undersøkt som stillas for tissue engineering. Imidlertid, for reparasjon av enkelte belastningsbærende områder i kroppen, slik som intervertebral skive, stillaser bør ha adhesive egenskaper. Dette vil redusere faren for forvridning under bevegelse og sikre intim kontakt med det omkringliggende vev og gir tilfredsstillende overføring av krefter. Her beskriver vi utarbeidelse og karakterisering av et stillas som består av termisk følsom poly (N-isopropylakrylamid) -graft-chondroitin sulfate (PNIPAAM-g-CS) og alginat mikropartikler. Den PNIPAAm-g-CS-kopolymer danner en viskøs oppløsning i vann ved romtemperatur, inn i hvilken alginate partikler er suspendert for å forbedre vedheft. Over den nedre kritiske oppløsningstemperatur (LCST), rundt 30 ° C, danner kopolymeren en fast gel rundt mikropartiklene. Vi har tilpasset standard biomaterialer karakterisering prosedyrer for å ta hensyn til den reversible faseovergangen fra PNIPAAm-g-CS. Resultatene viser at inkorporering av 50 eller 75 mg / ml alginat partikler til 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS løsninger firedoble den klebende strekkstyrke PNIPAAm-GCS alene (p <0,05). Inkorporering av alginat mikropartikler øker også vesentlig svelleevne av PNIPAAm-g-CS (p <0,05), bidrar til å opprettholde et romfyllende gel i løpet av vevsdefekter. Til slutt resultatene av in vitro analysesett toksikologi, 2,3-bis- (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) og levende / døde levedyktighet analyse indikerer at limet er i stand til å støtte overlevelse og spredning av innkapslet humane embryonale nyre (HEK) 293 calen over 5 dager.

Introduction

Injiserbare biomaterialer er de som kan være beleilig avgis til kroppen som en væske og stivner in situ. Slike materialer har blitt brukt mye i regenerativ medisin, hvor de brukes til å levere innkapslede celler til det berørte området 1-4 og fungere som et tredimensjonalt midlertidig ekstracellulære matrise for cellene 5. For pasienten, injiserbare biomaterialer er en fordel fordi de kirurgiske prosedyrer for implantasjon er minimal invasiv og den faste fasen kan fylle uregelmessig formet vev defekter, eliminerer behovet for tilpasset størrelse implantater.

Injiserbarhet kan oppnås gjennom en rekke mekanismer. Eksterne faktorer som pH, har blitt undersøkt som en utløser for dannelsen av gels som innkapsler celler og bioaktive molekyler 6-8. Men pH er kanskje ikke den mest praktiske trigger til å bruke i alle fysiologiske miljøer. En annen tradisjonell alternative for å oppnå injiserbarhet bruker in situ kjemisk polymerisering eller kryssbinding. En gruppe utviklet et vannoppløselig redokssystem bestående av ammonium persulfat og N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin og brukte den for omsetning av makromerer sammensatt av polyetylenglykol og poly (propylen) glykol 9,10. Zan et al. 11 utviklede injiserbare kitosan polyvinylalkohol nettverk tverrbundet med glutaraldehyd. I slike systemer må cytotoksisiteten av reaktive komponenter bli vurdert, spesielt for anvendelser som involverer celle innkapsling. Dessuten kan eksoterm polymerisasjon produsere høye nok temperaturer til å inngå kompromisser omkringliggende vev, som har blitt rapportert for polymerbeinsement 12,13.

Ytterligere andre injiserbare polymersystemer har blitt utviklet som oppviser en endring fra flytende til fast tilstand med temperatur som avtrekkeren. Kjent som thermogelling systemer, disse er aqueooss polymeroppløsninger som ikke krever kjemisk stimulus, monomerer, eller tverrbindingsmidler for å oppnå in situ-dannelse 14. Snarere en faseovergang som vanligvis oppstår i nærheten av fysiologisk temperatur induserer dannelsen av en fysisk kryssbundet tredimensjonalt nettverk. Poloksamerer slik som Pluronic F127 er blant de mest studerte polymerer for thermogelling medikamentavgivelse 15-17 og celle innkapsling 18,19. Det er imidlertid vel akseptert at disse gelene mangler stabilitet ved fysiologiske betingelser. Studier har vist økt stabilitet ved hjelp av kjedeforlengere 20 eller kjemiske crosslinkers 21,22. Ikke desto mindre, kan bruken av disse reagensene begrenser potensialet av materialet for celle innkapsling.

Poly (N-isopropylakrylamid) er et syntetisk thermogelling polymer som har fått betydelig oppmerksomhet i tissue engineering og levering av legemidler 14. Vandige oppløsninger av poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) viser en lavere kritisk løsning temperatur (LCST), er typisk rundt 32-34 ° C 23,24. Under LCST, hydrater vann PNIPAAm kjeder. Over overgangstemperaturen, blir polymeren hydrofobe, noe som resulterer i en dramatisk faseseparasjon 25-27 og dannelsen av en fast gel uten bruk av toksiske monomerer eller tverrbindere. Men PNIPAAm homo- utviser dårlige elastiske egenskaper og holde litt vann ved fysiologisk temperatur på grunn av hydrofobisitet 28. I dette arbeidet, velger vi å innlemme chondroitin sulfate kovalent inn i PNIPAAm nettverk, som gir mulighet for enzymatisk nedbrytning 29, anti-inflammatorisk aktivitet 30,31, og økt vann- og næringsopptak 32. PNIPAAm kopolymerer med CS ble fremstilt i vårt laboratorium ved å polymerisere monomeren NIPAAm i nærvær av metakrylat-funksjon CS under dannelse av podet kopolymer (PNIPAAm-g-CS). Because av lav tverrbindingstetthet av kopolymeren danner PNIPAAm-g-CS en viskøs løsning i vann ved RT og en elastisk gel ved fysiologisk temperatur på grunn av den LCST 29. Polymeroppløsningene blir flytbar igjen ved avkjøling under LCST på grunn av reversibilitet av overgangen.

Vi har vist at PNIPAAm-g-CS har potensial til å fungere som en vevsteknologi stillaset, på grunn av mekaniske egenskaper som kan tilpasses, nedbrytbarhet, og cytocompatibility med humane embryonale nyre (HEK) 293-celler 29. Men i visse belastningsbærende områder, slik som intervertebral platen, bør vevsteknologi stillaser har evnen til å danne en betydelig grensesnitt med omgivende vev skive for å eliminere faren for forvridning 33. Dette grensesnittet er også nødvendig for tilfredsstillende overføring av kraft over grenseflaten mellom implantatet og vevet 33. I vårt arbeid har vi suspendert enlginate mikropartikler i vandige oppløsninger av PNIPAAm-g-CS og funnet at gelering lokaliserer mikropartiklene, som gir adhesjon til omgivende vev 34. I denne artikkelen vil vi skissere fremgangsmåten for utarbeidelse av thermogelling, klebende polymer. Standard teknikker for biomaterialer karakterisering, celle avbildning og analyser med hensyn på levedyktighet ble tilpasset for å ta hensyn til temperaturfølsomheten av polymeren, og den er reversibel faseovergangen. Den injiserbare polymer er beskrevet i denne artikkelen har bred potensial for levering av legemidler og ingeniør vev søknader utenom de som er beskrevet i denne artikkelen. Videre kan karakteriseringsmetoder som er beskrevet her være anvendelig for andre thermogelling systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Poly (N-isopropylakrylamid) -g-chondroitin sulfat Synthesis

  1. Forut for syntesen av den bioadhesive hydrogel, rense N-isopropylakrylamid (NIPAAm) monomer og -metakrylat chondroitinsulfat (CS).
    1. Vei ut minst 10 g NIPAAm og oppløse monomeren i 400 ml n-heksan ved 60 ° C. Omrør beholderen periodisk inntil fullstendig oppløsning. Omkrystalliser oppløsningen i en -20 ° C fryser i 24 timer.
    2. Fjern det krystalliserte monomeren fra beholderen og vakuum-filter n-heksan ved anvendelse av en Buchner-trakt. Plasser monomeren i en vakuumovn ved romtemperatur i 24 timer for å fjerne eventuell gjenværende n-heksan. Lagre monomeren på en -20 ° C fryser for senere bruk (se trinn 1.2).
    3. Vei ut og oppløse 2,0 g av chondroitinsulfat i 8,0 ml deionisert vann. Forsiktig oppvarming av oppløsningen til 60 ° C.
    4. Juster pH til oppløsningen til 10 under anvendelse av ca. 10 til 40 ul 50% (vekt / vekt) NaOH.
    5. Legg 0,298 ml metakrylsyreanhydrid (MA). Tilbakeløp i 24 timer under omrøring ved 60 ° C.
    6. Hell 400 ml acetonløsning inn i en krukke og kjøle O / N i en -20 ° C fryser.
    7. Etter 24 timer er gått, langsomt helles hele methacrylated CS (MCS) løsning i 400 ml kald aceton, under omrøring med en magnetisk rørestav.
    8. Fjern MCS fra aceton og plassere bunnfallet i en vakuumovn. Utfør dette trinnet raskt for å opprettholde en intakt og sammenhengende tilstand for MCS. La resterende aceton for å fordampe under vakuum i minst 24 timer.
  2. Samtidig oppløses 10 g renset NIPAAm og 2,209 g MCS i 232 ml avionisert vann.
  3. Spyl oppløsningen av oksygen ved hjelp av inert nitrogengass. Opprettholde en sterk, men likevel lav gass-strømningshastighet for å hindre at oppløsningen fra bobler i 15 min.
  4. Fortsett spyling av løsningen med nitrogengass og tilsett 0,976 ml tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Deretter initiere polymerisasjonsreaksjonen ved å blande 97,6 mg ammoniumpersulfat (APS).
  6. Bland løsningen i omtrent 20 sekunder og raskt tette oppløsningen for å hindre luft fra å komme inn i beholderen. La løsningen å polymer under fluorescerende lys i 24 timer.
  7. Etter 24 timer, plasseres reaksjonsbeholderen inn i en 37 ° C ovn. Tillat den hydrogel til overgangen fra en væske til en gel-lignende tilstand. Senk polymeriserte hydrogel i 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) i totalt 7 dager for å tillate diffusjon av ureagert monomer ut av hydrogel.
  8. Ved hjelp av en saks, klippe hydrogel i flere små biter, ikke større enn 5 cm i diameter. For å forhindre at hydrogelen fra overgangen fra en gel-lignende tilstand til en væske, terninger polymeren i 37 ° C PBS-oppløsning. Overfør porsjoner i 50 ml koniske rør.
  9. Forberede prøver for frysetørking av innpakning toppenerørene med Kimwipes og gummistrikk. Fryse rørene ved -70 ° C i 1 til 2 timer.
  10. Plasser koniske rør på frysetørker for å fjerne alt vannet fra hydrogelen. Før drift, må frysetørker for å nå en temperatur og trykk på omtrent -40 ° C og 0,04 mbar, respektivt. Et minimum av 7 dager er nødvendig for fullstendig tørking.
  11. Puss frysetørket polymer til et fint pulver og oppbevar i en 4 ° C kjøleskapet for senere bruk (se trinn 3.1).

2. Kalsium-alginat Krysskoblede Mikropartikkel Synthesis

  1. Fremstille en 2% (vekt / volum) alginat oppløsning ved å oppløse 400 mg i 20 ml avionisert vann. Oppvarm løsningen til omtrent 60 ° C for å lette oppløsning.
  2. Fremstille en 2% (vekt / volum) kalsiumklorid-løsning ved å tilsette 400 mg til 20 ml avionisert vann.
  3. Skape en olje i vann-blanding ved å kombinere 100 ml rapsolje, 1,0 ml Tween 20, og 20 ml2% (vekt / volum) alginat. Emulgering av blandingen i 10 minutter med en homogenisator ved 15 000 rpm. I tillegg, blande med en magnetisk rørestav ved 200 rpm og 2000 rpm for å skape store eller små mikropartikler, respektivt.
  4. Aspirer 2% (vekt / volum) kalsiumklorid-løsning ved anvendelse av en sprøyte med en 18 G nål spiss. Tilsett langsomt kalsiumkloridet dråpevis i emulsjonen.
  5. Når 20 ml kalsiumklorid er oppbrukt, at mikropartiklene i emulsjonen til å tverrbinde i 10 min.
  6. Fordele sats av mikropartikler inn i avkortet 50 ml konisk rør og sentrifuge til en kraft på 1400 x g i 2 min for å fjerne det første lag av rapsolje.
  7. Fortløpende vask, vortex, og sentrifuger mikropartiklene med isopropanol totalt tre ganger ved 1400 g i 2 min for å fjerne eventuelle rester av rapsolje. Kast isopropanol supernatanten etter hvert sentrifugeringstrinn og vask med frisk isopropanol.
  8. Når oil er fjernet, gjenta vaskeprosedyren ytterligere tre ganger med deionisert vann for å fjerne eventuelt gjenværende isopropanol. Kast deionisert vann supernatanten etter hvert sentrifugeringstrinn og vaskes med friskt deionisert vann. Fjern ca 100 mg av våte mikropartikler og butikk i hetteglass. De våte mikropartiklene vil bli brukt til å måle den midlere diameter av satsen ved lysmikroskopi.
    1. Ved hjelp av lysmikroskopi, dispergere et lite utvalg av våte mikropartikler i avionisert vann på et objektglass. Avhengig av størrelsen av mikropartiklene ved å bruke en 10X eller 20X objektiv, og justere den numeriske blenderåpningen til at partiklene kommer i fokus. Pass på at mikroskopet er kalibrert for korrekt objektiv og justere lysstyrken på lyskilden etter behov. Bruke en linje verktøy for å måle den lengste diameter på 50 tilfeldig alginat mikropartiklene og få en gjennomsnittlig størrelse for batchen.
  9. Forbered mikropartikler for frysetørking by innpakning dem med Kimwipes og sikre dem med gummistrikk. Fryse mikropartiklene ved -70 ° C i 1 time.
  10. Plasser mikropartiklene på frysetørkeapparatet og tillate prøven å tørke i minst 24 timer. Grind fryse tørkede mikropartikler til et fint pulver med en morter og lagre i en 4 ° C kjøleskapet for senere bruk (se trinn 3.3).

3. Utarbeidelse av Lim

  1. Ved hjelp av det frysetørkede polymerpulver, skape en 5% (vekt / volum) PNIPAAm-g-CS-løsning ved å oppløse 50 mg av hydrogel pulver i 1 ml av 1 x PBS.
  2. Bland løsningen ved hjelp av en vortex og chill i et kjøleskap ved 4 ° C i 24 timer.
  3. Når viskøs oppløsning former, skape et homogent sammensatt ved å legge til 25 eller 50 mg frysetørket alginat mikropartikler til hydrogel løsning og virvle. Oppbevar kompositt i kjøleskap ved 4 ° C for senere bruk (se trinn 4.3 og 4.8).

4. bioadhesiv Mechanical strekkprøver

  1. Før du utfører strekkprøver, trekke brusk substrat fra et svin øre.
    1. Avrime porcine øre i en varm 0,9% (w / v) NaCl-løsning; Dette vil bidra til å løsne vev.
    2. Ved hjelp av en skalpell, isolere og seksjon av et flatt, rektangulært område ved å kutte vertikalt om epidermal lag, underhud, og brusk. Unngå å kutte buede rygger av svin øret.
    3. Separer den epidermale lag av huden fra brusk ved å skjære parallelle gjennom det subkutane vevet. Brusken er en hard, hvit vev som finnes under svinehud.
    4. Skrap forsiktig subkutant vev som er festet til brusk med den side av skalpellen. Unngå å skjære inn i bruskvevet med skalpellblad.
    5. Sikre at bare den ene side av brusk er utsatt for og i løpet av flate strekkprøving. Hvis det er nødvendig, flate brusk ved å kutte av den ujevne huden på undersiden.
    6. Skjær bruskvevet i flere stykker med dimensjoner på 1 cm x 1 cm. Oppbevar bruskvevet i koniske rør fylt med 0,9% (w / v) NaCl-oppløsning i en -20 ° C fryser.
  2. Forbered 2,0 liter 0,9% (vekt / vol) NaCl oppløsning. Forvarm saltoppløsning til 37 ° C. Temperaturen av denne løsningen må opprettholdes gjennom hele testingen.
  3. Tine den frosne brusk. Hold både svin brusk og hydrogel prøvene i en Styrofoam beholder med kjøleelementer.
  4. Fest kraftmåler til armen av teststativet. Plasser en varmeplate på toppen av kraft stativet og temperatur til 50 ° C.
  5. Påføre en 1 cm x 1 cm bit av brusken til det rustfrie stålblokk med cyanoakrylatlim og en pinsett. Lim en ekstra bit av brusk til Delrin sylinder og fest sylinderen til kraftmåler. Det er meget viktig at begge bruskflater vender mot hverandre og kontakt med hydrogel.
  6. PlassPlexiglas vannbad på toppen av den varme plate og sett rustfri stålblokk med brusk substratet inne i badekaret.
  7. Senk armen på test stå og justere både brusk underlag med hverandre. Hev armen og la nok plass til å bruke hydrogel.
  8. Med en positiv fortrengnings pipette, dispensere 200 ul av den bioadhesive hydrogel til den nederste del av brusk.
  9. Senk arm av kraften stand på 1 mm / min inntil hydrogelen i kontakt med den øvre stykke av brusk og utøver en forspenningskraft på 0,001 N.
  10. Hell 37 ° C saltoppløsning i badet inntil volumet har nådd den angitte vann-nivå. Kontroller temperaturen av løsningen med et termoelement.
  11. Tillat den hydrogel til å stille inn for en total av 5 minutter. Når gelen har stivnet, løfte armen ved en hastighet på 2 mm / min. Testen avsluttes når den bioadhesive løsner fra brusk substrat eller når et betydelig fall i styrke inntreffer,signaliserer svikt.
  12. Samle de registrerte data og heve armen av test stand. Fjern det Delrin sylinderen fra den kraftmåler. Hell saltløsning inn i den tidligere beholder, og oppvarmer til 37 ° C.
  13. Beregn påkjenninger ved å subtrahere den kraft som utøves av polymeren fra oppdriftskraften av en "blank", det Delrin feste uten brusk eller klebemiddel, hevet i samme takt, og dividere med hefteområde.

5. Hevelse Study of PNIPAAm-g-CS med Alginat Mikropartikler

  1. Forbered rene glassflasker og merke dem på riktig måte med et tidspunkt, prøvetype og prøvenummer. Klebemidlene kan også opprettes, som tidligere beskrevet. Forbered totalt fem prøver (n = 5) for hver prøvetype per tidspunkt.
  2. Pre-veie alle hetteglass og spille inn sin første masse ved RT.
  3. Ved hjelp av en sprøyte, dispensere omtrent 0,4 ml av den preparerte prøven klebemiddel inn i hver av de fem ampuller.Gjenta dette trinnet for hver prøvetype på tvers av alle testede tidspunkter.
  4. Vei og ta opp massen av hvert hetteglass med limet prøvetypen ved RT.
  5. Forvarme en inkubator og 1 liter 1 x PBS-oppløsning på 37 ° C.
  6. Organiser alle hetteglassene på rist og sett kurven i kuvøse. Tillat klebemidlene til overgangen fra en væske til en gel i omtrent 5 til 10 min.
  7. Legg 5,0 ml av 1 x PBS til hver ampulle. Pass på å nøye legge PBS løsning langs siden av hetteglasset for å hindre at hydrogel platen fra å bryte fra hverandre.
  8. Cap hver ampulle for å forhindre fordamping av PBS-oppløsning, og holde den indre temperaturen i inkubator ved 37 ° C. Hvert sett av hydrogel-plater vil trenge å være neddykket i PBS i en angitt tidsperiode.
  9. Når en 7 dagers tidspunkt er nådd, korken sett av ampuller og fjerne den PBS-oppløsning fra hvert hetteglass. Veie hvert hetteglass med limet prøven igjen ved RT.
<p class = "jove_title"> 6. Kvalitativ Cell Livskraftig Bruke en Live / Død analyse

  1. Før du utfører Live / Døde analysen med PNIPAAm-g-CS, vokse humane embryonale nyre 293 celler (HEK-293) til 80% samløpet.
    1. Hurtig-tine frosne HEK-293 cellesuspensjon ved å plassere kryoampulle i et 37 ° C vannbad, deretter sentrifuger cellene ved 400 xg ved 4 ° C i 5 minutter i et 15 ml konisk rør.
    2. For å gjøre den første passasjen cellevekstmedium, kombineres i høy glukose (4,5 g / l) Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) til en sluttkonsentrasjon på 20% og 100x penicillin-streptomycin-løsning ( pen-strep) til en sluttkonsentrasjon på 100 IU / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. For alle andre partier, bytte til DMEM med 10% FBS og 1x penn-streptokokker.
    3. Cellepelleten suspenderes i 10 ml vekstmedium og overfører suspensjonen inn i en 100 mm diameter petriskål. jevnt distribute cellene ved å forsiktig vippe rett forfra og bakover og venstre til høyre et par ganger hver retning.
    4. Kultur ble cellene i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Om nødvendig, endre medium annenhver dag.
    5. Når cellene nå 80% konfluens gjenskape kulturen i flere retter. Fjern mediet fra platen.
    6. Tilsett 1 ml av 0,5% trypsin til platen. Tillate at platene inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Sjekk for å se om cellene løsner fra overflaten ved forsiktig å svinge platen.
    7. For å dele kulturen 01:10, tilsett 9 ml vanlig vekstmedium (DMEM med 10% FBS) til trypsinert celler og forsiktig bland ved å vippe fatet.
    8. Dispensere 1 ml av den fortynnede cellesuspensjon i hver ny form og legg i 9 ml vekstmedium. Bland forsiktig ved å vippe fatet.
    9. Kultur ble cellene i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Hvis det er nødvendig, endrer mediet noensinney to dager til cellene når 80% samløpet.
  2. Fjern materialet fra to kultur retter vokst til 80% samløpet.
  3. Tilsett 1 ml av 0,5% trypsin til hver plate. Tillate at platene inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Sjekk for å se om cellene løsner fra overflaten ved forsiktig å svinge platen.
  4. Vask HEK-293-celler på plate med 3 ml vekstmedium to ganger, og legge til begge suspensjoner til den samme 15 ml koniske rør.
  5. Sentrifuger 15 ml konisk rør i 10 minutter ved 400 xg ved 4 ° C.
  6. Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i 3 ml medium ved å pipettere opp og ned.
  7. Pipetter 10 ul av cellesuspensjonen inn i et hemocytometer og utføre en celletelling for å bestemme den celletetthet. Øke suspensjonsvolumet medium hvis den opprinnelige cellekonsentrasjonen er for høy, og omvendt redusere volumet dersom konsentrasjonen er for lav, for å bevare et mål concentrasjon av 1 x 10 6 celler / ml. Sentrifuger HEK-293-celler ved 400 xg og cellepelleten suspenderes i det korrigerte volum av mediet deretter.
  8. Forsiktig vortex cellesuspensjonen og fordele cellen blandingen i fire separate 15 ml koniske rør for følgende prøvebetingelser: positiv kontroll monolags, negativ drept kontroll i PNIPAAm-g-CS ved bruk av 70% (v / v) metanol, HEK-293 celler innkapslet i PNIPAAm-g-CS og HEK-293 celler innkapslet i PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler.
  9. Lage positive kontroll monolag ved pipettering multippel 300 pl volumer av cellen blandingen inn i en 24-brønners plate for å generere 4-6 gjentatte prøver.
  10. Fjern materialet fra de koniske rør knyttet til drept kontroll, PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler.
    1. Sentrifuger koniske rør i 5 minutter ved 400 x g og fjern supernatanten.
    2. Opprettholde den samme cellekonsentrasjon ved resuspendering i calen i det samme volum av PNIPAAm-g-CS som fjernes media. Pipetter polymer cellen blanding opp og ned ved hjelp av en serologisk pipette inntil homogen.
      1. Ved poding med alginat mikropartikler, overføres PNIPAAm-g-CS-cellesuspensjon (fremstilt som beskrevet for 6.10.2) inn i en 35 mm kulturskål og introdusere partiklene inn i blandingen. Pipetter celle blanding opp og ned ved hjelp av en serologisk pipette inntil homogen.
    3. Ved hjelp av serologisk pipette, dispensere flere 300 ul av polymeren celle blandingen inn i hver av brønnene for drept kontroll, PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler for å generere 4 - 6 replikate prøver.
  11. Inkuber platen ved 37 ° C i 10 til 15 minutter og lar den PNIPAAm-g-CS for å gå over fra en væske til en gel (polymeren danner en opak, hvit plate).
  12. Plasser et lysbilde varmere i panseret og sett temperaturen til 37 ° C. Bruk glide varmere for å opprettholde godt platetemperatur og pipette 600 mL av forvarmes media i hver brønn. For ytterligere å hindre overgangen av polymeren til en flytende tilstand ved å plassere en lampe med en fluorescerende pære over fatet for å varme opp luften over den.
  13. Cellene inkuberes i 5 dager ved 37 ° C med 5% CO2.
  14. Etter fem dager har gått, forberede Live / Døde fargestoff miks ved hjelp ethidium homodimer (EthD-1) og calcein AM. Begge stoffene er lysfølsomme og fremstilt på bruksdagen.
    1. Avrime calcein AM og EthD-en fra settet på RT.
    2. Tilsett 5 ml sterilt 1x PBS til en konisk rør og pakk den inn i aluminiumsfolie.
    3. Legg 6,67 mL av 2 mM EthD-en til den koniske tube. Vortex løsningen blandingen grundig.
    4. Deretter legger 2,5 mL av 4 mM calcein AM til konisk tube. Vortex blandingen grundig.
  15. Fjern media fra brønnene på monolaget (positiv kontroll), PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS viddh alginat mikropartikler. Vask alle brønnene grundig, men forsiktig, med PBS og fjern PBS.
  16. La hydrogel-plater inneholdende alginat mikropartikler til flytende ved romtemperatur og tilsett 2 ml av 50 mM natriumcitrat til hver av brønnene.
  17. Fjern materialet fra de drepte celle brønner (negativ kontroll). La hydrogel-plater for å bli flytende ved romtemperatur og tilsett 300 ul 70% (v / v) methanol til hver brønn.
  18. Platen inkuberes i 45 minutter ved 37 ° C.
  19. Fjern det natriumcitrat og metanolløsninger fra brønnene og pipetter hver av de hydrogel-suspensjoner i individuelle mikrosentrifugerør. Sentrifuger rørene ved 2000 x g i 10 min for å separere cellene fra hydrogel suspensjon.
  20. fjerne suspensjonen forsiktig ved å pipettere løsningen fra det koniske rør og etterlater cellepelleten. Resuspender pelleten i 300 ul PBS og overfør til den opprinnelige brønn plate.
  21. Tilsett 300 ul av tHan Live / Død dye mix til hver av brønnene. Vikle brønns plate i aluminiumsfolie og inkuberes i 45 min på en vippe ved RT.
  22. Bilde alle prøvene i henhold til en omvendt fluorescens mikroskop med en 10X objektiv. Levende celler og døde celler viser en grønn og rød fluorescens, respektivt.

7. Kvantitativ Cell Livskraftig Bruke en XTT analysen

  1. Grow HEK-293 celler i 80% samløpet. Fjern vekstmedier fra to kultur retter.
  2. Tilsett 1 ml av 0,5% trypsin til hver plate. Tillate at platene inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Sjekk for å se om cellene løsner fra overflaten ved forsiktig å svinge platen.
  3. Vask HEK-293-celler på plate med 3 ml av media to ganger, og legge til begge suspensjoner til den samme 15 ml koniske rør.
  4. Sentrifuger 15 ml konisk rør i 10 minutter ved 400 xg ved 4 ° C.
  5. Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i 3 ml mediaved å pipettere opp og ned.
  6. Pipetter 10 ul av cellesuspensjonen inn i et hemocytometer og utføre en celletelling for å bestemme den celletetthet. Som tidligere beskrevet, bevare en mål-konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml. Sentrifuger HEK-293-celler ved 400 xg og cellepelleten suspenderes i det korrigerte volum av mediet deretter.
  7. Forsiktig vortex cellesuspensjonen og fordele cellen blandingen i fire separate 15 ml koniske rør for følgende prøvebetingelser: positiv kontroll monolags, negativ drept kontroll i PNIPAAm-g-CS ved bruk av 70% (v / v) metanol, HEK-293 celler innkapslet i PNIPAAm-g-CS og HEK-293 celler innkapslet i PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler.
  8. Lage positive kontroll monolag ved pipettering av 300 ul av celleblandingen inn i en 24-brønners plate for å generere 4 - 6 replikate prøver.
  9. Fjern materialet fra de koniske rør knyttet til drept kontroll, PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler.
    1. Sentrifuger koniske rør i 5 min ved 400 x g og fjern supernatanten.
    2. Opprettholde den samme cellekonsentrasjon ved resuspendering av cellene i det samme volum av PNIPAAm-g-CS som fjernes media. Pipetter celle blanding opp og ned ved hjelp av en serologisk pipette inntil homogen.
      1. Ved poding med alginat mikropartikler, overføres PNIPAAm-g-CS-cellesuspensjonen inn i en 35 mm kulturskål og introdusere partiklene inn i blandingen. Pipetter celle blanding opp og ned ved hjelp av en serologisk pipette inntil homogen.
    3. Ved hjelp av serologisk pipette, dispensere 300 ul av polymeren celle blandingen inn i hver av brønnene for drept kontroll, PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler for å generere 4 - 6 replikate prøver.
  10. Når alle de celleholdige prøver har blitt tilsatt til 24-brønns plate, dispensere flere 300 ul volumer av PNIPAAm-g-CS og PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler uten celler i tilstøtende brønner for å generere 4 - 6 replikere prøver.
  11. Inkuber 24-brønners plate ved 37 ° C i 10 til 15 minutter og lar den PNIPAAm-g-CS for å gå over fra en væske til en gel (polymeren danner en opak, hvit plate).
  12. Plasser et lysbilde varmere i panseret og sett temperaturen til 37 ° C. Bruk glide varmere for å opprettholde brønnplate temperatur og pipette 600 mL av forvarmes klar DMEM i hver brønn. For ytterligere å hindre overgangen av polymeren til en flytende tilstand ved å plassere en lampe med en fluorescerende pære over fatet for å varme opp luften over den.
  13. Cellene inkuberes i 5 dager ved 37 ° C ved 5% CO2.
  14. Etter fem dager har forløpt, fremstille 2,3-bis- (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) reagens fra produsent. Den XTT reagens er lyssensitiv og forberedt på dagen for bruk.
    1. Fjern den gule flasken inneholdering XTT pulver fra kjøleskapet. Ved hjelp av en steril sprøyte og nål, injisere 5 ml klar DMEM (uten fenolrødt) gjennom gummiskillevegg inn i gul flaske.
    2. Varm opp reagens til 56 ° C i et vannbad i 10 minutter eller inntil oppløsning.
    3. Ytterligere fortynne XTT-reagens til 20% (volum / volum) i et 15 ml konisk rør innpakket i aluminiumsfolie. Delmengde overflødig XTT reagens i Mikrosentrifugerør og plassere dem i -20 ° C fryser for langtidslagring.
  15. Fjern materialet fra de drepte celle brønner (negativ kontroll) og tilsett 300 ul 70% (v / v) metanol til hver brønn. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C og fjerne metanolen fra brønnene.
  16. Fjern materialet fra de resterende brønnene i monolaget (positiv kontroll), PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler. Vask alle brønnene grundig, men forsiktig, med PBS og deretter fjerne PBS.
  17. Tilsett 300 ul av 20% XTT-reagens til hver av brønnene. Vikle 24-brønners plate i aluminiumsfolie og inkuberes i 24 timer på en vippe ved RT.
  18. Etter 24 timer, tilsett 200 ul av 50 mM natriumcitrat til alle brønnene og inkuber på vippe for en ytterligere time.
  19. Overføre alle de polymersuspensjoner til mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 2000 xg i 10 min ved RT.
  20. Overfør 200 ul av supernatanten fra hver mikrosentrifugerør til en 96-brønns plate. Ved hjelp av en mikrotiterplateleser, innhente spesifikke absorbans-avlesninger ved 450 nm og ikke-spesifikke absorbans-avlesninger ved 690 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et termisk reagerende podet ko-polymer ble med hell syntetisert og karakterisert for dets bioadhesiv styrke, svellende egenskaper, og in vitro cytocompatibility. Vi valgte å undersøke alginat grunn av sine veletablerte mukoadhesive egenskaper. Alginat mikropartikler, med en gjennomsnittlig diameter på 59,7 ± 14,9 nm, ble blandet med 5% (vekt / volum) PNIPAAm-g-CS i konsentrasjoner på 25, 50, og 75 mg / ml. Disse konsentrasjonene var basert på en-halv, lik, og to ganger den ekvivalente tørrvekten av PNIPAAm-g-CS i vandig oppløsning. Mikropartikkel konsentrasjoner over 75 mg / ml, oppviste høy viskositet, og ble ikke undersøkt. Den maksimale strekkklebestyrke på 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS med varierende konsentrasjoner av alginat mikropartikler ble sammenlignet med den hydrogel alene. Tilsetningen av 50 eller 75 mg / ml av alginat mikropartikler suspendert i 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS resulterte i en fire-gangers increase i strekkfasthet (p <0,05), som vist i figur 1. En mikropartikkel konsentrasjon på 25 mg / ml viste ikke en signifikant økning i strekkfasthet sammenlignet med 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). Det var ingen signifikant endring i strekkfastheten til 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS når konsentrasjonen av alginat mikropartikler ble øket fra 50 til 75 mg / ml (p> 0,05).

De svellende egenskaper av den bioadhesive hydrogel ble karakterisert ved neddykking av forskjellige formuleringer i PBS ved 37 ° C. Alginat mikropartikkelkonsentrasjoner på 25 og 50 mg / ml ble testet for å identifisere eventuelle forskjeller i hevelse oppførsel. Alginat mikropartikler ble målt ved bruk av lys-mikroskopi, og hadde en gjennomsnittlig diameter på 25,0 ± 14,4 nm. Etter 7 dager ble de innledende og slutt våte massen av de hydrogel-plater som var tatt opp, og en endring i masse beregnet for flere prøver pr klebende substans,n (n = 5). Figur 2 viser en drastisk forskjell i endringen i masse blant alle formuleringer. Klebemidler som inneholder både 25 og 50 mg / ml av alginat mikropartikler viste positive endringer i massen, mens 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS gått ned i massen. Alle prøvene ble funnet å være signifikant forskjellige fra hverandre (p <0,05) med klebemiddelinneholdende 50 mg / ml av alginat mikropartikler som viser størst svellende virkning.

Den biokompatibilitet av den foreslåtte klebemiddel ble undersøkt både kvalitativt og kvantitativt ved bruk av en levende / død og XTT cytotoksisitet assay. HEK-293-celler ble innkapslet både i 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS og 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS inneholdende 50 mg / ml av alginat mikropartikler med en gjennomsnittlig diameter på 59,7 ± 14,9 um . Et monolag av celler og innkapslede celler i PNIPAAm-g-CS drept med 70% metanol ble ansett som positive og negative kontroller, respektivt. Formuleringer sådd med celler ble karakterisert etter 5 dagers vekst i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Hver test indikerte god celle levedyktighet for både PNIPAAm-g-CS og PNIPAAm-g-CS med mikropartikler. Bilder fra Figur 3 illustrerer levende celler som fluorescerer grønn i begge klebemiddelblandinger (panelene A og B) og cellemonolaget, som tjener som positiv kontroll (felt C). Drepte celler (panel D) fluorescerer en rød farge og viser celledød. Resultatene fra XTT cytotoksisitetstester bekreftet resultatene av Live / Døde analysen. Den relative cellelevedyktigheten av klebemiddelinneholdende 50 mg / ml av mikropartiklene ble redusert 1,3 ganger sammenlignet med PNIPAAm-g-CS som illustrert i figur 4, men nedgangen var imidlertid ikke statistisk signifikant (p> 0,05). Både PNIPAAM-g-CS og PNIPAAM-g-CS med mikropartikler hadde også sammenlign levedyktighet til cellemonolaget (p> 0,05). Innkapslede celler i hydrogel formuleringer og cellemonolaget ble funnet å være vesentlig forskjellig sammenlignet med den negative kontroll (p <0,05). Samlet disse resultatene tyder på at klebemiddelet inneholdende mikropartikler som ikke bare oppviser øket klebekraft, men god biokompatibilitet også.

Figur 1
Figur 1. Påvirkning av strekkfasthet Etter Innlemming varierende konsentrasjoner av Alginat Mikropartikler i 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS. Strekkfastheten til PNIPAAm-g-CS firedoblet med tilsetning av 50 eller 75 mg / ml av alginat mikropartikler (p <0,5). Feilfelt representerer en beregnet 95% konfidensintervall (n = 5). Alginat mikropartikler hadde en gjennomsnittlig størrelse på 59,7 ± 14,9 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Effekt av varierende konsentrasjoner av Alginate Mikropartikler på svellekapasiteten av 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS. Etter 7 dagers neddykking i 37 ° C PBS, redusert PNIPAAm-g-CS i våt masse på grunn de hydrofobe egenskapene PNIPAAm over LCST. PNIPAAm-g-CS med 25 eller 50 mg / ml alginat mikropartikler utstilt hevelse evne. Ved å øke konsentrasjonen av mikropartikler betydelig høyere (p <0,05) endringen i massen av hydrogelen i løpet av 7 dager, tilskrives vannopptak. Feilfelt representerer en beregnet 95% konfidensintervall. Alginat mikropartikler hadde en gjennomsnittlig størrelse på 25,0 ± 14,4 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

gether.within-page = "1"> Figur 3
Figur 3. Representant Levende / Døde fluorescens bilder av Kultur HEK-293 celler over en periode på 5 dager. Cellene ble innkapslet i (A) PNIPAAm-g-CS og (B) PNIPAAm-g-CS med 50 mg / ml alginat mikropartikler. Celler ble også dyrket i et (C) monolaget, og (D) drepes med metanol i PNIPAAm-g-CS for å representere en positiv og negativ kontroll, respektivt. Live / Død levedyktighet Forsøket ble gjentatt tre ganger med tre gjentak per eksperiment. Skala barer representerer 100 mikrometer. Alginat mikropartikler hadde en gjennomsnittlig størrelse på 59,7 ± 14,9 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ftp_upload / 53704 / 53704fig4.jpg "/>
Figur 4. Kortsiktige Livskraftig av HEK-293 celler i PNIPAAm-g-CS med Alginat Mikropartikler. Survival of innkapslede HEK-293 celler i PNIPAAm-g-CS med og uten alginat mikropartikler ble vurdert og sammenlignet ved hjelp av XTT etter 5 dager. En cellemonolaget og innkapslede celler i PNIPAAm-g-CS drept med 70% metanol ble anvendt som positive og negative kontroller, respektivt. Både PNIPAAm-g-CS og PNIPAAm-g-CS med alginat mikropartikler viste ingen signifikant reduksjon (p> 0,05) i celleviabilitet i forhold til cellemonolaget, men viste en signifikant reduksjon (p <0,05) i celleviabilitet i forhold til den drepte celler. Tilsetningen av alginat mikropartiklene ikke i betydelig grad svekke cellelevedyktighet PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). Feilfelt representerer en beregnet 95% konfidensintervall (n = 3, seks replikater per eksperiment). Alginat mikropartikler hadde en gjennomsnittlig størrelse på 59,7 ± 14,9 nm.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere viktige skritt i å syntetisere den hydrogel-mikropartikkel kompositt og evaluere sin klebekraft, hevelse evne, og mobilnettet biokompatibilitet. Fri radikal polymerisasjon av PNIPAAm-g-CS krever vellykket methacrylation av chondroitinsulfat, fullstendig oppløsning av monomerkomponenter, og oksygenfrie reaksjonsbetingelser. Forholdet av monomer til NIPAAm methacrylated chondroitin sulfat i reaksjonsblandingen ble valgt fordi det er blitt vist, i vårt tidligere arbeid, for å danne kopolymerer med mekaniske egenskaper som ligner på naturlig intervertebral skive vev 29. Økning av mengden av chondroitinsulfat i hydrogelen, vil redusere vanntapet under gelering og således redusere trykk stivheten av gelen. Den valgte Graden av methacrylation er også blitt vist å frem hydrogeler med gunstige håndteringsegenskaper for injiserbarheten gjennom en 18 G nål når det er oppløst i vandig oppløsning <sup> 29. En økt grad av metakrylat substitusjon av CS vil øke tverrbindingsdensitet av polymernettverket, forårsaker økt oppløsningsviskositet under LCST og reduserende gel svelleevne. Andre har undersøkt ulike tilnærminger i å syntetisere PNIPAAm hydrogeler som atom overføring radikal polymerisasjon (ATRP) 35 eller omvendt tillegg-fragmentering kjedeoverføring (RAFT) 36. Polymerisering via ATRP har ført til utvikling av smale, polydisperse hydrogeler med bøte avstemt molekylvekt ved å forandre monomer til initiator-forholdet. Funksjonelle grupper kan være podet på en kam-lignende måte ved anvendelse av RAFT polymeriseringen, og dermed påvirker polymerkjedesammenfiltring og fase-separasjon.

En homogen vann-i-olje-blanding er det nødvendig å skape ensartet, tverrbundne mikropartikler alginat. En emulsjon teknikken er enkel å utføre og krever ikke bruk av farlige kjemikalier, men begge micropartikkel form og distribusjon er vanskelig å kontrollere. Mikropartikkelstørrelsen kan endres ved å øke emulsjonens rørehastigheten, og dermed skape mindre partikler og vice-versa. I denne studien ble alginat mikropartikkel størrelse undersøkt som en potensiell eiendom som kan påvirke hevelse, mekanikk, eller mobilnettet levedyktighet. Lysspredning kan også brukes som et alternativ til måling av den gjennomsnittlige mikropartikkel-størrelse. Andre emulsjon egenskaper som det overflateaktive middel typen og alginat konsentrasjonen vil påvirke mikropartikkelstørrelse og aggregatdannelse 37. Reduksjon av alginat konsentrasjonen vil redusere mikropartikkel-størrelse, men aggregatene er mer sannsynlig å danne. Variasjoner i den hydrofile og hydrofobe natur av overflateaktive midler vil påvirke grenseflatespenningen mellom olje- og vannfasen, og dermed å endre dråpestørrelsen i emulsjonen. Alginat mikropartikler kan alternativt fremstilles ved anvendelse av en mikrofluidteknisk anordning, som gjør det mulig for jevn partikkele form og snever størrelsesfordeling 38. Denne teknikk innebærer dispergering av et alginat fase i en kontinuerlig oljefase som strømmer gjennom en kanal og går inn i en kalsiumklorid-bad. Spray draying er en annen teknikk som gir svært små mikropartikler 39. Det er også viktig å merke seg at alginat kan være lastet med proteiner eller vekstfaktorer, og kan være tverrbundet med andre toverdige ioner så som sink eller barium.

I dette arbeidet, karakteriserer vi et lim system med potensielle bruksområder i tissue engineering. Vår strekk-test tar sikte på spesielt å kvantifisere klebe styrken av kompositten når den er i kontakt med svine-brusk. Denne type av substrat ble valgt for å etterligne adhesjon av hydrogel kompositten til brusk endeplater av mellomvirvelskiven. Andre vev underlag, som svinehud, kan anvendes som et alternativ for å kvantifisere styrken av et klebemiddel 40, men den vevstype vilvariere, avhengig av den påtenkte anvendelse. Opprettholde riktig temperatur kontroll av salt vannbad og forkjøling kompositten før bruk er avgjørende i nøyaktig måling av de mekaniske egenskaper. Forhøyede vann bad temperaturer over 37 ° C vil føre til at hydrogelen til raskt å krympe og stivne, mens kompositter som er mekanisk testet under 37 ° C vil oppvise redusert strekkstyrke på grunn av mangel på fase-separasjon. Vi er for tiden å utvikle metoder for å undersøke skjær limstyrke av ulike injiserbare lim formuleringer. Fremtidig arbeid vil omfatte å utføre ex vivo mekaniske tester med svin IVDs for å bestemme om klebemidlet motstår ekstrudering gjennom en ringformet defekten og gjenoppretter biomekanisk funksjonalitet til spinalbevegelsessegmentet.

Over 32 ° C, krymper PNIPAAm-g-CS og støter vannet fra hydrogelen matrise på grunn av den LCST oppførselen til PNIPAAm, noe som resulterer i en redusert masse spissenen 7 dagers periode i PBS (figur 2). Omvendt, tilsetning av alginat mikropartikler bibringer en svellende virkning og klebe betydelig økt i masse (p <0,05) ved en mikropartikkel konsentrasjon på 25 mg / m, og enda mer ved 50 mg / ml. I denne studien hevelse, endringer i våt masse av hydrogelen er trolig tilskrives vannutveksling med omgivelsene, ettersom PNIPAAm-g-CS har vist seg å være selektivt nedbrytbart i nærvær av enzymer 29. Mange av de protokollfremgangsmåten som er utviklet for den svellende studien var tilpasset, basert på thermoreversibility av PNIPAAm-g-CS. Hydrogel-plater må fullføre overgangen ved 37 ° C før du legger den forvarmes PBS løsning, ellers gelen vil spre. Etter svelling i en uke, må den PBS-oppløsning hurtig og omhyggelig fjernet fra ampullene før hydrogelene gå tilbake til en væskelignende tilstand. Det bør bemerkes at hevelsen protokoll beskrevet i dette papiret ikke fullt ut simulerein vivo miljø av det native IVD. De svellende egenskaper av stillaset in vivo vil avhenge av det osmotiske trykk av det omgivende vev 41 og degradering oppførsel av gelen. Men generelt er den økede svellekapasiteten med alginat mikropartikkel innlemmelse vurderes som gunstige, fordi det vil bidra til den injiserbare hydrogel for å holde romfyllende ved fysiologisk temperatur. Egenskaper som svelleforholdet, og vanninnholdet kan beregnes med ytterligere tørr massemålinger. Fremtidige hevelse studier vil omfatte fordype hydrogel-plater mot en polyetylenglykol (MW = 20000 g / mol) bad, som vil gjelde et osmotisk trykk og etterligne in vivo miljøet i IVD.

Bortsett fra de mekaniske og svelleegenskaper, må klebemidlet oppvise celle biokompatibilitet for å bli betraktet som et egnet stillas. Tidligere studier har vist at overlevelsen av encapsulated celler i alginat 42,43 og PNIPAAm-baserte materialer 44,45. Resultatene fra begge Levende / Døde og XTT-analyser er i overensstemmelse med disse tidligere funnene tyder på passende cellenes levedyktighet i løpet av en periode på 5 dager (figur 3 og 4). Vårt laboratorium har også gjennomført foreløpige undersøkelser av levedyktighet over en lengre utdanning (21 dager) og observerte lignende atferd. Generelt bør et overskudd av PNIPAAm-g-CS og mikropartikler være forberedt på å gjøre rede for noen vesentlig tap under pipettes overføringer. Nok en gang, er det svært viktig å bevare stillaset arkitektur ved å opprettholde riktig temperatur på 37 ° C. Dersom stillaset nettverket går tilbake fra en gel til en væskelignende tilstand, cellebinding og levedyktighet kan bli kompromittert. Med hensyn til Live / Døde analyse, spiller natriumsitrat en viktig rolle i fjerning og dekonstruksjon av alginat mikropartikler. Natriumsitrat reverserer kryssbindings handling mellom Calcium og alginat og fører til en slurry å danne 46. Ytterligere vaskinger med PBS for å fjerne PNIPAAm-g-CS eller alginat kan utføres for å forbedre kvaliteten av bildene. I løpet av XTT-analysen, blir polymerprøver som inneholder ingen celler opprettet i brønnplatene. Disse gjentak tjene som tomme standarder og er pålagt å beregne en nøyaktig absorbans verdi. Våre foreløpige levedyktighet studiene er strengt basert på bruk av HEK-293 celler. I fremtidige studier, vil differensiering av innkapslede adipose-avledede stamceller (AD-MSC) til nucleus pulposus celler bli demonstrert. AD-MSC differensiering mot NP-lignende fenotype har blitt demonstrert ved hjelp av dynamisk kompresjon 47 og hypoksi 48,49.

Total, demonstrerer den foreslåtte klebe løftet for tissue tekniske anvendelser i lastbærende områder, slik som intervertebral platen, hvor suksess for regenerering strategi vil avhenge av stillaset evnen til å resist forvridning under bevegelse og lasting. Dette systemet er meget allsidig ved at den potensielt kan være innrettet til å frigjøre ekstracellulære matriksproteiner eller vekstfaktorer som er spesifikke for den ønskede anvendelse. Viktigere, kan fremgangsmåtene beskrevet her kan tilpasses en hvilken som helst karakteristikk studie med thermogelling polymerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å uttrykke sin takknemlighet for den hjelp fra Dr. Jennifer Kadlowec i utviklingen av strekkprøving limet protokollen.

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of leddgikt og muskel-og hudsykdommer og National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi av National Institutes of Health i henhold Award Antall 1R15 AR 063920-01. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Tags

Bioteknologi hydrogel bioadhesive tissue engineering biomedisinsk teknikk stillas thermogelling injiserbare
Syntese av Thermogelling Poly (N-isopropylakrylamid) -graft-chondroitin sulfate Composites med Alginat Mikropartikler for Tissue Engineering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christiani, T. R., Toomer, K.,… More

Christiani, T. R., Toomer, K., Sheehan, J., Nitzl, A., Branda, A., England, E., Graney, P., Iftode, C., Vernengo, A. J. Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (116), e53704, doi:10.3791/53704 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter