Summary
Um andaime engenharia de tecidos injectáveis compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.
Abstract
Biomateriais injectáveis são definidos como materiais implantáveis que podem ser introduzidos no corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais oferecem as vantagens clínicas de serem implantados minimamente invasiva e facilmente formando sólidos de preenchimento de espaço em defeitos de forma irregular. biomateriais injetáveis têm sido amplamente investigados como suportes para engenharia de tecidos. No entanto, para a reparação de determinadas zonas de suporte de carga no corpo, tais como o disco intervertebral, andaimes devem possuir propriedades adesivas. Isto vai minimizar o risco de deslocamento durante o movimento e assegurar o contacto íntimo com o tecido circundante, fornecendo a transmissão adequada das forças. Aqui, descrevemos a preparação e caracterização de um andaime composto por termicamente sensíveis poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina -graft-(PNIPAAm-g-CS) e micropartículas de alginato. O copolímero de PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, em que alginate as partículas são suspensas para aumentar a adesão. Acima da temperatura crítica inferior de solução (TCIS), cerca de 30 ° C, o copolímero forma um gel sólido em volta das micropartículas. Temos adaptado biomateriais procedimentos normalizados de caracterização para tomar em consideração a transição de fase reversível de PNIPAAm-g-CS. Os resultados indicam que a incorporação de 50 ou 75 mg / ml de partículas de alginato em 5% (w / v) de soluções PNIPAAm-g-CS quadruplicar a resistência à tracção adesiva de PNIPAAm-GCS sozinhos (p <0,05). A incorporação de micropartículas de alginato também aumenta significativamente a capacidade de inchamento de PNIPAAm-g-CS (p <0,05), ajudando a manter um gel de enchimento dentro do espaço de defeitos de tecidos. Finalmente, os resultados do ensaio in vitro kit de toxicologia, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT) e ensaio de viabilidade vivo / morto indicam que o adesivo é capaz de suportar a sobrevivência e proliferação de encapsulado de rim embrionário humano (HEK) 293 Cells mais de 5 dias.
Introduction
Biomateriais injectáveis são aqueles que podem ser convenientemente entregues para o corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais têm sido extensivamente aplicado na medicina regenerativa, em que eles são utilizados para entregar células encapsuladas para o local afectado 1-4 e actuam como uma matriz extracelular temporária tridimensional para as células 5. Para o paciente, biomateriais injectáveis são vantajosos porque os procedimentos cirúrgicos para implante são minimamente invasiva e a fase sólida pode preencher defeitos de forma irregular dos tecidos, eliminando a necessidade de implantes de tamanho personalizado.
Injectabilidade pode ser conseguido através de uma variedade de mecanismos. Os factores externos, como pH, têm sido investigadas como um gatilho para a formação de geles que encapsulam as células e moléculas bioactivas 6-8. No entanto, o pH não pode ser o gatilho mais conveniente para utilizar em todos os ambientes fisiológicos. Outra alterna tradicionaltiva para atingir injectabilidade está usando polimerização in situ química ou reticulação. Um grupo desenvolvido um sistema redox solúvel em água composto por persulfato de amónio e N, N, N-tetrametiletilenodiamina, N ', e é utilizado para a reacção de macrómeros compostas de polietileno glicol e poli (propileno) glicol 9,10. Zan et al. 11 redes quitosano injectáveis de álcool polivinílico reticulado com glutaraldeído desenvolvidos. Em tais sistemas, a citotoxicidade dos componentes reactivos deve ser considerada, especialmente para aplicações que envolvem o encapsulamento celular. Além disso, a polimerização exotérmica pode produzir temperaturas elevadas o suficiente para comprometer o tecido circundante, o que tem sido relatado para o osso polimérico cimentos 12,13.
Ainda outros sistemas de polímeros injectáveis têm sido desenvolvidos que exibem uma mudança do estado líquido para estado sólido com a temperatura como o gatilho. Conhecido como sistemas termogelificantes, estes são aqueonos soluções de polímero que não requerem estímulo químico, monómeros ou agentes de ligação cruzada para conseguir a formação in situ 14. Em vez disso, uma transição de fase que ocorre geralmente próxima da temperatura fisiológica induz a formação de uma rede tridimensional fisicamente reticulado. Poloxâmeros como Pluronic F127 estão entre os polímeros mais estudados para termogelificantes entrega da droga 15-17 e células encapsulamento 18,19. No entanto, é bem aceite que estes geles não possuem a estabilidade em condições fisiológicas. Estudos têm demonstrado o aumento da estabilidade usando extensores de cadeia ou agentes de reticulação químicos 20 21,22. No entanto, a utilização destes reagentes pode limitar o potencial dos materiais de encapsulamento de células.
Poli (N-isopropilacrilamida) é um polímero sintético termogelificantes que tem recebido uma atenção significativa em engenharia de tecidos e entrega de droga 14. As soluções aquosas de poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) exibem uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), tipicamente ocorrendo em torno de 32-34 ° C 23,24. Abaixo da TCIS, água hidrata cadeias de PNIPAAm. Acima da temperatura de transição, o polímero torna-se hidrofóbico, resultando numa separação de fases dramática 25-27 e formação de um gel sólido, sem o uso de monómeros ou agentes de reticulação tóxicos. No entanto, homopolímeros de PNIPAAm exibem pobres propriedades elásticas e mantenha pouco de água à temperatura fisiológica devido à hidrofobicidade 28. Neste trabalho, nós optar por incorporar sulfato de condroitina covalente na rede PNIPAAm, que oferece o potencial para degradabilidade enzimática 29, a actividade anti-inflamatória 30,31, e aumento da água e absorção de nutrientes 32. copolímeros de PNIPAAm com CS foram preparados no nosso laboratório por polimerização do monómero NIPAAm na presença de CS-metacrilato funcionalizado para formar copolímero enxertado (PNIPAAm-g-CS). BecAUtilize de baixa densidade de reticulação do copolímero, PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, e um gel elástico à temperatura fisiológica devido à TCIS 29. As soluções de polímero se tornar fluido novamente após o arrefecimento abaixo da TCIS, devido à reversibilidade da transição.
Nós demonstramos que PNIPAAm-g-CS tem o potencial para funcionar como uma estrutura de engenharia de tecidos, devido às propriedades mecânicas que podem ser adaptados, degradabilidade e citocompatibilidade com rim embrionário humano (HEK) 293 células 29. No entanto, em determinadas áreas de suporte de carga, tais como o disco intervertebral, andaimes de engenharia de tecidos devem possuir a capacidade de formar uma interface substancial com o tecido envolvente do disco para eliminar o risco de deslocamento 33. Esta interface é também necessário para uma adequada transmissão de força em toda a interface entre o implante e o tecido 33. Em nosso trabalho, temos que suspendeu amicropartículas lginate em soluções aquosas de PNIPAAm-g-CS e descobriram que a gelificação localiza as micropartículas, que proporcionam a adesão com o tecido circundante 34. Neste artigo, vamos delinear os passos para a preparação do termogelificantes, polímero adesivo. As técnicas convencionais para a caracterização de biomateriais, imagens de células, e os ensaios de viabilidade foram adaptados para ter em conta a sensibilidade à temperatura do polímero e a reversibilidade da transição de fase. O polímero injetável descrito neste trabalho tem grande potencial para aplicações de entrega de medicamentos e engenharia de tecidos fora dos descritos neste documento. Além disso, os métodos de caracterização descritos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.
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Protocol
1. O poli (N-isopropilacrilamida) -g-sulfato de condroitina Síntese
- Antes da síntese do hidrogel bioadesivo, purificar N-isopropilacrilamida (NIPAAm) e monómero de metacrilato de sulfato de condroitina (CS).
- Pesar, pelo menos, 10 g de NIPAAm e dissolve-se o monómero em 400 ml de n-hexano a 60 ° C. Agita-se o recipiente periodicamente até à dissolução completa. Recristaliza-se a solução num congelador a -20 ° C durante 24 h.
- Remover o monómero cristalizado a partir de o filtro e recipiente de vácuo o n-hexano, utilizando um funil de Buchner. Colocar o monómero numa estufa de vácuo à temperatura ambiente durante 24 horas para remover qualquer remanescente n-hexano. Armazenar o monômero em um C congelador -20 ° para uso posterior (veja o passo 1.2).
- Pesar e dissolver 2,0 g de sulfato de condroitina em 8,0 ml de água desionizada. Aquecer lentamente a solução a 60 ° C.
- Ajustar o pH da solução a 10 utilizando cerca de 10 a 40 ul de 50% (w / w) de NaOH.
- Adicionar 0,298 ml de anidrido metacrílico (MA). Aquecer a refluxo durante 24 horas, enquanto se agitava a 60 ° C.
- Despeje 400 ml de solução de acetona em uma jarra e calafrio O / N em um C congelador -20 °.
- Após 24 h ter decorrido, lentamente verter a solução inteira CS metacrilado (MCS) em 400 ml de acetona fria, enquanto se agitava com uma barra de agitação magnética.
- Remover o MCS a partir da acetona e colocar o precipitado em um forno de vácuo. Execute esta etapa rapidamente para manter um estado intacto e coesa para MCS. Permitir que a acetona residual para evaporar sob vácuo durante pelo menos 24 h.
- Co-dissolver 10 g de NIPAAm purificado e 2,209 g de MCS em 232 ml de água desionizada.
- Purgar a solução de oxigênio usando gás nitrogênio inerte. Manter uma taxa de fluxo de gás vigorosa, ainda baixo para evitar que a solução borbulhando durante 15 minutos.
- Continuar purgar a solução com gás de azoto e adicionar 0,976 ml de tetramethylethylenediamine (TEMED).
- Em seguida, iniciar a reacção de polimerização por mistura de 97,6 mg de persulfato de amónio (APS).
- Misture a solução durante aproximadamente 20 segundos e rapidamente selar a solução para evitar qualquer entrada de ar no recipiente. Permitir que a solução para polimerizar sob luz fluorescente durante 24 horas.
- Depois de 24 horas, colocar o recipiente da reacção em um forno de 37 ° C. Permitir que o hidrogel para a transição do estado líquido para um estado semelhante a gel. Submergir o hidrogel polimerizado em 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante um total de 7 dias para permitir a difusão do monómero que não reagiu para fora do hidrogel.
- Usando uma tesoura, cortar o hidrogel em vários pedaços pequenos, não superiores a 5 cm de diâmetro. Para evitar que o hidrogel de transição de um estado semelhante a gel a um líquido, dados do polímero dentro da solução a 37 ° C de PBS. Transferir as porções 50 em tubos cónicos ml.
- Prepare as amostras para liofilização envolvendo os topos deos tubos com Kimwipes e elásticos. Congelar os tubos a -70 ° C durante 1 a 2 horas.
- Colocar os tubos cónicos no secador por congelação para remover toda a água a partir do hidrogel. Antes da operação, o secador por congelação necessita para alcançar uma temperatura e pressão de aproximadamente -40 ° C e 0,04 mbar, respectivamente. É necessário um mínimo de 7 dias para a secagem completa.
- Moer o liofilizado polímero em um pó fino e armazenar em um C geladeira a 4 ° para uso posterior (veja o passo 3.1).
2. O cálcio-alginato reticulado Micropartículas Síntese
- Prepara-se uma a 2% (w / v) de solução de alginato por dissolução de 400 mg em 20 ml de água desionizada. Aquece-se a solução para cerca de 60 ° C para facilitar a dissolução.
- Prepara-se uma a 2% (w / v) de solução de cloreto de cálcio por adição de 400 mg a 20 ml de água desionizada.
- Criar um óleo na mistura de água através da combinação de 100 ml de óleo de canola, 1,0 ml de Tween 20, e 20 mlde 2% (w / v) de alginato. Emulsionar-se a mistura durante 10 minutos com um homogeneizador a 15000 rpm. Além disso, misturar com uma barra de agitação magnética a 200 rpm ou 2.000 rpm para criar micropartículas grandes ou pequenas, respectivamente.
- Aspirar a 2% (w / v) de solução de cloreto de cálcio usando uma seringa com uma agulha 18 G ponta. Adiciona-se lentamente o cloreto de cálcio, gota a gota na emulsão.
- Uma vez que os 20 ml de cloreto de cálcio terem sido esgotados, permitir que as micropartículas no interior da emulsão para reticular durante 10 min.
- Distribuir uniformemente o lote de micropartículas cobertas em tubos de 50 ml e cónicos de centrifugação a uma força de 1400 xg durante 2 minutos para remover a camada inicial de óleo de canola.
- Consecutivamente lavagem, vortex, centrifugação e as micropartículas com isopropanol num total de três vezes a 1400 g durante 2 min para remover todo o óleo de canola residual. Descartar o sobrenadante isopropanol depois de cada passo de centrifugação e lava-se com isopropanol recente.
- Uma vez que o oiL foi removido, repetir o procedimento de lavagem mais três vezes com água desionizada para remover qualquer isopropanol residual. Descartar o sobrenadante água desionizada após cada passo de centrifugação e lava-se com água desionizada fresca. Retirar cerca de 100 mg de micropartículas molhadas e armazenar em um frasco. As micropartículas molhado será usado para medir o diâmetro médio do lote por microscopia de luz.
- Utilizando microscopia de luz, dispersar uma pequena amostra de micropartículas molhado em água desionizada numa lâmina de microscópio. Dependendo do tamanho das micropartículas, utilizar uma objectiva 10X ou 20X, e ajustar a abertura numérica até que as partículas entram em foco. Certifique-se de que o microscópio está calibrado para o objectivo correcto e ajustar a luminosidade da fonte de luz, conforme necessário. Usar uma ferramenta de linha para medir o diâmetro mais longo de 50 micropartículas de alginato aleatória e obter um tamanho médio para o lote.
- Preparar as micropartículas para liofilização by envolvendo-os com Kimwipes e prendendo-os com faixas de borracha. Congelar as micropartículas a -70 ° C durante 1 h.
- Coloque as micropartículas no liofilizador e permitir que a amostra secar durante pelo menos 24 h. Moer o congelamento micropartículas secas em um pó fino usando um almofariz e pilão e armazenar em um C geladeira a 4 ° para uso posterior (veja o passo 3.3).
3. Preparação dos adesivos
- Utilizando o pó de polímero secas por congelação, criar a 5% (w / v) de solução PNIPAAm-g-CS por dissolução de 50 mg de pó de hidrogel em 1 ml de PBS 1x.
- Misture a solução utilizando um vortex e frio num frigorífico a 4 ° C durante 24 h.
- Uma vez que as formas de soluções viscosas, criar uma composição homogénea através da adição de 25 ou 50 mg de liofilizado de micropartículas de alginato para a solução de hidrogel e vortex. Armazenar o compósito num frigorífico a 4 ° C para uso posterior (ver passos 4.3 e 4.8).
4. Bio-aderentes MechEnsaios de tração anical
- Antes de realizar ensaios de tração, extrair substrato cartilagem de uma orelha do suíno.
- Descongelar um ouvido suína em um ambiente aconchegante 0,9% (w / v) de NaCl; isso vai ajudar a soltar o tecido.
- Utilizando um bisturi, e isolar a secção fora, numa área plana rectangular, cortando verticalmente no entanto a camada epidérmica, tecido subcutâneo e cartilagem. Evitar cortar as cristas curvas da orelha porcino.
- Separa-se a camada epidérmica da pele a partir da cartilagem, cortando paralelo através do tecido subcutâneo. A cartilagem é um tecido duro, branco encontrado debaixo da pele de porco.
- Cuidadosamente raspar o tecido subcutâneo que está ligado à cartilagem, com o lado do bisturi. Evitar o corte no tecido da cartilagem com a lâmina de bisturi.
- Certifique-se de que apenas um dos lados da cartilagem está exposta e plana durante o ensaio de tracção. Se necessário, achatar a cartilagem cortando a pele irregular no lado de baixo.
- Cortar o tecido de cartilagem em vários pedaços com dimensões de 1 cm x 1 cm. Armazenar o tecido de cartilagem em tubos cónicos cheios com 0,9% (w / v) de solução de NaCl em um congelador a -20 ° C.
- Prepare 2,0 L de 0,9% (w / v) de solução de NaCl. Pré-aquecer a solução salina a 37 ° C. A temperatura desta solução terá de ser mantida durante todo o teste.
- Descongele a cartilagem congelado. Manter tanto a cartilagem suína e as amostras de hidrogel em um recipiente de isopor com pacotes de gelo.
- Anexar o medidor de força ao braço do suporte de teste. Coloque uma placa de aquecimento na parte superior do suporte de força e ajustar a temperatura a 50 ° C.
- Apor de 1 cm x 1 centímetro pedaço de cartilagem para o bloco de aço inoxidável com cola de cianoacrilato e um par de pinças. Cole uma peça adicional de cartilagem para o cilindro de Delrin e anexar o cilindro para o medidor de força. É muito importante que ambas as superfícies de cartilagem enfrentam-se e contactar o hidrogel.
- Lugaro banho de água Plexiglas em cima do prato quente e inserir o bloco de aço inoxidável com o substrato de cartilagem no interior do banho.
- Abaixe o braço da coluna de teste e alinhar ambos os substratos de cartilagem um com o outro. Levante o braço e deixar espaço suficiente para aplicar o hidrogel.
- Com uma pipeta de deslocamento positivo, dispensar 200 ul do hidrogel bioadesivo para a parte inferior da cartilagem.
- Abaixe o braço do suporte vigor a 1 mm / min até que os contatos de hidrogel a peça superior da cartilagem e exerce uma força de pré-carga de 0,001 N.
- Verter a solução salina 37 ° C no banho até que o volume atinja o nível de água designada. Verificar a temperatura da solução com um termopar.
- Permitir que o hidrogel a ser definido para um total de 5 minutos. Uma vez o gel solidificado, elevar o braço, a uma velocidade de 2 mm / min. O teste é concluído bioadesivo uma vez que o substrato se separa do da cartilagem ou quando uma queda significativa na força ocorre,sinalização falha.
- Recolher os dados gravados e levante o braço do suporte de teste. Remover o cilindro Delrin do medidor de força. Verter a solução salina em seu recipiente anterior e aquecer a 37 ° C.
- Calcular as tensões subtraindo-se a força exercida pelo polímero a partir da força de flutuação de um, o acessório Delrin "em branco" sem cartilagem ou adesivo, levantada na mesma taxa, e dividindo-se pela área de ligação.
5. Estudo Inchaço da PNIPAAm-g-CS com alginato micropartículas
- Prepare frascos de vidro limpo e rotulá-los de forma adequada com um ponto de tempo, tipo de amostra e número da amostra. Os adesivos também podem ser criadas, como descrito anteriormente. Preparar um total de cinco amostras (n = 5) para cada tipo de amostra por ponto de tempo.
- Pré-pesar todos os frascos de vidro e registar a sua massa inicial a RT.
- Usando uma seringa, dispensar aproximadamente 0,4 ml da amostra de adesivo preparada em cada um dos cinco frascos.Repita este passo para cada tipo de amostra em todos os pontos de tempo testados.
- Pesar e registar a massa de cada tubo de ensaio com o tipo de amostra de adesivo à TA.
- Pré-aquecer uma incubadora orbital e 1 L de solução de 1x PBS a 37 ° C.
- Organizar todos os frascos em um rack e inserir o rack na incubadora. Permitir que os adesivos para fazer a transição do estado líquido para um gel para cerca de 5 a 10 min.
- Adicionar 5,0 ml de 1x PBS a cada frasco. Certifique-se de adicionar cuidadosamente a solução PBS ao longo do lado do frasco para evitar que o disco de hidrogel de quebrar.
- Tapar cada frasco para evitar a evaporação da solução de PBS e manter a temperatura interna da incubadora a 37 ° C. Cada conjunto de discos de hidrogel terá de permanecer submersa em PBS durante um período de tempo designado.
- Uma vez que um ponto de tempo de sete dias foi atingido, uncap o conjunto de tubos de ensaio e remover a solução de PBS de cada frasco. Pesar cada frasco com a amostra de adesivo novamente à TA.
- Antes de realizar o ensaio vivo / morto com PNIPAAm-g-CS, crescem de rim embrionário humano (células 293 HEK-293) até 80% de confluência.
- Breve e descongelamento da suspensão de células HEK-293 congelada, colocando o frasco de congelação num banho de água a 37 ° C, depois centrifugar as células a 400 xg a 4 ° C durante 5 min num tubo de 15 ml.
- Para fazer com que o meio de crescimento celular primeira passagem, combinar em elevado teor de glucose (4,5 g / L) de Dulbecco meio de Eagle modificado (DMEM) com soro inactivado por calor fetal de bovino (FBS) a uma concentração final de 20% e a solução de penicilina-estreptomicina a 100x ( pen-strep) a uma concentração final de 100 UI / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Para todas as outras passagens, mudar para DMEM com 10% de FBS e 1x pen-strep.
- Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio de crescimento e transferir a suspensão para um prato de 100 milímetros de diâmetro de petri. uniformemente distribute as células inclinando levemente a frente prato para trás e esquerda para a direita algumas vezes cada sentido.
- Cultura das células numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. Se for necessário, alterar o meio de dois em dois dias.
- Quando as células atingem a confluência de 80%, a cultura replicar em pratos múltiplos. Remover o meio a partir da placa.
- Adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina para a placa. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C durante 10 min. Verifique para ver se as células separar da superfície rodando suavemente a placa.
- Para dividir a cultura 1:10, adicionar 9 ml de meio de crescimento normal (DMEM com FBS a 10%) para as células tratadas com tripsina e misturar suavemente, inclinando o prato.
- Pipetar 1 mL da suspensão diluída de células em cada novo prato e adicionar 9 ml de meio de crescimento. Misture suavemente, inclinando o prato.
- Cultura das células numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. Se necessário, altere o meio cada vezY dois dias até as células atingem a confluência de 80%.
- Remova a mídia a partir de duas placas de cultura cultivados a 80% de confluência.
- Adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina a cada placa. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C durante 10 min. Verifique para ver se as células separar da superfície rodando suavemente a placa.
- Lavam-se as células HEK-293 sobre a placa com 3 ml de meio de crescimento e duas vezes adicionar ambas as suspensões para o mesmo tubo de 15 ml.
- Centrifuga-se o tubo de 15 ml durante 10 minutos a 400 xg, a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de meio por pipetagem para cima e para baixo.
- Pipetar 10 ul da suspensão de células em um hemocitómetro e executar uma contagem de células para determinar a densidade celular. Aumentar o volume de suspensão de forma, se a concentração de células inicial é demasiado elevada, e por outro lado diminuir o volume, se a concentração for demasiado baixa, a fim de preservar uma concent alvoração de 1 x 10 6 células / ml. Centrifugar as células HEK-293 a 400 xg e ressuspender o pellet celular no volume corrigido dos meios de comunicação em conformidade.
- Suavemente vortex a suspensão de células e distribuir uniformemente a mistura de células em quatro tubos de 15 ml cónicas distintas para as seguintes condições de ensaio: monocamada de controlo positivo, de controlo morto negativo em PNIPAAm-g-CS utilizando 70% (v / v) de metanol, HEK-293 células encapsuladas em PNIPAAm-g-CS, e células HEK-293 encapsulados no PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato.
- Criar monocamadas de controlo positivo por pipetagem múltipla 300 volumes ul da mistura de células para uma placa de 24 poços para gerar 4-6 amostras replicadas.
- Remova a mídia dos tubos cônicos referentes ao controle de mortos, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato.
- Centrifugar os tubos cónicos durante 5 minutos a 400 x g e eliminar o sobrenadante.
- Manter a mesma concentração de células por ressuspensão do cells no mesmo volume de PNIPAAm-g-CS como a mídia removida. Pipeta a mistura de células de polímero cima e para baixo com uma pipeta sorológica até à homogeneidade.
- Se a sementeira com micropartículas de alginato, transferir a suspensão de células-CS PNIPAAm g (obtida tal como descrito para o 6.10.2) para um prato de cultura de 35 mm e introduzir as partículas na mistura. Pipeta a mistura célula para cima e para baixo com uma pipeta sorológica até à homogeneidade.
- Utilizando a pipeta serológica, dispensar múltiplos 300 ul da mistura de polímero de células em cada um dos alvéolos para controlo morto, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato para gerar 4 - 6 amostras em replicado.
- Incubar a placa a 37 ° C durante 10 a 15 min e permitir que o PNIPAAm-g-CS para a transição de líquido para gel (o polímero forma um disco opaco, branco).
- Posicionar uma lâmina mais quente na capa e ajustar a temperatura para 37 ° C. Utilizar a corrediça mais quente para manter a placa bemtemperatura e pipeta de 600 uL de meio de pré-aquecido a cada poço. Para evitar ainda mais a transição do polímero para um estado líquido, posicionar uma lâmpada fluorescente com uma lâmpada acima do prato para aquecer o ar acima dela.
- Incubam-se as células durante 5 dias a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Depois de decorridos cinco dias, preparar a mistura de corante Live / Morto usando homodímero de etídio (EthD-1) e calceína AM. Ambas as substâncias são sensíveis à luz e preparada no dia de uso.
- Descongelar o AM de calceína e EthD-1 a partir do kit de RT.
- Adicionar 5 ml de estéril 1x PBS para um tubo cônico e envolvê-la em papel alumínio.
- Adicionar 6,67 mL de EthD-1 2 mM ao tubo cónico. Vortex da mistura solução completamente.
- Em seguida, adicione 2,5 mL de calceína AM 4 mM ao tubo cônico. Vortex a mistura minuciosamente.
- Remova a mídia dos poços da monocamada (controle positivo), PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS with micropartículas de alginato. Lave todos os poços cuidadosamente, mas suavemente, com PBS e remover o PBS.
- Permita que os discos de hidrogel contendo micropartículas de alginato para liquefazer à TA e adicionar 2 ml de citrato de sódio 50 mM a cada um dos poços.
- Remova a mídia dos poços de células mortas (controle negativo). Permita que os discos de hidrogel para liquefazer à TA e adicionar 300 ul de 70% (v / v) de metanol a cada cavidade.
- Incubar a placa durante 45 minutos a 37 ° C.
- Remover o citrato de sódio e soluções de metanol a partir dos poços e pipeta de cada uma das suspensões de hidrogel em tubos de microcentrífuga individuais. Centrifugar os tubos a 2000 x g durante 10 minutos para separar as células a partir da suspensão de hidrogel.
- Cuidadosamente remover a suspensão pipetando a solução a partir do tubo cónico e deixando para trás o sedimento celular. Ressuspender o sedimento em 300 ul de PBS e transferir para a placa de poço original.
- Adicione 300 ml de tele Live / mistura de corante Morto para cada um dos poços. Enrole a placa bem em folha de alumínio e incubar durante 45 min num agitador à temperatura ambiente.
- Imagem todas as amostras sob um microscópio de fluorescência invertido com uma objetiva de 10X. As células vivas e células mortas irá apresentar uma fluorescência verde e vermelho, respectivamente.
7. A viabilidade celular utilizando um ensaio quantitativo de XTT
- Crescer as células HEK-293 a 80% de confluência. Remover o meio de crescimento a partir de duas placas de cultura.
- Adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina a cada placa. Permitir que as placas a incubar a 37 ° C durante 10 min. Verifique para ver se as células separar da superfície rodando suavemente a placa.
- Lavam-se as células HEK-293 sobre a placa com 3 ml de meio duas vezes e adicionar ambas as suspensões para o mesmo tubo de 15 ml.
- Centrifuga-se o tubo de 15 ml durante 10 minutos a 400 xg, a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de meiospipetando cima e para baixo.
- Pipetar 10 ul da suspensão de células em um hemocitómetro e executar uma contagem de células para determinar a densidade celular. Como descrito anteriormente, preservar uma concentração alvo de 1 x 10 6 células / ml. Centrifugar as células HEK-293 a 400 xg e ressuspender o pellet celular no volume corrigido dos meios de comunicação em conformidade.
- Suavemente vortex a suspensão de células e distribuir uniformemente a mistura de células em quatro tubos de 15 ml cónicas distintas para as seguintes condições de ensaio: monocamada de controlo positivo, de controlo morto negativo em PNIPAAm-g-CS utilizando 70% (v / v) de metanol, HEK-293 células encapsuladas em PNIPAAm-g-CS, e células HEK-293 encapsulados no PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato.
- Criar monocamadas de controlo positivo por pipetagem de 300 ul da mistura de células para uma placa de 24 poços para gerar 4 - 6 amostras em replicado.
- Remova a mídia dos tubos cônicos referentes ao controle de mortos, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato.
- Centrifugar os tubos cónicos durante 5 min a 400 x g e eliminar o sobrenadante.
- Manter a mesma concentração de células por ressuspensão das células no mesmo volume de PNIPAAm-g-CS como os meios de comunicação removido. Pipeta a mistura célula para cima e para baixo com uma pipeta sorológica até à homogeneidade.
- Se a sementeira com micropartículas de alginato, transferir a suspensão de células-CS PNIPAAm g num prato de cultura de 35 mm e introduzir as partículas na mistura. Pipeta a mistura célula para cima e para baixo com uma pipeta sorológica até à homogeneidade.
- Utilizando a pipeta serológica, dispensar 300 ul da mistura de polímero de células em cada um dos alvéolos para controlo morto, PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato para gerar 4 - 6 amostras em replicado.
- Depois de todas as amostras contendo as células foram adicionados à placa de 24 poços, dispensar múltiplos volumes de 300 ul de PNIPAAm-g-CS e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato sem células em poços adjacentes para gerar 4 - 6 amostras idênticas.
- Incubar a placa de 24 poços a 37 ° C durante 10 a 15 min e permitir que o PNIPAAm-g-CS para a transição de líquido para gel (o polímero forma um disco opaco, branco).
- Posicionar uma lâmina mais quente na capa e ajustar a temperatura para 37 ° C. Utilizar a corrediça mais quente para manter assim a temperatura da placa de pipeta e 600 ul de DMEM clara pré-aquecido a cada poço. Para evitar ainda mais a transição do polímero para um estado líquido, posicionar uma lâmpada fluorescente com uma lâmpada acima do prato para aquecer o ar acima dela.
- Incubam-se as células durante 5 dias a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Depois de decorridos cinco dias, preparar o 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida reagente (XTT) a partir do fabricante. O reagente XTT é sensível à luz e preparado no dia da utilização.
- Retirar a garrafa âmbar contêmção do pó de XTT a partir do frigorífico. Usando uma seringa e uma agulha estéril, injectar 5 ml de DMEM claro (sem vermelho de fenol), através do septo de borracha para a garrafa âmbar.
- Aquecer o reagente a 56 ° C num banho de água durante 10 minutos ou até se dissolver.
- Diluir o reagente XTT a 20% (v / v) num tubo cónico de 15 ml envolvido em folha de alumínio. Alíquota o excesso de reagente XTT em tubos de microcentrífuga e colocá-los no congelador a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Remover os meios de comunicação a partir de poços com células mortas (controlo negativo) e adicionar 300 ul de 70% (v / v) de metanol a cada cavidade. Incubar durante 45 min a 37 ° C e remover o metanol a partir dos poços.
- Remova a mídia dos poços restantes da monocamada (controle positivo), PNIPAAm-g-CS, e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato. Lave todos os poços completamente, mas com cuidado, com PBS e em seguida, remover o PBS.
- Adicionar 300 ul da 20% de reagente XTT a cada um dos poços. Envolva a placa de 24 poços com folha de alumínio e incuba-se durante 24 horas num agitador à temperatura ambiente.
- Após 24 horas, adicionar 200 ul de citrato de sódio 50 mM a todos os poços e incubar no agitador durante uma hora adicional.
- Transfira a totalidade do suspensões de polímero para tubos de microcentrifugação e centrifugar a 2000 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Transferir 200 ul do sobrenadante de cada tubo de microcentrífuga para uma placa de 96 poços. Utilizando um leitor de placa de microtitulação, obter as leituras de absorvância específicas a 450 nm de absorvância leituras e não específicas a 690 nm.
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Representative Results
Um co-polímero enxertado de resposta térmica foi sintetizado com sucesso e caracterizado pela sua força bioadesiva, propriedades de intumescimento, e em citocompatibilidade vitro. Nós escolhemos para investigar alginato devido às suas propriedades mucoadesivas bem estabelecidos. As micropartículas de alginato, com um diâmetro médio de 59,7 ± 14,9 uM, foram misturados com 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS, em concentrações de 25, 50, e 75 mg / ml. Estas concentrações foram baseados em uma-metade, igual a, e duas vezes o peso seco equivalente de PNIPAAm-g-CS em solução aquosa. As concentrações de micropartículas superiores a 75 mg / ml apresentaram viscosidade excessiva e não foram investigados. A resistência à tracção máxima de adesivo de 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS com várias concentrações de micropartículas de alginato foram comparados com o hidrogel sozinho. A adição de 50 ou 75 mg / mL de micropartículas de alginato suspenso em 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS resultou em um de quatro vezes IncRease da resistência à tracção (p <0,05), como se mostra na Figura 1. A concentração de micropartículas de 25 mg / ml não mostrou um aumento significativo na resistência à tracção em comparação com 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). Não houve alteração significativa na resistência à tracção de 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS, quando a concentração de micropartículas de alginato foi aumentada de 50 a 75 mg / ml (p> 0,05).
As propriedades de inchamento do hidrogel bioadesivo foram caracterizados por imersão de várias formulações em PBS a 37 ° C. As concentrações de micropartículas de alginato de 25 e 50 mg / ml foram testados para identificar quaisquer diferenças de comportamento inchaço. As micropartículas de alginato foram medidos usando microscopia de luz e tinha um diâmetro médio de 25,0 ± 14,4 uM. Após 7 dias, a massa húmida inicial e final dos discos de hidrogel foram gravados e uma alteração na massa foi calculada para várias amostras por formulatio adesivan (n = 5). A Figura 2 mostra uma diferença drástica na mudança em massa entre todas as formulações. Os adesivos contendo ambos 25 e 50 mg / mL de micropartículas de alginato demonstraram alterações positivas em massa, enquanto que 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS diminuiu em massa. Todas as amostras foram consideradas significativamente diferentes umas das outras (p <0,05) com o adesivo contendo 50 mg / mL de micropartículas de alginato que mostram o maior efeito de inchamento.
A biocompatibilidade do adesivo proposto foi investigada tanto qualitativamente como quantitativamente, através da utilização de um ensaio vivo / morto e citotoxicidade XTT. As células HEK-293 foram encapsuladas em ambos a 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS e 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS contendo 50 mg / mL de micropartículas de alginato com um diâmetro médio de 59,7 ± 14,9 uM . Uma monocamada de células e células encapsuladas em PNIPAAm-g-CS mortas com 70% de metanol foram considerados positivo e Negativa controlos, respectivamente. Formulações semeadas com células foram caracterizados depois de 5 dias de crescimento num incubador humidificado a 37 ° C com 5% de CO 2. Cada teste indicaram boa viabilidade celular tanto para PNIPAAm-g-CS e PNIPAAm-g-CS com micropartículas. Imagens da Figura 3 ilustram as células vivas fluorescentes verdes em ambas as formulações adesivas (painéis A e B) e a monocamada de células, que serve como o controlo positivo (Painel C). células mortas (Painel D) fluorescência uma cor vermelha e mostrar a morte celular. Os resultados dos testes de citotoxicidade XTT confirmou os resultados do ensaio vivo / morto. A viabilidade celular relativa do adesivo contendo 50 mg / mL de micropartículas diminuiu 1,3 vezes em comparação com PNIPAAm-g-CS, tal como ilustrado na Figura 4, mas a diminuição não foi estatisticamente significativa (p> 0,05). Ambos PNIPAAm-g-CS e PNIPAAm-g-CS com micropartículas também tinha viabilidade comparável à monocamada de células (p> 0,05). células encapsuladas em hydrogel formulações e a monocamada de células foram consideradas significativamente diferentes em comparação com o controlo negativo (p <0,05). No geral, estes resultados sugerem que o adesivo contendo micropartículas não só exibe um aumento da força adesiva, mas boa biocompatibilidade bem.
Figura 1. Os efeitos sobre a força de tracção após a incorporação de concentrações variáveis de alginato de micropartículas em 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS. A resistência à tracção de PNIPAAm-g-CS quadruplicado com a adição de 50 ou 75 mg / mL de micropartículas de alginato (p <0,5). As barras de erro representam um intervalo calculado de confiança de 95% (n = 5). As micropartículas de alginato tinha um tamanho médio de 59,7 ± 14,9 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O efeito de várias concentrações de alginato de micropartículas sobre a capacidade de inchamento de 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS. Após 7 dias de imersão em 37 ° C de PBS, PNIPAAm-g-CS diminuiu em massa húmida devido as propriedades hidrofóbicas de PNIPAAm acima da TCIS. PNIPAAm-g-CS com 25 ou 50 mg / mL de micropartículas de alginato exibiram capacidade de inchamento. O aumento da concentração de micropartículas aumentada significativamente (p <0,05) da variação da massa do hidrogel ao longo de 7 dias, atribuída a absorção de água. As barras de erro representam um intervalo de confiança de 95% calculado. As micropartículas de alginato tinha um tamanho médio de 25,0 ± 14,4 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Representante vivo / morto Imagens de fluorescência das células em cultura células HEK-293 durante um período de 5 dias. As células foram encapsuladas em (A) PNIPAAm-g-CS e (B) PNIPAAm-g-CS com 50 mg / ml de alginato micropartículas. As células também foram cultivadas em (C) monocamada e (D) matou-se com metanol em PNIPAAm-g-CS para representar um controlo positivo e negativo, respectivamente. O experimento vivo / morto viabilidade foi repetido três vezes com três repetições por experiência. As barras de escala representam 100 um. As micropartículas de alginato tinha um tamanho médio de 59,7 ± 14,9 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. Viabilidade de Curto Prazo de Células HEK-293 em PNIPAAm-g-CS com alginato micropartículas. A sobrevivência de células HEK-293 encapsulados no interior PNIPAAm-g-CS com e sem micropartículas de alginato foi avaliado e comparado utilizando XTT após 5 dias. Uma monocamada de células e células encapsuladas em PNIPAAm-g-CS mortas com 70% de metanol foram utilizados como controlos positivos e negativos, respectivamente. Ambos PNIPAAm-g-CS e PNIPAAm-g-CS com micropartículas de alginato não mostrou redução significativa (p> 0,05) na viabilidade celular em comparação com a monocamada de células, no entanto, mostraram uma redução significativa (p <0,05) na viabilidade celular em comparação com o matado células. A adição de micropartículas de alginato não comprometa significativamente a viabilidade celular de PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). As barras de erro representam um intervalo de confiança de 95% calculado (n = 3, seis repetições por ensaio). As micropartículas de alginato tinha um tamanho médio de 59,7 ± 14,9 uM.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há vários passos críticos em sintetizar o composto hidrogel-micropartículas e avaliar a sua força adesiva, inchaço capacidade e biocompatibilidade celular. polimerização de radical livre de PNIPAAm-g-CS requer metacrila��o bem sucedida de sulfato de condroitina, a dissolução completa dos componentes de monómero, e das condições de reacção sem oxigénio. A razão de monómero para NIPAAm sulfato de condroitina metacrilado na mistura de reacção foi escolhida porque foi demonstrado, no nosso trabalho anterior, para gerar copolímeros com propriedades mecânicas semelhantes às do tecido nativo intervertebral disco 29. Aumentando a quantidade de sulfato de condroitina no hidrogel irá reduzir a perda de água durante a gelificação e, assim, diminuir a rigidez à compressão do gel. O grau seleccionado de metacrila��o também foi demonstrada para produzir hidrogeles com propriedades de manipulação favorável para a injectabilidade através de uma agulha 18 G quando dissolvido numa solução aquosa <sup> 29. Um aumento do grau de substituição do metacrilato de CS irá aumentar a densidade de reticulação da rede de polímero, causando um aumento da viscosidade da solução abaixo da TCIS e reduzindo a capacidade de inchamento em gel. Outros têm investigado diferentes abordagens na síntese de hidrogéis de PNIPAAm tais como transferência de átomos de polimerização radical (ATRP) 35 ou reverter adição-fragmentação de transferência de cadeia (RAFT) 36. Polimerização via ATRP tem levado ao desenvolvimento de estreitos polidispersos, hidrogéis com peso molecular sintonizado multado alterando o monómero para iniciador proporção. Os grupos funcionais podem ser enxertadas em uma forma tipo pente usando RAFT polimerização, influenciando assim o emaranhamento da cadeia de polímero e a separação de fases.
Uma mistura homogénea de água-em-óleo é necessário na criação de uniformes, micropartículas de alginato de ligação cruzada. Uma técnica de emulsão é simples de executar e não requer a utilização de produtos químicos perigosos, no entanto ambas as micropaArtigo forma e distribuição são difíceis de controlar. tamanho das micropartículas pode ser alterada através do aumento da velocidade de agitação da emulsão, criando, assim, as partículas mais pequenas e vice-versa. Neste estudo particular, o tamanho das micropartículas de alginato foi investigada como uma propriedade potencial que possa ter impacto inchaço, mecânica, ou viabilidade celular. A dispersão de luz também pode ser usado como uma alternativa para medir o tamanho médio das micropartículas. Outras propriedades de emulsão, tais como o agente tensioactivo do tipo e concentração de alginato terá impacto sobre o tamanho das micropartículas e a formação de agregados 37. Diminuir a concentração de alginato irá reduzir o tamanho das micropartículas, contudo agregados são mais susceptíveis de formar. Variações na natureza hidrofílica e hidrofóbica dos agentes de superfície irá afectar a tensão de superfície entre as fases de óleo e de água, por conseguinte, alterar o tamanho da gotícula dentro da emulsão. As micropartículas de alginato podem, alternativamente, ser produzidas usando um dispositivo de microfluidos, que permite particl uniformee forma e distribuição de tamanho estreita 38. Esta técnica envolve a dispersão de uma fase de alginato dentro de uma fase de óleo contínua que flui através de um canal e entra em um banho de cloreto de cálcio. Pulverizador draying é outra técnica que produz muito pequenas micropartículas 39. É também importante notar que o alginato pode ser carregado com as proteínas ou factores de crescimento e pode ser reticulado com outros iões divalentes, tais como zinco ou bário.
Neste trabalho, caracterizamos um sistema adesivo com potenciais aplicações em engenharia de tecidos. Nosso teste de tração visa especificamente para quantificar a força de aderência do compósito quando em contato com a cartilagem porcina. Este tipo de substrato foi seleccionado para imitar a aderência do compósito de hidrogel para as placas de extremidade da cartilagem do disco intervertebral. Outros substratos de tecidos, tais como pele de porco, pode ser usado como uma alternativa para quantificar a força de um adesivo 40, mas o tipo de tecido vaivariar dependendo da aplicação a que se destina. Manter o controle de temperatura adequada do banho de água salina e pré-arrefecimento do compósito antes da utilização são cruciais para medir com precisão as propriedades mecânicas. temperaturas do banho de água elevada, acima de 37 ° C fará com que o hidrogel a encolher e endurecer rapidamente, enquanto que compostos que são mecanicamente testadas abaixo de 37 ° C irá exibem diminuição da resistência à tracção devido à falta de separação de fases. Atualmente, estamos desenvolvendo métodos para investigar a força de aderência ao corte de várias formulações adesivas injetáveis. O trabalho futuro vai incluir a realização de ensaios mecânicos ex vivo com IVDs suíno para determinar se o adesivo resiste à extrusão através de um defeito anelar e restaura a funcionalidade biomecânico para o segmento de movimento vertebral.
Acima de 32 ° C, PNIPAAm-g-CS encolhe e expele a água a partir da matriz de hidrogel devido ao comportamento de PNIPAAm TCIS, resultando numa diminuição da massa sobreum período de 7 dias em PBS (Figura 2). Por outro lado, a adição de micropartículas de alginato confere um efeito de inchaço e o adesivo aumentou significativamente em massa (p <0,05) a uma concentração de micropartículas de 25 mg / m e ainda mais de modo a 50 mg / ml. Neste estudo o inchamento, as alterações na massa húmida do hidrogel são provavelmente atribuíveis a troca de água com o ambiente, uma vez que PNIPAAm-g-CS tem sido mostrado para ser selectivamente degradável na presença de enzimas 29. Muitos dos passos protocolo desenvolvido para o estudo de volume, foram adaptados com base na termorreversibilidade de PNIPAAm-g-CS. Os discos de hidrogel deve transição completa a 37 ° C antes da adição da solução pré-aquecida de PBS, de outra forma o gel vai dispersar. Depois de inchaço durante uma semana, a solução de PBS deve ser rápida e cuidadosamente removidos dos frascos antes de os hidrogéis reverter para um estado do tipo líquido. Deve notar-se que o protocolo de inchaço descrito neste documento não totalmente simular ono ambiente vivo do IVD nativa. As propriedades de inchamento do andaime in vivo vai depender da pressão osmótica dos tecidos circundantes 41 e comportamento de degradação do gel. No entanto, em geral, o aumento da capacidade de inchamento com a incorporação de micropartículas de alginato é considerado favorável, uma vez que irá ajudar o hidrogel injectável para ficar espaço de enchimento à temperatura fisiológica. Características como o inchaço conteúdo relação e água pode ser calculada com medidas adicionais de massa seca. Estudos de inchamento futuras irá incluir a imersão discos de hidrogel de encontro a um polietileno glicol (PM = 20000 g / mol) de banho, o que irá aplicar uma pressão osmótica e simular o ambiente in vivo do IVD.
Além das propriedades mecânicas e inchaço, o adesivo deve apresentar biocompatibilidade celular, a fim de ser considerada como uma estrutura de suporte adequada. Estudos anteriores demonstraram a sobrevivência de encapsulacélulas ted em alginato de 42,43 e baseados em PNIPAAm materiais 44,45. Os resultados de ambos os ensaios ao vivo / morto e XTT são consistentes com estes resultados anteriores, sugerindo a viabilidade celular adequada ao longo de um período de 5 dias (Figuras 3 e 4). Nosso laboratório também tem realizado investigações preliminares de viabilidade ao longo de um curso de tempo mais longo (21 dias) e observaram comportamento semelhante. Em geral, um excedente de PNIPAAm-g-CS e micropartículas devem estar preparados para explicar qualquer perda de material durante as transferências de pipeta. Mais uma vez, é extremamente crítico para preservar a arquitectura de andaime através da manutenção de condições de temperatura adequadas, a 37 ° C. Se a rede de andaime reverte a partir de um gel para o estado líquido semelhante, a ligação de células e viabilidade pode ficar comprometida. No que diz respeito ao ensaio vivo / morto, citrato de sódio desempenha um papel importante na remoção e desconstrução de micropartículas de alginato. O citrato de sódio inverte a acção de ligação cruzada entre CalciUM e alginato e faz com que uma pasta para formar 46. lavagens adicionais com PBS para remover PNIPAAm-g-CS ou alginato podem ser realizados para melhorar a qualidade das imagens. Durante o ensaio de XTT, amostras de polímeros que não contenham as células são criadas dentro das placas de poços. Essas repetições servir como padrões em branco e são obrigados a calcular um valor de absorção precisas. Nossos estudos preliminares de viabilidade são estritamente baseada na utilização de células HEK-293. Em estudos posteriores, a diferenciação de células estaminais mesenquimais derivadas de tecido adiposo encapsuladas (AD-MSC) em células núcleo pulposo será demonstrado. Diferenciação AD-MSC em direção fenótipo NP-como tem sido demonstrado por meio de compressão dinâmica 47 e hipóxia 48,49.
Em geral, o adesivo proposto demonstra promessa para aplicações de engenharia de tecidos em áreas de suporte de carga, tais como o disco intervertebral, em que o sucesso da estratégia de regeneração irá depender da capacidade de andaime a resist deslocamento durante o movimento e carregamento. Este sistema é muito versátil na medida em que poderiam potencialmente ser adaptado para libertar proteínas da matriz extracelular ou factores de crescimento específicos para a aplicação desejada. Mais importante, os métodos aqui descritos podem ser adaptados a qualquer estudo de caracterização com polímeros termogelificantes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer com gratidão a ajuda do Dr. Jennifer Kadlowec no desenvolvimento do protocolo de ensaio de tração adesivo.
Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e doenças osteomusculares e de pele e do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número 1R15 AR 063920-01. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized | Acros Organics | 2210-25-5 | Refrigerate and remove stabilier with hexane |
| Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) | Sigma-Aldrich | 39455-18-0 | Refrigerate |
| Hexanes | Fisher Scientific | H302-4 | Store in a flammable cabinet |
| 50% (w/w) sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS254-1 | Caustic in nature |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | Strong fumes; use in a fume hood |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | Chill in a refrigerator prior to use |
| Nitrogen Gas | Praxair | 7727-37-9 | Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas) |
| Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure | Acros Organics | 110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | Hygroscopic and degrades in the presence of water |
| Phosphate buffered saline tablets | Fisher Scientific | BP2944 | Keep dry |
| Alginic acid, sodium salt | Acros Organics | 177775000 | Use heat to aid in dissolving |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79 | |
| Canola oil | Local store | Obtain from a local store | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 93773 | |
| 70% (v/v) Isopropoanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Porcine ears | Haine's Pork Shop | Obtain from a local butcher | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Human embryonic kidney 293 cells | ATCC | ATCC CRL-1573 | Store in liquid nitrogen for long-term use |
| DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate | Life Technologies | 11965126 | Refrigerate |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-147 | Refrigerate |
| Penn Strep: 10,000 U/ml | Life Technologies | 15140-122 | Refrigerate |
| Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x | Life Technologies | 15400-054 | Refrigerate |
| Methanol | VWR | AAA44571-K7 | |
| Live/Dead Cell viability kit | Life Technologies | L3224 | Light sensitive, keep frozen |
| XTT cell viability kit | Sigma Aldrich | TOX2-1KT | Light sensitive, keep frozen |
| Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol | Life Technologies | 21063-029 | Refrigerate |
| Dulbecco's PBS: 1x | Life Technologies | 14190136 | Refrigerate |
| Sodium citrate | EMD | SX0445-1 | |
| Positive displacement pipette | BrandTech Scientific, INC | 2702904 | Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips |
| No 3. Stainless Steel scalpel handle | Sigma Aldrich | S2896 | |
| Miltex sterile surgical blades | Fisher Scientific | 12-460-440 | Size 10 |
| Power gem homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-660 | Model # 125 |
| Porcelain mortar and pestle | Sigma Aldrich | Z247464 | Holds 50 ml |
| FreeZone 1 L benchtop freeze dry system | Labconco | 7740020 | Freeze samples prior to use |
| Oil sealed rotary vane pump | Edwards | A65301906 | Model # RV5 |
| Incubating orbital shaker | VWR | 12620-946 | Model # 980153 |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Forma Scientific, INC | Model # 5682 | |
| Heated ovens | VWR | Model # 1235PC | |
| 2 N force gauge | Shimpo | FGV-0.5XY | Model # FGV-0.5XY |
| E-force test stand | Shimpo | FGS-200PV | Model # FGS-200PV |
| Tissue culture swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | Model #6S-6KR |
| Tissue culture microcentrifuge | Eppendorf | Model #5415C | |
| Hemacytometer set | Hausser Scientific | 3720 | Requires replacement cover glass slips |
| Slide warmer | Lab Scientific | XH-2022 | Model # XH-2002 |
| Portable heating lamp | Underwriters Laboratories | Helps to maintain polymer temperature at 37 °C | |
| Inverted fluorescent microscope | Zeiss | Model Axiovert 25 CFL | |
| Heated water bath | VWR | Model # 1235PC | |
| Rocking platform | VWR | Series 100 | |
| Multiskan FC microtiter plate reader | Thermo Scientific | Type 357 | |
| Cell culture incubator | VWR | Model # 2350T | |
| Purifier class II biosafety cabinet | Labconco | Delta Series |
References
- Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
- Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
- Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
- Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
- Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
- Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
- Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
- Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
- Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
- Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
- Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
- Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
- Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
- Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
- Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
- Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
- Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
- Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
- Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
- Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
- Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
- Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
- Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
- Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
- Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
- Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
- Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
- Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
- Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
- Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
- Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
- Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
- Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
- Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
- Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
- Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
- Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
- Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
- Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
- Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
- Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
- Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
- Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
- Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
- Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
- Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
- Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).
