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Bioengineering

ऊतक इंजीनियरिंग के लिए Thermogelling पाली (एन isopropylacrylamide) Alginate microparticles साथ -graft-chondroitin सल्फेट कंपोजिट के संश्लेषण

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

एक इंजेक्शन ऊतक इंजीनियरिंग पाली (एन-isopropylacrylamide) -graft-chondroitin सल्फेट से बना पाड़ (PNIPAAm-G-सीएस) युक्त alginate microparticles तैयार किया गया था। चिपकने वाला शक्ति, गुण और इन विट्रो biocompatibility में सूजन इस अध्ययन में विश्लेषण कर रहे हैं। लक्षण वर्णन यहाँ विकसित तकनीकों अन्य thermogelling सिस्टम के लिए लागू हो सकता है।

Abstract

इंजेक्शन biomaterials प्रत्यारोपण सामग्री है कि एक तरल के रूप में शरीर में पेश किया जा सकता है और बगल में जमना के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। इस तरह की सामग्री प्रत्यारोपित किया जा रहा न्यूनतम invasively और आसानी से अनियमित आकार के दोष में अंतरिक्ष भरने ठोस बनाने के नैदानिक ​​लाभ प्रदान करते हैं। इंजेक्शन biomaterials व्यापक रूप से ऊतक इंजीनियरिंग के लिए scaffolds के रूप में जांच की गई है। हालांकि, शरीर में कुछ लोड असर क्षेत्रों की मरम्मत के लिए, इस तरह के intervertebral डिस्क के रूप में, scaffolds चिपकने वाला गुण के अधिकारी चाहिए। इस प्रस्ताव के दौरान अव्यवस्था के जोखिम को कम करने और आसपास के ऊतकों के साथ घनिष्ठ संपर्क सुनिश्चित करेगा, बलों की पर्याप्त संचरण प्रदान करते हैं। यहाँ, हम तैयारी और thermally संवेदनशील पाली (एन-isopropylacrylamide) से बना एक पाड़ के लक्षण वर्णन -graft-chondroitin सल्फेट (PNIPAAM-G-सीएस) और alginate microparticles का वर्णन है। PNIPAAm-G-सीएस copolymer आरटी पर पानी में एक चिपचिपा समाधान है जो alginat में, रूपोंई कणों आसंजन बढ़ाने के लिए निलंबित कर दिया है। ऊपर कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST), लगभग 30 डिग्री सेल्सियस, copolymer microparticles के चारों ओर एक ठोस जेल रूपों। हम मानक biomaterials लक्षण वर्णन प्रक्रियाओं ढाल लिया है खाते में PNIPAAm-G-सीएस की प्रतिवर्ती चरण संक्रमण लेने के लिए। परिणाम से संकेत मिलता है कि 5% में 50 या 75 मिलीग्राम / एमएल alginate कणों का समावेश (डब्ल्यू / वी) PNIPAAm-G-सीएस समाधान चौगुनी अकेले PNIPAAm-जेन्टलमैन के चिपकने वाला तन्य शक्ति (पी <0.05)। alginate microparticles के समावेश भी काफी PNIPAAm-G-सीएस की सूजन क्षमता (पी <0.05) बढ़ जाती है ऊतक दोषों के भीतर एक अंतरिक्ष भरने जेल बनाए रखने में मदद। अंत में, इन विट्रो विष विज्ञान परख किट, 2,3-bis- के परिणाम (2-methoxy-4-नाइट्रो-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) और लाइव / मृत व्यवहार्यता परख है कि संकेत मिलता है चिपकने वाला अस्तित्व और समझाया मानव भ्रूण गुर्दे के प्रसार समर्थन करने में सक्षम है (HEK) 293 ग5 दिनों में एल।

Introduction

इंजेक्शन biomaterials उन है कि आसानी से एक तरल के रूप में शरीर में दिया जा सकता है और बगल में जमना कर रहे हैं। इस तरह की सामग्री पुनर्योजी चिकित्सा, जहां वे कोशिकाओं 5 के लिए एक तीन आयामी अस्थायी बाह्य मैट्रिक्स के रूप में प्रभावित साइट 1-4 और कार्य करने के लिए समझाया कोशिकाओं वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है में बड़े पैमाने पर लागू किया गया है। रोगी के लिए, इंजेक्शन biomaterials क्योंकि आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं कम आक्रामक होते हैं और ठोस चरण अनियमित ऊतक दोषों के आकार भर सकते हैं, कस्टम आकार प्रत्यारोपण की आवश्यकता को समाप्त फायदेमंद हैं।

Injectability तंत्र की एक किस्म के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। बाह्य कारकों, पीएच की तरह, जैल कि कोशिकाओं और बायोएक्टिव अणुओं 6-8 encapsulate के गठन के लिए एक ट्रिगर के रूप में जांच की गई है। हालांकि, पीएच सभी शारीरिक वातावरण में प्रयोग के लिए सबसे सुविधाजनक ट्रिगर नहीं हो सकता। एक और पारंपरिक ALTERNAinjectability को प्राप्त करने के लिए सक्रिय सीटू रासायनिक polymerization या तिर्यक में उपयोग कर रहा है। एक समूह ने एक पानी में घुलनशील redox अमोनियम persulfate और एन, एन, एन ',' एन -tetramethylethylenediamine की रचना की प्रणाली विकसित की है और पॉलीथीन ग्लाइकोल और पाली (प्रोपलीन) 9,10 ग्लाइकोल से बना macromers प्रतिक्रिया के लिए इसका इस्तेमाल किया। Zan एट अल। 11 विकसित इंजेक्शन chitosan polyvinylalcohol नेटवर्क glutaraldehyde साथ crosslinked। इस तरह की व्यवस्था में, प्रतिक्रियाशील घटकों के cytotoxicity, विशेष रूप से विचार किया जाना चाहिए सेल encapsulation जुड़े अनुप्रयोगों के लिए। इसके अलावा, एक्ज़ोथिर्मिक polymerization के आसपास के ऊतक, जिसके लिए बहुलक हड्डी सीमेंट्स 12,13 सूचित किया गया है समझौता करने के लिए पर्याप्त उच्च तापमान का उत्पादन कर सकता।

फिर भी अन्य इंजेक्शन बहुलक सिस्टम विकसित किया गया है कि ट्रिगर के रूप में तापमान के साथ ठोस राज्य के लिए तरल से एक परिवर्तन दिखा रहे हैं। thermogelling सिस्टम के रूप में जाना जाता है, इन aqueo हैंहमें बहुलक समाधान है कि रासायनिक उत्तेजना, monomers, या crosslinkers सीटू गठन के 14 में प्राप्त करने की आवश्यकता नहीं है। बल्कि, एक चरण संक्रमण आमतौर पर शारीरिक तापमान के पास होने वाली एक शारीरिक रूप से Crosslinked तीन आयामी नेटवर्क के गठन लाती है। ऐसे Pluronic F127 के रूप में Poloxamers दवा वितरण 15-17 और सेल encapsulation 18,19 thermogelling के लिए सबसे अधिक व्यापक रूप से अध्ययन पॉलिमर शामिल हैं। हालांकि, यह अच्छी तरह से स्वीकार किया है कि इन जैल शारीरिक स्थितियों में स्थिरता की कमी है। अध्ययन श्रृंखला extenders 20 या रासायनिक crosslinkers 21,22 का उपयोग कर वृद्धि की स्थिरता का प्रदर्शन किया है। फिर भी, इन अभिकर्मकों के उपयोग सेल encapsulation के लिए सामग्री की क्षमता को सीमित कर सकता।

पाली (एन isopropylacrylamide) एक सिंथेटिक बहुलक thermogelling कि ऊतक इंजीनियरिंग और दवा वितरण 14 में महत्वपूर्ण ध्यान दिया गया है। पाली के जलीय समाधान (एन isopropylacrylamide) (PNIPAAm), एक कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) का प्रदर्शन आम तौर पर 32 के आसपास होने वाली - 34 डिग्री सेल्सियस 23,24। LCST नीचे, पानी PNIPAAm चेन हाइड्रेट्स। ऊपर संक्रमण तापमान, बहुलक एक नाटकीय चरण जुदाई 25-27 और एक ठोस जेल के गठन विषाक्त monomers या crosslinkers के उपयोग के बिना, जिसके परिणामस्वरूप हाइड्रोफोबिक हो जाता है। हालांकि, PNIPAAm homopolymers गरीब लोचदार गुणों का प्रदर्शन और hydrophobicity 28 के कारण शारीरिक तापमान में थोड़ा पानी पकड़ो। इस काम में, हम chondroitin सल्फेट PNIPAAm नेटवर्क है, जो एंजाइमी degradability 29, विरोधी भड़काऊ गतिविधि 30,31, और वृद्धि पानी और पोषक तत्व अवशोषण 32 के लिए क्षमता प्रदान करता है में covalently शामिल करने के लिए चुनें। सीएस के साथ PNIPAAm copolymers हमारी प्रयोगशाला में methacrylate-क्रियाशील सीएस की उपस्थिति में मोनोमर NIPAAm polymerizing grafted copolymer (PNIPAAm-G-सीएस) के लिए फार्म द्वारा तैयार किए गए थे। Beccopolymer की कम crosslinking घनत्व की ause, PNIPAAm-G-सीएस LCST 29 के कारण आरटी पर पानी में एक चिपचिपा समाधान और शारीरिक तापमान पर एक इलास्टिक जेल रूपों। बहुलक समाधान संक्रमण के उलटने के कारण फिर से LCST नीचे ठंडा करने पर flowable हो जाते हैं।

हमने दिखा PNIPAAm-G-सीएस संभावित यांत्रिक गुणों कि सिलवाया जा सकता है, degradability, और मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) के साथ cytocompatibility 293 कोशिकाओं 29 की वजह से, एक ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ के रूप में कार्य करने के लिए है कि है। हालांकि, इस तरह intervertebral डिस्क के रूप में कुछ भार वहन क्षेत्रों में, ऊतक इंजीनियरिंग scaffolds अव्यवस्था 33 के खतरे को समाप्त करने के लिए आसपास के ऊतक डिस्क के साथ एक बड़ा इंटरफेस के रूप में करने की क्षमता होनी चाहिए। इस इंटरफ़ेस प्रत्यारोपण और ऊतक 33 के बीच इंटरफेस के पार बल की पर्याप्त प्रसारण के लिए भी आवश्यक है। हमारे काम में, हम एक निलंबित कर दिया हैPNIPAAm-G-सीएस के जलीय समाधान में lginate microparticles और पाया कि जमाना microparticles, जो ऊतकों 34 के आसपास के साथ आसंजन प्रदान localizes। इस पत्र में, हम thermogelling, चिपकने वाला बहुलक की तैयारी के लिए कदम रूपरेखा। व्यवहार्यता के लिए biomaterials लक्षण वर्णन, सेल इमेजिंग के लिए मानक तकनीक है, और assays के खाते में बहुलक का तापमान संवेदनशीलता और चरण संक्रमण के उलटने लेने के लिए अनुकूलित किया गया। इंजेक्शन बहुलक इस पत्र में वर्णित इस पत्र में वर्णित उन लोगों के बाहर दवा वितरण और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए व्यापक संभावनाएं हैं। इसके अलावा, लक्षण यहाँ वर्णित विधि अन्य thermogelling सिस्टम के लिए लागू हो सकता है।

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Protocol

1. पाली (एन isopropylacrylamide) जी-chondroitin सल्फेट संश्लेषण

  1. bioadhesive हाइड्रोजेल के संश्लेषण के लिए पहले, शुद्ध एन isopropylacrylamide (NIPAAm) मोनोमर और methacrylate chondroitin सल्फेट (सीएस)।
    1. NIPAAm के कम से कम 10 ग्राम वजन और 60 डिग्री सेल्सियस पर एन-हेक्सेन के 400 मिलीलीटर में मोनोमर भंग। पूरा विघटन तक समय समय पर कंटेनर हिलाओ। 24 घंटे के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में समाधान recrystallize।
    2. कंटेनर और वैक्यूम फिल्टर से सघन मोनोमर हटाये एन हेक्सेन एक Buchner कीप का उपयोग कर। आरटी पर एक वैक्यूम ओवन में मोनोमर 24 घंटे के लिए जगह किसी भी शेष एन हेक्सेन हटा दें। बाद में उपयोग के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में मोनोमर स्टोर (1.2 चरण देखें)।
    3. वजन और विआयनीकृत पानी की 8.0 मिलीलीटर में chondroitin सल्फेट के 2.0 ग्राम भंग। धीरे 60 डिग्री सेल्सियस का हल गर्मी।
    4. 50% के लगभग 10 से 40 μl का उपयोग कर (डब्ल्यू डब्ल्यू /) 10 के समाधान के पीएच को समायोजित NaOH।
    5. methacrylic एनहाइड्राइड (एमए) की 0.298 मिलीलीटर जोड़ें। 24 घंटे के लिए भाटा, जबकि 60 डिग्री सेल्सियस पर क्रियाशीलता।
    6. एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक जार और सर्द हे / एन में एसीटोन समाधान की 400 मिलीलीटर डालो।
    7. के बाद 24 घंटे बीत चुके हैं, धीरे-धीरे, ठंड एसीटोन की 400 मिलीलीटर में पूरे methacrylated सीएस (एमसीएस) समाधान डालना एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ सरगर्मी है।
    8. एसीटोन से एमसीएस निकालें और एक वैक्यूम ओवन में वेग जगह है। एमसीएस के लिए एक अक्षुण्ण और एकजुट स्थिति बनाए रखने के लिए जल्दी से इस कदम प्रदर्शन। अवशिष्ट एसीटोन कम से कम 24 घंटे के लिए वैक्यूम के अंतर्गत लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें।
  2. शुद्ध NIPAAm के 10 ग्राम और विआयनीकृत पानी की 232 मिलीलीटर में एमसीएस की 2.209 ग्राम के सह-भंग।
  3. अक्रिय नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके ऑक्सीजन का समाधान पर्ज। एक जोरदार, अभी तक कम गैस का प्रवाह 15 मिनट के लिए खत्म हो बुदबुदाती से समाधान को रोकने के लिए दर को बनाए रखें।
  4. नाइट्रोजन गैस के साथ समाधान मिटाने जारी रखें और tetramethylet की 0.976 मिलीग्राम जोड़ेंhylenediamine (TEMED)।
  5. अगले, अमोनियम persulfate (ए पी) के 97.6 मिलीग्राम के मिश्रण से polymerization प्रतिक्रिया आरंभ करें।
  6. लगभग 20 सेकंड के लिए समाधान मिश्रण और जल्दी से पोत में प्रवेश करने से किसी भी हवा को रोकने के समाधान सील। समाधान 24 घंटे के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत भाजन करने की अनुमति दें।
  7. 24 घंटे के बाद, एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में प्रतिक्रिया पोत जगह है। हाइड्रोजेल एक जेल की तरह राज्य के लिए एक तरल से संक्रमण के लिए अनुमति दें। 7 दिन के लिए कुल 1X फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में polymerized हाइड्रोजेल डूब हाइड्रोजेल से बाहर unreacted मोनोमर के प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए।
  8. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग, कई छोटे टुकड़े, कोई व्यास में 5 सेमी से अधिक में हाइड्रोजेल काटा। एक जेल की तरह राज्य से एक तरल में संक्रमण से हाइड्रोजेल रोकने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस समाधान के भीतर बहुलक पासा। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में भागों स्थानांतरण।
  9. के सबसे ऊपर लपेटकर द्वारा lyophilization के लिए नमूने तैयारKimwipes और रबर बैंड के साथ ट्यूबों। 1 से 2 घंटे के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर नलियों रुक।
  10. फ्रीज ड्रायर पर शंक्वाकार ट्यूबों की जगह हाइड्रोजेल से पानी के सभी हटाने के लिए। संचालन से पहले, फ्रीज ड्रायर एक तापमान और लगभग के दबाव -40 डिग्री सेल्सियस और 0.04 मिलीबार, क्रमशः तक पहुँचने की जरूरत है। 7 दिनों की एक न्यूनतम पूरा सुखाने के लिए आवश्यक है।
  11. फ्रीज बाद में उपयोग (3.1 कदम देखें) के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में एक ठीक पाउडर और दुकान में सूखे बहुलक पीस।

2. कैल्शियम alginate Crosslinked microparticle संश्लेषण

  1. एक 2% तैयार (w / v) विआयनीकृत पानी की 20 मिलीलीटर में 400 मिलीग्राम भंग द्वारा alginate समाधान। लगभग 60 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान हीट विघटन की सुविधा के लिए।
  2. एक 2% (डब्ल्यू / वी) कैल्शियम क्लोराइड समाधान विआयनीकृत पानी की 20 मिलीलीटर के लिए 400 मिलीग्राम जोड़कर तैयार करें।
  3. कनोला तेल के 100 मिलीलीटर, बीच 20 में से 1.0 मिलीग्राम और 20 मिलीग्राम के संयोजन से पानी के मिश्रण में एक तेल बनाएं2% (w / v) alginate की। 15,000 rpm पर एक homogenizer के साथ 10 मिनट के लिए मिश्रण पायसी। इसके अतिरिक्त, 200 आरपीएम या 2,000 rpm पर एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ मिश्रण बड़े या छोटे microparticles बनाने के लिए, क्रमशः।
  4. महाप्राण 2% (w / v) कैल्शियम क्लोराइड समाधान एक 18 जी सुई की नोक के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर। धीरे-धीरे कैल्शियम क्लोराइड बूंद-वार पायस में जोड़ें।
  5. एक बार जब कैल्शियम क्लोराइड के 20 मिलीलीटर समाप्त हो चुकी है, पायस के भीतर microparticles 10 मिनट के लिए crosslink करने के लिए अनुमति देते हैं।
  6. समान रूप से microparticles के बैच कनोला तेल की प्रारंभिक परत को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 1400 XG की एक शक्ति के लिए छाया हुआ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में वितरित।
  7. लगातार धोने, भंवर, और सेंट्रीफ्यूज isopropanol साथ microparticles 2 मिनट के लिए 1400 ग्राम से कम तीन बार की कुल किसी भी अवशिष्ट कनोला तेल निकालने के लिए। प्रत्येक centrifugation कदम के बाद isopropanol सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा isopropanol से धो लें।
  8. एक बार जब ओयएल हटा दिया गया है, विआयनीकृत पानी से धोने की प्रक्रिया तीन बार दोहराने के अतिरिक्त किसी भी अवशिष्ट isopropanol हटा दें। प्रत्येक centrifugation कदम के बाद विआयनीकृत पानी सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा विआयनीकृत पानी से धो लें। एक शीशी में गीला microparticles और दुकान के लगभग 100 मिलीग्राम निकालें। गीला microparticles प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा बैच का औसत व्यास को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, एक खुर्दबीन स्लाइड पर विआयनीकृत पानी में गीला microparticles का एक छोटा सा नमूना फैलाने के। microparticles के आकार पर निर्भर करता है, एक 10X या 20X उद्देश्य का उपयोग करें, और जब तक कणों ध्यान में आने के संख्यात्मक एपर्चर समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप सही उद्देश्य के लिए calibrated है और जरूरत के रूप में प्रकाश स्रोत की चमक को समायोजित। 50 यादृच्छिक alginate microparticles की सबसे लंबी व्यास मापने के लिए और बैच के लिए एक औसत आकार प्राप्त करने के लिए एक लाइन उपकरण का उपयोग करें।
  9. lyophilization बी के लिए तैयार microparticlesY उन्हें Kimwipes साथ लपेटकर और उन्हें रबर बैंड के साथ हासिल करने। 1 घंटे के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर microparticles रुक।
  10. lyophilizer पर microparticles की जगह और नमूना कम से कम 24 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं। बाद में उपयोग के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में फ्रीज एक मोर्टार और मूसल और दुकान का उपयोग कर एक ठीक पाउडर में सूखे microparticles पीस (3.3 कदम देखें)।

3. चिपकने की तैयारी

  1. फ्रीज सूखे बहुलक पाउडर का प्रयोग, एक 5% (w / v) 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर में हाइड्रोजेल पाउडर के 50 मिलीग्राम भंग द्वारा PNIPAAm-G-सीएस समाधान बनाएँ।
  2. 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान के लिए एक भंवर और एक फ्रिज में ठंडा का उपयोग कर मिलाएं।
  3. एक बार जब चिपचिपा समाधान रूपों, हाइड्रोजेल समाधान और भंवर को फ्रीज सूखे alginate microparticles की 25 या 50 मिलीग्राम जोड़कर एक समरूप समग्र बनाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में स्टोर समग्र बाद में उपयोग के लिए (कदम 4.3 और 4.8 देखें)।

4. Bioadhesive मैक्anical तनन परीक्षण

  1. तन्यता परीक्षण प्रदर्शन करने से पहले, एक सुअर का कान से उपास्थि सब्सट्रेट निकाल सकते हैं।
    1. एक गर्म 0.9% में एक सुअर का कान Defrost (w / v) NaCl समाधान; इस ऊतक ढीला करने में मदद मिलेगी।
    2. एक छुरी का प्रयोग, हालांकि एपिडर्मल परत, चमड़े के नीचे ऊतक, कार्टिलेज और खड़ी काटने से अलग करने और एक फ्लैट, आयताकार क्षेत्र बंद अनुभाग। सुअर का कान की घुमावदार लकीरें काटने से बचें।
    3. चमड़े के नीचे ऊतक के माध्यम से समानांतर काटने से उपास्थि से अलग करें त्वचा की परत एपिडर्मल। उपास्थि एक कठिन, सफेद सुअर त्वचा के नीचे पाया ऊतक है।
    4. ध्यान से चमड़े के नीचे ऊतक कि छुरी के पक्ष के साथ उपास्थि से जुड़ा हुआ है परिमार्जन। स्केलपेल ब्लेड के साथ उपास्थि ऊतक में कटौती करने से बचें।
    5. उपास्थि का एक ही पक्ष सामने आ रहा है कि यह सुनिश्चित करें और तन्यता परीक्षण के दौरान फ्लैट। यदि आवश्यक हो, नीचे पर असमान त्वचा काटने से उपास्थि समतल।
    6. 1 सेमी एक्स 1 सेमी के आयामों के साथ कई टुकड़ों में उपास्थि ऊतक में कटौती। सेल्सियस फ्रीजर में एक -20 में 0.9% (w / v) सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ भरा शंक्वाकार ट्यूब में उपास्थि ऊतक स्टोर।
  2. 0.9% (w / v) NaCl समाधान के 2.0 एल तैयार करें। 37 डिग्री सेल्सियस तक खारा समाधान के पूर्व गर्मी। इस समाधान का तापमान परीक्षण भर में बनाए रखा जा करने के लिए की आवश्यकता होगी।
  3. जमे हुए उपास्थि defrost। दोनों सुअर का कार्टिलेज और आइस पैक के साथ एक स्टायरोफोम कंटेनर में हाइड्रोजेल नमूने रखें।
  4. परीक्षण स्टैंड के हाथ करने के लिए बल गेज संलग्न। बल स्टैंड के शीर्ष पर एक hotplate की जगह और 50 डिग्री सेल्सियस के तापमान की स्थापना की।
  5. cyanoacrylate गोंद के साथ स्टेनलेस स्टील ब्लॉक और चिमटी की एक जोड़ी के लिए उपास्थि के एक 1 सेमी एक्स 1 सेमी टुकड़ा प्रत्यय। Delrin सिलेंडर के लिए उपास्थि के एक अतिरिक्त टुकड़ा गोंद और बल गेज करने के लिए सिलेंडर देते हैं। यह बहुत महत्वपूर्ण है कि दोनों उपास्थि सतहों एक दूसरे का सामना और हाइड्रोजेल से संपर्क करें।
  6. जगहगर्म थाली के शीर्ष पर Plexiglas पानी से स्नान और स्नान के अंदर कार्टिलेज सब्सट्रेट के साथ स्टेनलेस स्टील ब्लॉक डालें।
  7. परीक्षण स्टैंड के हाथ के निचले हिस्से और एक दूसरे के साथ दोनों उपास्थि substrates संरेखित। हाथ उठाएँ और पर्याप्त कमरे में छोड़ हाइड्रोजेल लागू करने के लिए।
  8. एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक के साथ, उपास्थि के नीचे टुकड़ा करने के लिए bioadhesive हाइड्रोजेल के 200 μl बांटना।
  9. 1 मिमी पर बल स्टैंड के हाथ लोअर / मिनट हाइड्रोजेल संपर्कों उपास्थि के ऊपरी टुकड़ा और जब तक 0,001 एन के एक प्रीलोड बल डाल रही है
  10. जब तक मात्रा नामित जल स्तर तक पहुँच जाता है स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस खारा समाधान डालो। एक thermocouple के साथ समाधान के तापमान की जाँच करें।
  11. हाइड्रोजेल 5 मिनट की कुल के लिए निर्धारित करने की अनुमति दें। एक बार जेल जम गया है, 2 मिमी / मिनट की गति से हाथ बढ़ा। एक बार bioadhesive उपास्थि सब्सट्रेट से खिसकाते या बल में उल्लेखनीय गिरावट तब होता है जब परीक्षण पूरा हो गया है,विफलता का संकेत।
  12. दर्ज आंकड़ों को इकट्ठा करने और परीक्षण स्टैंड का हाथ बढ़ा। बल गेज से Delrin सिलेंडर निकालें। अपने पिछले कंटेनर में खारा समाधान डालो और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म कर लें।
  13. बल कोई कार्टिलेज या चिपकने वाला, एक ही दर पर उठाया के साथ एक "खाली", Delrin लगाव की प्रसन्नचित्त बल से बहुलक द्वारा लगाए गए घटाकर, और बांड क्षेत्र से विभाजित करके तनाव की गणना।

Alginate microparticles साथ PNIPAAm-G-सीएस की 5. सूजन अध्ययन

  1. साफ कांच की शीशियों को तैयार है और उन्हें एक समय बिंदु, नमूना प्रकार, और नमूना संख्या के साथ उचित लेबल। चिपकने भी बनाया जा सकता है, जैसा कि पहले वर्णन किया। समय बिंदु प्रति प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए पांच नमूने (एन = 5) के कुल तैयार करें।
  2. सभी कांच की शीशियों पूर्व तौलना और आरटी पर अपने शुरुआती बड़े पैमाने पर रिकॉर्ड है।
  3. एक सिरिंज का प्रयोग, पांच शीशियों में से प्रत्येक में तैयार चिपकने वाला नमूना का लगभग 0.4 मिलीलीटर बांटना।सभी परीक्षण समय अंक के पार प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  4. वजन और आरटी पर चिपकने वाला नमूना प्रकार के साथ प्रत्येक शीशी की बड़े पैमाने पर रिकॉर्ड है।
  5. एक कक्षीय इनक्यूबेटर और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1x पीबीएस समाधान के 1 एल पूर्व गर्म।
  6. एक रैक पर शीशियों के सभी आयोजन और इनक्यूबेटर में रैक डालें। चिपकने वाले लगभग 5 से 10 मिनट के लिए एक जेल के लिए एक तरल से संक्रमण के लिए अनुमति दें।
  7. प्रत्येक शीशी 1x पीबीएस के 5.0 मिलीलीटर जोड़ें। ध्यान से अलग तोड़ने से हाइड्रोजेल डिस्क को रोकने के लिए शीशी के पक्ष के साथ पीबीएस समाधान जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।
  8. प्रत्येक शीशी पीबीएस समाधान के वाष्पीकरण को रोकने और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के आंतरिक तापमान बनाए रखने के लिए टोपी। हाइड्रोजेल डिस्क के प्रत्येक सेट में समय की एक निर्दिष्ट अवधि के लिए पीबीएस में डूबे रहने की जरूरत होगी।
  9. एक बार एक 7 दिन के समय बिंदु पर पहुंच गया है, शीशियों का सेट खुलना और प्रत्येक शीशी से पीबीएस समाधान निकालने। आरटी पर चिपकने वाला नमूना फिर से साथ प्रत्येक शीशी वजन।
<पी वर्ग = "jove_title"> 6। गुणात्मक सेल व्यवहार्यता एक लाइव / मृत परख का उपयोग

  1. PNIPAAm-G-सीएस के साथ लाइव / मृत परख प्रदर्शन से पहले, मानव भ्रूण गुर्दे 80% संगम 293 कोशिकाओं (HEK-293) बढ़ता है।
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में cryovial रखकर जमे हुए HEK-293 सेल निलंबन त्वरित पिघलना, तो कोशिकाओं को एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. पहले पारित होने सेल मध्यम विकास बनाने के लिए, उच्च ग्लूकोज में गठबंधन (4.5 छ / एल) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 20% की एक अंतिम एकाग्रता और 100x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान करने के साथ ( कलम-स्ट्रेप) 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए। अन्य सभी मार्ग के लिए, 10% FBS और 1x कलम strep साथ DMEM के लिए स्विच।
    3. मध्यम विकास के 10 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend और एक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में निलंबन हस्तांतरण। समान रूप से घधीरे वापस करने के लिए पकवान सामने झुकने से कोशिकाओं istribute और कुछ समय प्रत्येक दिशा सही करने के लिए छोड़ दिया है।
    4. संस्कृति 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं। यदि आवश्यक हो, हर दो दिन मध्यम बदलें।
    5. जब कोशिकाओं को 80% confluency तक पहुँचने, कई बर्तन में संस्कृति को दोहराने। थाली से मध्यम निकालें।
    6. थाली करने के लिए 0.5% trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें। प्लेटों 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते दें। यदि कोशिकाओं को धीरे प्लेट घूमता द्वारा सतह से अलग देखने के लिए जाँच करें।
    7. संस्कृति 1:10, बंटवारे के लिए trypsinized कोशिकाओं के लिए नियमित रूप से मध्यम विकास (10% के साथ DMEM FBS) के 9 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे पकवान झुकने से मिश्रण।
    8. प्रत्येक नए पकवान में पतला सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर बांटना और मध्यम विकास के 9 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे पकवान झुकने से मिश्रण।
    9. संस्कृति 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं। यदि आवश्यक हो, मध्यम कभी बदलY कोशिकाओं तक दो दिन में 80% संगम तक पहुँचने।
  2. 80% संगम हो दो संस्कृति व्यंजन से मीडिया निकालें।
  3. प्रत्येक थाली करने के लिए 0.5% trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें। प्लेटों 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते दें। यदि कोशिकाओं को धीरे प्लेट घूमता द्वारा सतह से अलग देखने के लिए जाँच करें।
  4. दो बार मध्यम विकास के 3 मिलीलीटर के साथ थाली पर HEK 293 कोशिकाओं को धो लें और एक ही 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए दोनों निलंबन जोड़ें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 XG पर 10 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  6. तैरनेवाला निकालें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मध्यम के 3 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
  7. पिपेट एक hemocytometer में सेल निलंबन के 10 μl और सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए एक सेल गिनती प्रदर्शन करते हैं। यदि प्रारंभिक सेल एकाग्रता बहुत अधिक है माध्यम के निलंबन की मात्रा बढ़ाने के लिए, और इसके विपरीत यदि एकाग्रता बहुत कम है मात्रा में कमी के क्रम में एक लक्ष्य एकाग्रता बनाए रखने के लिए1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के राशन। अपकेंद्रित्र 400 XG पर HEK 293 कोशिकाओं और तदनुसार मीडिया का सही मात्रा में सेल गोली resuspend।
  8. धीरे सेल निलंबन भंवर और समान रूप से निम्न परीक्षण की स्थिति के लिए चार अलग-अलग 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल मिश्रण वितरित: सकारात्मक नियंत्रण monolayer, PNIPAAm-G-सीएस में नकारात्मक मारे गए नियंत्रण में 70% का उपयोग कर (वी / वी) मेथनॉल, HEK-293 PNIPAAm-G-सीएस में समझाया कोशिकाओं, और HEK 293 कोशिकाओं alginate microparticles साथ PNIPAAm-G-सीएस में समझाया।
  9. 24 अच्छी तरह से थाली में सेल मिश्रण के कई 300 μl संस्करणों pipetting 4-6 दोहराने के नमूने उत्पन्न करने के द्वारा सकारात्मक नियंत्रण monolayers बनाएँ।
  10. मारे गए नियंत्रण, PNIPAAm-G-सीएस, और alginate microparticles साथ PNIPAAm-G-सीएस से संबंधित शंक्वाकार ट्यूब से मीडिया निकालें।
    1. 400 XG पर 5 मिनट के लिए शंक्वाकार ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    2. ग resuspending द्वारा एक ही सेल एकाग्रता बनाए रखेंहटा मीडिया के रूप में PNIPAAm-G-सीएस का एक ही मात्रा में एल। बहुलक सेल मिश्रण और समरूप जब तक एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर नीचे पिपेट।
      1. अगर alginate microparticles साथ बोने, एक 35 मिमी संस्कृति डिश में PNIPAAm-G-CS-सेल निलंबन के रूप में (6.10.2 के लिए वर्णित प्राप्त) हस्तांतरण और मिश्रण में कणों का परिचय। सेल मिश्रण और समरूप जब तक एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर नीचे पिपेट।
    3. 6 को दोहराने के नमूने - सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, मारे गए नियंत्रण के लिए कुओं में से प्रत्येक में बहुलक सेल मिश्रण के कई 300 μl बांटना, PNIPAAm-G-सीएस, और alginate microparticles साथ PNIPAAm-G-सीएस 4 उत्पन्न करते हैं।
  11. 10 से 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं और PNIPAAm-G-सीएस एक जेल के लिए एक तरल से संक्रमण के लिए अनुमति देते हैं (पॉलिमर एक अपारदर्शी, सफेद डिस्क रूपों)।
  12. एक स्लाइड हुड में गर्म स्थिति और 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान की स्थापना की। अच्छी तरह से थाली बनाए रखने के लिए गर्म स्लाइड का प्रयोग करेंतापमान और पिपेट प्रत्येक कुएं में पूर्व गर्म मीडिया के 600 μl। आगे एक तरल राज्य के लिए बहुलक के संक्रमण को रोकने के लिए, यह ऊपर हवा गर्म करने के लिए पकवान ऊपर एक फ्लोरोसेंट बल्ब के साथ एक दीपक की स्थिति।
  13. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  14. बाद पांच दिन बीत चुके हैं, ethidium homodimer (EthD -1) और calcein AM उपयोग करते हुए लाइव / मृत डाई मिश्रण तैयार करें। दोनों पदार्थों प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और उपयोग में दिन पर तैयार कर रहे हैं।
    1. आरटी पर किट से calcein AM और EthD -1 defrost।
    2. एक शंक्वाकार ट्यूब बाँझ 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट।
    3. शंक्वाकार ट्यूब 2 मिमी EthD -1 के 6.67 μl जोड़ें। समाधान मिश्रण को अच्छी तरह से भंवर।
    4. अगले, शंक्वाकार ट्यूब के लिए 4 मिमी calcein AM 2.5 μl जोड़ें। मिश्रण को अच्छी तरह से भंवर।
  15. monolayer (सकारात्मक नियंत्रण), PNIPAAm-G-सीएस, और PNIPAAm-G-सीएस बुद्धि के कुओं से मीडिया निकालेंज alginate microparticles। पीबीएस के साथ कुओं की सभी अच्छी तरह से धो, लेकिन धीरे, और पीबीएस को हटा दें।
  16. हाइड्रोजेल alginate microparticles युक्त डिस्क आरटी पर दव्र और कुओं में से प्रत्येक के लिए 50 मिमी सोडियम साइट्रेट के 2 मिलीलीटर जोड़ने की अनुमति दें।
  17. मारे गए सेल कुओं से मीडिया (नकारात्मक नियंत्रण) निकालें। हाइड्रोजेल डिस्क आरटी पर दव्र और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 70% (वी / वी) मेथनॉल के 300 μl जोड़ने के लिए अनुमति दें।
  18. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
  19. कुओं से सोडियम साइट्रेट और मेथनॉल समाधान निकालें और अलग-अलग microcentrifuge ट्यूब में हाइड्रोजेल निलंबन की प्रत्येक पिपेट। 10 मिनट के लिए 2,000 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र हाइड्रोजेल निलंबन से कोशिकाओं को अलग करने के लिए।
  20. ध्यान से शंक्वाकार ट्यूब से समाधान pipetting और सेल गोली छोड़ने के पीछे से निलंबन हटा दें। पीबीएस के 300 μl में गोली Resuspend और मूल अच्छी तरह से थाली के लिए स्थानांतरण।
  21. टी के 300 μl जोड़ेवह लाइव / कुओं में से प्रत्येक को मृत डाई मिश्रण। एल्यूमीनियम पन्नी में अच्छी तरह से थाली लपेटें और आरटी पर एक घुमाव पर 45 मिनट के लिए सेते हैं।
  22. छवि एक 10x उद्देश्य के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे नमूने के सभी। जीवित कोशिकाओं और मारे गए कोशिकाओं को एक हरे और लाल प्रतिदीप्ति, क्रमशः प्रदर्शित करेगा।

7. मात्रात्मक सेल व्यवहार्यता एक XTT परख का उपयोग

  1. 80% संगम HEK 293 कोशिकाओं को विकसित। दो संस्कृति व्यंजन से विकास मीडिया निकालें।
  2. प्रत्येक थाली करने के लिए 0.5% trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें। प्लेटों 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते दें। यदि कोशिकाओं को धीरे प्लेट घूमता द्वारा सतह से अलग देखने के लिए जाँच करें।
  3. दो बार मीडिया के 3 मिलीलीटर के साथ थाली पर HEK 293 कोशिकाओं को धो लें और एक ही 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए दोनों निलंबन जोड़ें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 XG पर 10 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  5. तैरनेवाला निकालें और मीडिया के 3 मिलीलीटर में सेल गोली resuspendऊपर और नीचे pipetting द्वारा।
  6. पिपेट एक hemocytometer में सेल निलंबन के 10 μl और सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए एक सेल गिनती प्रदर्शन करते हैं। पहले से वर्णित के रूप में, 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल का लक्ष्य एकाग्रता रक्षा करता है। अपकेंद्रित्र 400 XG पर HEK 293 कोशिकाओं और तदनुसार मीडिया का सही मात्रा में सेल गोली resuspend।
  7. धीरे सेल निलंबन भंवर और समान रूप से निम्न परीक्षण की स्थिति के लिए चार अलग-अलग 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल मिश्रण वितरित: सकारात्मक नियंत्रण monolayer, PNIPAAm-G-सीएस में नकारात्मक मारे गए नियंत्रण में 70% का उपयोग कर (वी / वी) मेथनॉल, HEK-293 PNIPAAm-G-सीएस में समझाया कोशिकाओं, और HEK 293 कोशिकाओं alginate microparticles साथ PNIPAAm-G-सीएस में समझाया।
  8. 6 को दोहराने के नमूने - 24 अच्छी तरह से थाली में सेल मिश्रण के 300 μl pipetting 4 उत्पन्न करने के द्वारा सकारात्मक नियंत्रण monolayers बनाएँ।
  9. मारे गए नियंत्रण से संबंधित शंक्वाकार ट्यूब से मीडिया निकालें, PNIPAAm-G-सीएस, और PNIPAAm-जीalginate microparticles के साथ सीएस।
    1. 400 XG पर 5 मिनट के लिए शंक्वाकार ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    2. हटा मीडिया के रूप में PNIPAAm-G-सीएस का एक ही मात्रा में कोशिकाओं resuspending द्वारा एक ही सेल एकाग्रता बनाए रखें। सेल मिश्रण और समरूप जब तक एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर नीचे पिपेट।
      1. अगर alginate microparticles साथ बोने, एक 35 मिमी संस्कृति डिश में PNIPAAm-G-CS-सेल निलंबन हस्तांतरण और मिश्रण में कणों का परिचय। सेल मिश्रण और समरूप जब तक एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर नीचे पिपेट।
    3. 6 को दोहराने के नमूने - सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, मारे गए नियंत्रण के लिए कुओं में से प्रत्येक में बहुलक सेल मिश्रण के 300 μl बांटना, PNIPAAm-G-सीएस, और alginate microparticles साथ PNIPAAm-G-सीएस 4 उत्पन्न करते हैं।
  10. एक बार सेल युक्त नमूने के सभी 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए जोड़ दिया गया है, PNIPAAm-G-सीएस और PNIPA के कई 300 μl मात्रा में बांटना6 को दोहराने के नमूने - AM-जी सीएस आसन्न कुओं में कोशिकाओं के बिना alginate microparticles के साथ 4 उत्पन्न करते हैं।
  11. 10 से 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 अच्छी तरह से थाली सेते हैं और PNIPAAm-G-सीएस एक जेल के लिए एक तरल से संक्रमण के लिए अनुमति देते हैं (पॉलिमर एक अपारदर्शी, सफेद डिस्क रूपों)।
  12. एक स्लाइड हुड में गर्म स्थिति और 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान की स्थापना की। गर्म स्लाइड का उपयोग अच्छी तरह से प्रत्येक में अच्छी तरह से थाली तापमान और पिपेट पूर्व गर्म स्पष्ट DMEM के 600 μl बनाए रखने के लिए। आगे एक तरल राज्य के लिए बहुलक के संक्रमण को रोकने के लिए, यह ऊपर हवा गर्म करने के लिए पकवान ऊपर एक फ्लोरोसेंट बल्ब के साथ एक दीपक की स्थिति।
  13. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  14. बाद पांच दिन बीत चुके हैं, निर्माता से 2,3-bis- (2-methoxy-4-नाइट्रो-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) अभिकर्मक तैयार करते हैं। XTT अभिकर्मक प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और उपयोग करने के दिन पर तैयार किया जाता है।
    1. हटाये एम्बर बोतल शामिलरेफ्रिजरेटर से XTT पाउडर हैैं। एक बाँझ सिरिंज और सुई का प्रयोग, एम्बर बोतल में रबर पट के माध्यम से स्पष्ट DMEM (कोई फिनोल लाल) के 5 मिलीलीटर इंजेक्षन।
    2. 10 मिनट के लिए या जब तक भंग कर एक पानी के स्नान में 56 डिग्री सेल्सियस के लिए अभिकर्मक हीट।
    3. इसके अलावा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा ट्यूब में 20% (वी / वी) के लिए XTT अभिकर्मक पतला। microcentrifuge ट्यूबों में अतिरिक्त XTT अभिकर्मक विभाज्य है और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण के लिए ठंडे बस्ते में डाल दिया।
  15. मारे गए सेल कुओं से मीडिया (नकारात्मक नियंत्रण) निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 70% (वी / वी) मेथनॉल के 300 μl जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं और कुओं से मेथनॉल हटा दें।
  16. monolayer (सकारात्मक नियंत्रण), PNIPAAm-G-सीएस, और PNIPAAm-G-सीएस alginate microparticles के साथ की शेष कुओं से मीडिया निकालें। पीबीएस के साथ कुओं की सभी अच्छी तरह से धो, लेकिन धीरे, और फिर पीबीएस को हटा दें।
  17. 2 के 300 μl जोड़े0% XTT कुओं में से प्रत्येक के लिए अभिकर्मक। एल्यूमीनियम पन्नी में 24 अच्छी तरह से थाली लपेटें और आरटी पर एक घुमाव पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  18. 24 घंटे के बाद, कुओं के सभी 50 मिमी सोडियम साइट्रेट के 200 μl जोड़ें और एक अतिरिक्त घंटे के लिए घुमाव पर सेते हैं।
  19. बहुलक निलंबन के सभी आरटी पर 10 मिनट के लिए 2,000 XG पर microcentrifuge ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण।
  20. एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला के 200 μl स्थानांतरण। एक microtiter प्लेट रीडर का उपयोग, 690 एनएम पर 450 एनएम और गैर विशिष्ट absorbance रीडिंग में विशिष्ट absorbance रीडिंग प्राप्त करते हैं।

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Representative Results

एक thermally संवेदनशील grafted सह बहुलक सफलतापूर्वक संश्लेषित किया गया था और इसके bioadhesive ताकत के लिए विशेषता, सूजन गुण, और इन विट्रो cytocompatibility में। हम इसकी अच्छी तरह से स्थापित mucoadhesive गुणों के कारण alginate जांच करने के लिए चुना है। Alginate microparticles, 59.7 ± 14.9 माइक्रोन के एक औसत व्यास के साथ, 5% के साथ मिश्रित कर रहे थे (डब्ल्यू / वी), 25, 50, और 75 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता में PNIPAAm-G-सीएस। इन सांद्रता एक आधा, के बराबर है, और जलीय घोल में PNIPAAm-G-सीएस की दो बार बराबर सूखी वजन के आधार पर किया गया। 75 मिलीग्राम से ऊपर microparticle सांद्रता / एमएल अत्यधिक चिपचिपाहट का प्रदर्शन किया और जांच नहीं कर रहे थे। 5% की अधिकतम तन्यता चिपकने वाला शक्ति (डब्ल्यू / वी) PNIPAAm-G-सीएस के साथ alginate microparticles के अलग सांद्रता अकेले हाइड्रोजेल की तुलना में थे। 50 या 75 मिलीग्राम के अलावा / alginate microparticles मिलीलीटर 5% में निलंबित कर दिया (डब्ल्यू / वी) PNIPAAm-G-सीएस चार गुना इंक में हुईतन्य शक्ति (पी में rease <0.05), के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है। 25 मिलीग्राम / एमएल के एक microparticle एकाग्रता 5% (w / v) PNIPAAm-G-सीएस (पी की तुलना में एक तन्य शक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं दिखा था> 0.05)। 5% की तन्यता ताकत में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ था (डब्ल्यू / वी) PNIPAAm-G-सीएस जब alginate microparticles की एकाग्रता 50 से 75 मिलीग्राम / एमएल (p> 0.05) से वृद्धि हुई थी।

bioadhesive हाइड्रोजेल की सूजन गुण 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में विभिन्न योगों डुबो की विशेषता थे। 25 और 50 मिलीग्राम / एमएल के alginate microparticle सांद्रता व्यवहार सूजन में कोई मतभेद की पहचान के लिए परीक्षण किया गया। Alginate microparticles प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मापा और 25.0 ± 14.4 माइक्रोन के एक औसत व्यास थी। 7 दिनों के बाद, और हाइड्रोजेल डिस्क थे दर्ज की प्रारंभिक और अंतिम गीला बड़े पैमाने पर बड़े पैमाने में बदलाव के चिपकने वाला formulatio प्रति कई नमूने के लिए गणना की गईn (एन = 5)। चित्रा 2 सभी योगों के बीच बड़े पैमाने में परिवर्तन में भारी अंतर को दर्शाता है। alginate microparticles के दोनों 25 और 50 मिलीग्राम / एमएल युक्त चिपकने वाले, मास में सकारात्मक परिवर्तन का प्रदर्शन किया है, जबकि 5% (w / v) PNIPAAm-G-सीएस मास में कमी आई है। सभी नमूनों में से एक से काफी अलग होना पाया गया है एक और (पी <0.05) 50 मिलीग्राम / सबसे बड़ी सूजन प्रभाव दिखा alginate microparticles की मिलीलीटर युक्त चिपकने के साथ।

प्रस्तावित चिपकने के biocompatibility एक लाइव / मृत और XTT cytotoxicity परख के उपयोग के माध्यम से दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक जांच की गई। HEK 293 कोशिकाओं दोनों 5% में समझाया गया (w / v) PNIPAAm-G-सीएस और 5% (w / v) PNIPAAm-G-सीएस 59.7 ± 14.9 माइक्रोन के एक औसत व्यास के साथ 50 मिलीग्राम / alginate microparticles की मिलीग्राम से युक्त । कोशिकाओं और PNIPAAm-G-सीएस में समझाया कोशिकाओं 70% मेथनॉल के साथ मारे गए एक monolayer सकारात्मक और nega विचार किया गयाक्रमशः नियंत्रण ेश्य। कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त योगों 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में विकास के 5 दिनों के बाद विशेषता थे। प्रत्येक परीक्षा दोनों PNIPAAm-G-सीएस और microparticles साथ PNIPAAm-G-सीएस के लिए अच्छा सेल व्यवहार्यता का संकेत दिया। चित्रा 3 से छवियाँ दोनों चिपकने वाला योगों (पैनलों ए और बी) और सेल monolayer में हरे रंग की fluorescing जीवित कोशिकाओं को समझाना, सकारात्मक नियंत्रण (पैनल सी) के रूप में सेवारत। किल्ड कोशिकाओं (पैनल डी) एक लाल रंग प्रतिदीप्ति और कोशिका मृत्यु दिखा। XTT cytotoxicity परीक्षण से परिणाम लाइव / मृत परख के परिणामों की पुष्टि की। Microparticles के 50 मिलीग्राम / एमएल युक्त चिपकने के रिश्तेदार सेल व्यवहार्यता के रूप में 4 चित्र में सचित्र PNIPAAm-G-सीएस की तुलना में 1.3 गुना कमी आई है, लेकिन कमी सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था (p> 0.05)। दोनों PNIPAAM-G-सीएस और microparticles साथ PNIPAAM-G-सीएस भी सेल monolayer (p> 0.05) के लिए तुलनीय व्यवहार्यता था। hydr में समझाया कोशिकाओंogel योगों और सेल monolayer नकारात्मक नियंत्रण (पी <0.05) की तुलना में काफी अलग होना पाया गया है। कुल मिलाकर, इन परिणामों का सुझाव है कि चिपकने वाला microparticles युक्त न केवल दर्शाती चिपकने वाला शक्ति है, लेकिन अच्छा biocompatibility के रूप में अच्छी वृद्धि हुई है।

आकृति 1
चित्रा 1. तन्य शक्ति पर प्रभाव 5% में Alginate microparticles के अलग सांद्रता शामिल (डब्ल्यू / वी) PNIPAAm-G-सीएस के बाद। PNIPAAm-G-सीएस की तन्यता ताकत 50 या 75 मिलीग्राम / alginate microparticles (पी <0.5) की मिलीलीटर के अलावा के साथ चार गुना। त्रुटि सलाखों एक गणना 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 5)। Alginate microparticles 59.7 ± 14.9 माइक्रोन के एक औसत आकार की थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. 5% की सूजन क्षमता पर Alginate microparticles के अलग सांद्रता के प्रभाव (w / v) PNIPAAm-G-सीएस। के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस में 7 दिन विसर्जन, PNIPAAm-G-सीएस गीला मास में होने के कारण कमी आई है LCST ऊपर PNIPAAm के हाइड्रोफोबिक गुण। PNIPAAm-G-सीएस 25 या 50 मिलीग्राम / क्षमता का प्रदर्शन किया सूजन alginate microparticles की मिलीलीटर के साथ। बढ़ाने से microparticles की एकाग्रता काफी (पी <0.05) 7 दिनों में हाइड्रोजेल के द्रव्यमान में परिवर्तन, पानी तेज करने के लिए जिम्मेदार ठहराया वृद्धि हुई है। त्रुटि सलाखों एक गणना 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व करते हैं। Alginate microparticles 25.0 ± 14.4 माइक्रोन के एक औसत आकार की थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

gether.within-पेज = "1"> चित्र तीन
5 दिन की अवधि में संवर्धित HEK 293 कोशिकाओं की चित्रा 3. प्रतिनिधि लाइव / मृत प्रतिदीप्ति छवियों। कोशिकाओं (ए) PNIPAAm-G-सीएस और alginate के 50 मिलीग्राम / एमएल के साथ (बी) PNIPAAm-G-सीएस में समझाया गया microparticles। कोशिकाओं को भी एक (सी) monolayer और (डी) PNIPAAm-G-सीएस में मेथनॉल के साथ मारे गए क्रमश: एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करने के लिए, में बड़े हो रहे थे। लाइव / मृत व्यवहार्यता प्रयोग प्रयोग के प्रति तीन प्रतिकृति के साथ तीन बार दोहराया गया था। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। Alginate microparticles 59.7 ± 14.9 माइक्रोन के एक औसत आकार की थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा Alginate microparticles। PNIPAAm-G-सीएस भीतर समझाया HEK 293 कोशिकाओं के साथ और alginate microparticles के बिना जीवन रक्षा के साथ PNIPAAm-G-सीएस में HEK-293 कोशिकाओं की 4. लघु अवधि व्यवहार्यता का आकलन किया और 5 दिनों के बाद XTT का उपयोग की तुलना की गई थी। एक सेल monolayer और PNIPAAm-G-सीएस में समझाया कोशिकाओं 70% मेथनॉल के साथ मारे गए, क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। दोनों PNIPAAm-G-सीएस और alginate microparticles साथ PNIPAAm-G-सीएस सेल व्यवहार्यता में कोई उल्लेखनीय कमी (p> 0.05) सेल monolayer की तुलना से पता चला है, अभी तक सेल व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण कमी (पी <0.05) को मार डाला की तुलना से पता चला कोशिकाओं। alginate microparticles के अलावा काफी PNIPAAm-G-सीएस (p> 0.05) के सेल व्यवहार्यता समझौता नहीं करता। त्रुटि सलाखों एक गणना 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 3, प्रयोग के प्रति छह प्रतिकृति)। Alginate microparticles 59.7 ± 14.9 माइक्रोन के एक औसत आकार था।रेफरी = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वहाँ हाइड्रोजेल-microparticle समग्र synthesizing और उसके चिपकने वाला शक्ति का मूल्यांकन, क्षमता है, और सेलुलर biocompatibility सूजन में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। PNIPAAm-G-सीएस के नि: शुल्क कट्टरपंथी polymerization chondroitin सल्फेट के सफल methacrylation, मोनोमर घटकों का पूरा विघटन, और ऑक्सीजन मुक्त प्रतिक्रिया की स्थिति की आवश्यकता है। प्रतिक्रिया मिश्रण में methacrylated chondroitin सल्फेट को NIPAAm मोनोमर के अनुपात क्योंकि यह हमारे पिछले काम में, प्रदर्शन किया गया है, यांत्रिक गुणों मूल निवासी intervertebral डिस्क ऊतक 29 के समान के साथ copolymers उत्पन्न करने के लिए चुना गया था। हाइड्रोजेल में chondroitin सल्फेट की मात्रा बढ़ाने से जमाना दौरान पानी की कमी को कम करने और इस प्रकार जेल के compressive कठोरता में कमी होगी। methacrylation के चयनित डिग्री भी जब जलीय घोल में भंग कर एक 18 जी सुई के माध्यम से injectability के लिए अनुकूल निपटने के गुण के साथ हाइड्रोजेल उत्पादन करने के लिए प्रदर्शन किया गया है <sup> 29। सीएस के methacrylate प्रतिस्थापन बहुलक नेटवर्क के Crosslink घनत्व में वृद्धि होगी, LCST नीचे वृद्धि हुई समाधान चिपचिपापन के कारण और क्षमता सूजन जेल को कम करने का एक वृद्धि की डिग्री। दूसरों ऐसे परमाणु हस्तांतरण कट्टरपंथी polymerization (ATRP) 35 या रिवर्स इसके विखंडन श्रृंखला हस्तांतरण (बेड़ा), 36 के रूप में PNIPAAm हाइड्रोजेल synthesizing में अलग अलग दृष्टिकोण की जांच की है। ATRP के माध्यम से Polymerization मोनोमर फेरबदल अनुपात सर्जक को द्वारा जुर्माना देखते आणविक वजन के साथ संकीर्ण, polydisperse हाइड्रोजेल के विकास के लिए प्रेरित किया है। कार्य समूहों बेड़ा polymerization का उपयोग कर एक कंघी की तरह ढंग से grafted किया जा सकता है, इस प्रकार बहुलक श्रृंखला उलझाव और चरण जुदाई प्रभावित।

एक समरूप पानी में तेल के मिश्रण वर्दी, पार से जुड़े alginate microparticles बनाने में आवश्यक है। एक पायस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए सरल है और खतरनाक रसायनों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, लेकिन दोनों microparticle आकार और वितरण को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हैं। Microparticle आकार पायस हलचल गति बढ़ रही है, इस प्रकार के छोटे कणों और उपाध्यक्ष विपरीत बनाने के द्वारा बदला जा सकता है। इस विशेष अध्ययन में, alginate microparticle आकार एक संभावित संपत्ति है कि सूजन, यांत्रिकी, या सेलुलर व्यवहार्यता प्रभाव हो सकता है के रूप में जांच की गई। प्रकाश बिखरने भी औसत microparticle आकार को मापने के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ऐसे surfactant प्रकार और alginate एकाग्रता के रूप में अन्य पायस गुण microparticle आकार और कुल गठन 37 प्रभाव होगा। alginate एकाग्रता microparticle आकार कम हो जाएगा घटाना, हालांकि समुच्चय अधिक फार्म की संभावना है। surfactants की हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक प्रकृति में बदलाव, तेल और पानी के चरणों के बीच सतह तनाव को प्रभावित करेगा इसलिए पायस के भीतर बूंद आकार बदल रहा है। Alginate microparticles वैकल्पिक रूप से एक microfluidic डिवाइस है, जो वर्दी particl के लिए अनुमति देता का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता हैई आकार और संकीर्ण आकार वितरण 38। इस तकनीक में एक निरंतर तेल चरण है कि एक चैनल के माध्यम से बहती है और एक कैल्शियम क्लोराइड स्नान में प्रवेश करती है के भीतर एक alginate चरण dispersing शामिल है। स्प्रे draying एक और तकनीक है जो बहुत छोटे microparticles 39 उत्पादन होता है। यह भी ध्यान दें कि alginate प्रोटीन या वृद्धि कारकों के साथ लोड किया जा सकता है और पार से जुड़े ऐसे जस्ता या बेरियम के रूप में अन्य द्विसंयोजक आयनों के साथ हो सकता है महत्वपूर्ण है।

इस काम में, हम ऊतक इंजीनियरिंग में संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक चिपकने वाला सिस्टम की विशेषताएँ। हमारे तन्यता परीक्षण विशेष रूप से जब सुअर का उपास्थि के साथ संपर्क में समग्र चिपकने वाला शक्ति यों के लिए करना है। सब्सट्रेट के इस प्रकार के intervertebral डिस्क की उपास्थि अंत प्लेटों के लिए हाइड्रोजेल समग्र के आसंजन नकल करने के लिए चुना गया था। ऐसे सुअर त्वचा के रूप में अन्य ऊतकों substrates, एक चिपकने वाला 40 की शक्ति यों के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन ऊतक टाइप करेंगेइरादा आवेदन के आधार पर बदलती हैं। खारा पानी से स्नान और उपयोग करने से पहले समग्र पूर्व ठंडा करने के लिए उचित तापमान पर नियंत्रण बनाए रखने के लिए सही यांत्रिक गुणों को मापने में महत्वपूर्ण हैं। ऊपर 37 डिग्री सेल्सियस ऊंचा पानी से स्नान तापमान हाइड्रोजेल तेजी से हटना और ठोस बनाना, कंपोजिट कि यंत्रवत् नीचे 37 डिग्री सेल्सियस से जांच की जाती चरण जुदाई की कमी के कारण तन्य शक्ति में कमी आई है, जबकि प्रदर्शन करेंगे करने के लिए प्रेरित करेगा। वर्तमान में, हम विभिन्न इंजेक्शन चिपकने वाला योगों की कतरनी चिपकने वाला शक्ति की जांच करने के तरीकों को विकसित कर रहे हैं। भविष्य के काम का निर्धारण करने के लिए कि चिपकने वाला एक कुंडलाकार दोष के माध्यम से बाहर निकालना तैयार नहीं है और रीढ़ की गति खंड के बायोमैकेनिकल कार्यक्षमता को पुनर्स्थापित करता सुअर का IVDs साथ पूर्व vivo यांत्रिक परीक्षण के प्रदर्शन में शामिल होंगे।

ऊपर 32 डिग्री सेल्सियस, PNIPAAm-G-सीएस सिकुड़ती और PNIPAAm की LCST व्यवहार के कारण हाइड्रोजेल मैट्रिक्स से पानी expels, एक कम द्रव्यमान ओवर में जिसके परिणामस्वरूपपीबीएस में एक 7 दिन की अवधि (चित्रा 2)। इसके विपरीत, alginate microparticles के अलावा 25 मिलीग्राम / मीटर की microparticle एकाग्रता और उससे भी ज्यादा 50 मिलीग्राम / एमएल पर एक सूजन प्रभाव और चिपकने वाला काफी मास में वृद्धि हुई (पी <0.05) प्रदान करता है। इस सूजन अध्ययन में, हाइड्रोजेल का गीला जन में बदलाव करते हैं, आमतौर परिवेश के साथ पानी विनिमय के कारण हैं, क्योंकि PNIPAAm-G-सीएस एंजाइमों 29 की उपस्थिति में चुनिंदा सड़ सकने होना दिखाया गया है। अनुकूलित सूजन अध्ययन के लिए विकसित प्रोटोकॉल कदम से कई PNIPAAm-G-सीएस की thermoreversibility पर आधारित थे। हाइड्रोजेल डिस्क पूरी तरह से पूर्व गर्म पीबीएस समाधान जोड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमण चाहिए, अन्यथा जेल फैलाने जाएगा। एक सप्ताह के लिए सूजन के बाद, पीबीएस समाधान से पहले हाइड्रोजेल वापस एक तरल की तरह राज्य को वापस जल्दी से और ध्यान से शीशियों से हटा दिया जाना चाहिए। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सूजन इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल पूरी तरह से अनुकरण नहीं करतामूल निवासी IVD के vivo वातावरण में। विवो में पाड़ की सूजन गुण आसपास के ऊतकों 41 और जेल की गिरावट के व्यवहार के आसमाटिक दबाव पर निर्भर करेगा। हालांकि, सामान्य रूप में, alginate microparticle समावेश के साथ वृद्धि हुई सूजन क्षमता अनुकूल माना जाता है, के रूप में यह शारीरिक तापमान पर रहने के लिए अंतरिक्ष भरने इंजेक्शन हाइड्रोजेल में मदद मिलेगी। इस तरह के सूजन अनुपात और पानी की सामग्री के रूप में विशेषताओं अतिरिक्त शुष्क जन माप के साथ गणना की जा सकती है। भविष्य सूजन के अध्ययन के लिए एक पॉलीथीन ग्लाइकोल (मेगावाट = 20,000 जी / मोल) स्नान, जो एक आसमाटिक दबाव लागू करते हैं और IVD के vivo पर्यावरण नकल करेंगे खिलाफ हाइड्रोजेल डिस्क डुबो शामिल होंगे।

एक तरफ यांत्रिक और सूजन गुण से, चिपकने वाला क्रम में सेलुलर biocompatibility दिखा रहे एक उपयुक्त पाड़ के रूप में विचार किया जाना चाहिए। पिछले अध्ययनों encapsula के अस्तित्व का प्रदर्शन किया हैalginate 42,43 और PNIPAAm आधारित सामग्री 44,45 में टेड कोशिकाओं। दोनों रहते हैं / मृत और XTT assays से परिणाम से पहले इन्हें निष्कर्षों के साथ संगत कर रहे हैं, 5 दिनों की अवधि में उचित सेल व्यवहार्यता का सुझाव (आंकड़े 3 और 4)। हमारी प्रयोगशाला भी एक लंबे समय के पाठ्यक्रम (21 दिन) पर व्यवहार्यता की प्रारंभिक जांच का आयोजन किया और इसी तरह के व्यवहार को देखा गया है। सामान्य तौर पर, PNIPAAm-G-सीएस और microparticles की एक अधिशेष पिपेट स्थानान्तरण के दौरान किसी भी सामग्री के नुकसान के लिए खाते में करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। एक बार फिर, यह 37 डिग्री सेल्सियस पर उचित तापमान की स्थिति बनाए रखने के द्वारा पाड़ वास्तुकला की रक्षा करने के लिए बेहद महत्वपूर्ण है। पाड़ नेटवर्क एक तरल की तरह राज्य, सेल लगाव और व्यवहार्यता के लिए एक जेल से बदल जाती है तो समझौता हो सकता है। साथ लाइव / मृत परख करने का संबंध है, सोडियम साइट्रेट हटाने और alginate microparticles के विखंडन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सोडियम साइट्रेट Calci के बीच पार से जोड़ने की कार्रवाई पराजयोंउम और alginate और एक घोल 46 के लिए फार्म का कारण बनता है। PNIPAAm-G-सीएस दूर करने के लिए पीबीएस के साथ अतिरिक्त washes या alginate चित्रों की गुणवत्ता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। XTT परख के दौरान, बहुलक कोई कोशिकाओं से युक्त नमूने अच्छी तरह से प्लेटों के भीतर बनाई गई हैं। ये प्रतिकृति के रूप में खाली मानकों की सेवा और एक सटीक absorbance के मूल्य की गणना करने के लिए आवश्यक हैं। हमारे प्रारंभिक व्यवहार्यता अध्ययनों से सख्ती से HEK 293 कोशिकाओं का उपयोग पर आधारित हैं। भविष्य के अध्ययनों में, समझाया वसा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव (ई-एमएससी) नाभिक pulposus कोशिकाओं में प्रदर्शन किया जाएगा। एनपी तरह phenotype की ओर ई-एमएससी भेदभाव गतिशील संपीड़न 47 और हाइपोक्सिया 48,49 का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया है।

कुल मिलाकर, प्रस्तावित चिपकने वाला इस तरह के intervertebral डिस्क, जहां उत्थान रणनीति की सफलता के लिए संसाधन और अन्य विभागों पाड़ की क्षमता पर निर्भर करेगा के रूप में भार वहन क्षेत्रों में ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए वादा दर्शाता हैगति और लदान के दौरान अव्यवस्था पहली। इस प्रणाली में है कि यह संभवतः बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन या वृद्धि कारक वांछित अनुप्रयोग के लिए विशिष्ट जारी करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता बहुत बहुमुखी है। महत्वपूर्ण बात है, यहाँ वर्णित विधि thermogelling पॉलिमर के साथ किसी भी लक्षण वर्णन अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता चिपकने वाला तनन परीक्षण प्रोटोकॉल के विकास में डॉ जेनिफर Kadlowec की सहायता को स्वीकार करना होगा।

अनुसंधान इस प्रकाशन में सूचना दी गठिया और Musculoskeletal और त्वचा रोगों के राष्ट्रीय संस्थान और अवार्ड संख्या 1R15 एआर 063920-01 तहत बायोमेडिकल इमेजिंग और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के बायोइन्जिनियरिंग के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

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