Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntes av värmegelande Poly (N-isopropylakrylamid) -graft-kondroitinsulfat Composites med alginatmikropartiklar för Tissue Engineering

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

En injicerbar vävnadsteknik scaffold sammansatt av poly (N-isopropylakrylamid) -graft-kondroitinsulfat (PNIPAAm-g-CS) -innehållande alginatmikropartiklar framställdes. Vidhäftningsstyrkan, svullnad egenskaper och in vitro biokompatibilitet analyseras i denna studie. Karakteriseringen tekniker som utvecklats här kan tillämpas på andra värmegelande system.

Abstract

Injicerbara biomaterial definieras som implanterbara material som kan införas i kroppen som en vätska och stelna in situ. Sådana material ger de kliniska fördelarna av att vara implanterade minimalt invasivt och enkelt bildar utrymmesfyllande fasta ämnen i oregelbundet formade defekter. Injicerbara biomaterial har allmänt undersökts som ställningar för vävnadsteknik. Men för reparation av vissa bärande områden i kroppen, såsom mellankotskivan, byggnadsställningar bör ha limegenskaper. Detta kommer att minimera risken för förskjutning under rörelse och säkerställa intim kontakt med den omgivande vävnaden, vilket ger tillräcklig kraftöverföring. Här beskriver vi framställning och karakterisering av en byggnadsställning som består av värmekänsligt poly (N-isopropylakrylamid) -graft-kondroitinsulfat (PNIPAAM-g-CS) och alginatmikropartiklar. Den PNIPAAm-g-CS-sampolymeren bildar en viskös lösning i vatten vid RT, i vilken alginate partiklarna är suspenderade för att förbättra vidhäftningen. Ovanför den undre kritiska lösningstemperaturen (LCST), omkring 30 ° C, bildar sampolymeren en fast gel runt mikropartiklarna. Vi har anpassat standard biomaterial karakteriseringsförfaranden för att ta hänsyn till den reversibla fasövergången för PNIPAAm-g-CS. Resultaten tyder på att införlivandet av 50 eller 75 mg / ml alginat partiklar till 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS lösningar fyrdubbla den adhesiva draghållfasthet av PNIPAAm-GCS ensamt (p <0,05). Införlivandet av alginatmikropartiklar också avsevärt ökar svällningsförmåga av PNIPAAm-g-CS (p <0,05), bidrar till att upprätthålla en rymdfyllande gel inom vävnadsdefekter. Slutligen resultaten av in vitro-toxikologi analyssats, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-karboxanilid (XTT) och Live / Dead viabilitetsanalys indikerar att lim är i stånd att stödja överlevnad och spridning av inkapslat humana embryonala njur (HEK) 293 calnar över 5 dagar.

Introduction

Injicerbara biomaterial är sådana som kan lämpligen administreras in i kroppen som en vätska och stelna in situ. Sådana material har tillämpats i stor utsträckning i regenerativ medicin, där de används för att leverera inkapslade cellerna till det påverkade området 1-4 och fungera som en tre-dimensionell temporär extracellulär matrix för cellerna 5. För patienten, injicerbara biomaterial är fördelaktiga eftersom de kirurgiska procedurer för implantation är minimalt invasiva och den fasta fasen kan fylla oregelbundet formad vävnadsdefekter, vilket eliminerar behovet av specialstorlek implantat.

Inmatnings kan åstadkommas genom en mängd olika mekanismer. Externa faktorer, som pH, har undersökts som en utlösande faktor för bildandet av geler som kapslar in celler och bioaktiva molekyler 6-8. Dock kan pH inte vara det mest bekväma avtryckaren för att använda i alla fysiologiska miljöer. En annan traditionell alternativ för att uppnå inmatnings använder in situ kemisk polymerisation eller tvärbindning. En grupp utvecklade en vattenlöslig redoxsystem bestående av ammoniumpersulfat och N, N, N ', N-tetrametyletylendiamin och använde den för reaktion makromerer sammansatta av polyetylenglykol och poly (propylen) glykol 9,10. Zan et al. 11 utvecklade injicerbara kitosan polyvinylalkohol nätverk tvärbunden med glutaraldehyd. I sådana system måste cytotoxiciteten av reaktiva komponenter övervägas, särskilt för tillämpningar som innefattar cellinkapsling. Dessutom kan exotermisk polymerisation producera tillräckligt höga temperaturer för att kompromissa omgivande vävnad, vilket har rapporterats för polymer bencement 12,13.

Ytterligare andra injicerbara polymersystem har utvecklats som uppvisar en förändring från flytande till fast tillstånd med temperaturen som utlösare. Känd som värmegelande system, dessa är aqueooss polymerlösningar som inte kräver kemiska stimulus, monomerer eller tvärbindningsmedel för att uppnå in situ-bildning 14. Snarare, en fasövergång vanligtvis uppstår i närheten av fysiologisk temperatur inducerar bildningen av ett fysikaliskt tvärbundet tredimensionellt nätverk. Poloxamerer såsom Pluronic F127 är bland de mest studerade polymerer för värmegelande drug delivery 15-17 och cellinkapslings 18,19. Emellertid är det väl accepterat att dessa geler sakna stabilitet vid fysiologiska betingelser. Studier har visat någon ökad stabilitet genom att använda kedjeförlängare 20 eller kemiska tvärbindningsmedel 21,22. Icke desto mindre kan användningen av dessa reagens begränsa potentialen hos de material för cellinkapsling.

Poly (N-isopropylakrylamid) är en syntetisk värmegelande polymer som har fått stor uppmärksamhet i vävnadsteknik och drug delivery 14. Vattenlösningar av poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) uppvisar en lägre kritiska lösningstemperaturen (LCST), vanligt förekommande runt 32-34 ° C 23,24. Nedanför LCST, hydrater vatten PNIPAAm kedjor. Över övergångstemperaturen, blir polymeren hydrofob, vilket resulterar i en dramatisk fasseparation 25-27 och bildning av en fast gel utan användning av toxiska monomerer eller tvärbindningsmedel. Men PNIPAAm homo uppvisar dåliga elastiska egenskaper och hålla lite vatten vid fysiologiskt temperatur på grund av hydrofobicitet 28. I detta arbete väljer vi att införliva kondroitinsulfat kovalent till PNIPAAm nätverket, vilket ger potential för enzymatisk nedbrytbarhet 29, anti-inflammatorisk aktivitet 30,31 och ökad vatten och näringsämnen absorption 32. PNIPAAm sampolymerer med CS framställdes i vårt laboratorium genom att polymerisera monomeren NIPAAm i närvaro av metakrylat-funktionaliserade CS för att bilda ympade sampolymeren (PNIPAAm-g-CS). because av den låga tvärbindningstäthet av sampolymeren, PNIPAAm-g-CS bildar en viskös lösning i vatten vid RT och en elastisk gel vid fysiologisk temperatur på grund av LCST 29. Polymerlösningarna blir flytande igen vid kylning under LCST grund av reversibilitet övergången.

Vi har visat att PNIPAAm-g-CS har potential att fungera som ett vävnadsteknik byggnadsställning, på grund av mekaniska egenskaper som kan skräddarsys, nedbrytbarhet och cytocompatibility med humana embryonala njur (HEK) 293-celler 29. Men i vissa lastbärande områden, såsom intervertebral skiva, bör vävnadstekniska byggnadsställningar har förmågan att bilda en väsentlig gränssnitt med omgivande skiva vävnad för att eliminera risken för luxation 33. Detta gränssnitt är också nödvändig för att tillräckligt kraftöverföringen över gränssnittet mellan implantatet och vävnaden 33. I vårt arbete har vi stängt av enlginate mikropartiklar i vattenlösningar av PNIPAAm-g-CS och fann att gelning lokaliserar mikropartiklarna, som ger vidhäftning med omgivande vävnad 34. I detta papper, vi beskriva stegen för framställning av värmegelande, vidhäftande polymer. Standardtekniker för biomaterial karakterisering, cell imaging och analyser för lönsamhet har anpassats för att ta hänsyn till temperaturkänslighet av polymeren och reversibilitet fasövergång. Den injicerbara polymer som beskrivs i detta dokument har bred potential för drug delivery och vävnadstekniska tillämpningar utanför de som beskrivs i detta dokument. Dessutom kan karakteriseringsmetoder som beskrivs här tillämpas på andra värmegelande system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Poly (N-isopropylakrylamid) -g-kondroitinsulfat Synthesis

  1. Före syntesen av det bioadhesiva hydrogel, rena N-isopropylakrylamid (NIPAAm) monomer och metakrylat kondroitinsulfat (CS).
    1. Väg upp minst 10 g NIPAAm och upplösa monomeren i 400 ml n-hexan vid 60 ° C. Rör behållaren med jämna mellanrum tills fullständig upplösning. Omkristallisera lösningen i en -20 ° C frys under 24 timmar.
    2. Avlägsna den kristalliserade monomeren från behållaren och vakuumfilter i n-hexan med användning av en Buchner-tratt. Placera monomeren i en vakuumugn vid RT i 24 h för att avlägsna eventuellt kvarvarande n-hexan. Lagra monomeren i en -20 ° C frys för senare användning (se steg 1.2).
    3. Väg upp och lös upp 2,0 g kondroitinsulfat i 8,0 ml avjoniserat vatten. Värm försiktigt lösningen till 60 ° C.
    4. Justera lösningens pH till 10 med användning av ca 10 till 40 pl av 50% (vikt / vikt) NaOH.
    5. Lägg 0,298 ml metakrylsyra-anhydrid (MA). Återloppskoka under 24 timmar, under omröring vid 60 ° C.
    6. Häll 400 ml av acetonlösning i en burk och kyla O / N i en -20 ° C frys.
    7. Efter 24 h har förflutit, långsamt hälla hela metakrylerade CS (MCS) lösning i 400 ml kall aceton, under omröring med en magnetisk omrörarstav.
    8. Avlägsna MCS från aceton och upp fällningen i en vakuumugn. Utför detta steg snabbt för att upprätthålla en intakt och sammanhängande tillstånd för MCS. Tillåta den kvarvarande aceton för att avdunsta under vakuum under minst 24 timmar.
  2. Sam-upplösa 10 g renad NIPAAm och 2,209 g av MCs i 232 ml avjoniserat vatten.
  3. Rensa lösningen av syre genom användning av inert kvävgas. Bibehålla en kraftig, men ändå låg gasflödeshastigheten för att förhindra lösningen från att bubbla över för 15 min.
  4. Fortsätta rening av lösningen med kvävgas och tillsätt 0,976 ml tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Nästa, initiera polymerisationsreaktionen genom att blanda 97,6 mg ammoniumpersulfat (APS).
  6. Blanda lösningen under ungefär 20 sek och snabbt försegla lösning för att förhindra eventuell luft från att komma in i kärlet. Låt lösningen polymerisera i lysrörsbelysning under 24 timmar.
  7. Efter 24 h, placera reaktionskärlet in i en ugn vid 37 °. Göra det möjligt för hydrogelen att övergå från en vätska till en gel-liknande tillstånd. Dränka den polymeriserade hydrogelen i 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under totalt 7 dagar för att tillåta diffusion av oreagerad monomer ut ur hydrogelen.
  8. Med användning av en sax, skär hydrogelen i flera små bitar, som inte är större än 5 cm i diameter. För att förhindra hydrogelen från att övergå från en gel-liknande tillstånd till en vätska, tärna polymeren inom 37 ° C PBS-lösning. Överför portioner i 50 ml koniska rör.
  9. Bereda proverna för lyofilisering genom att linda topparna avrören med Kimwipes och gummiband. Frysa rören vid -70 ° C under 1 till 2 h.
  10. Placera de koniska rör på frystorkaren för att ta bort allt vatten från hydrogelen. Innan drift, behöver frystorkaren för att nå en temperatur och tryck av ungefär -40 ° C och 0,04 mbar, respektive. Det krävs en minst 7 dagar för fullständig torkning.
  11. Slipa frystorkade polymeren till ett fint pulver och förvara i en 4 ° C kylskåp för senare användning (se steg 3,1).

2. Kalcium-alginat tvärbunden mikropartiklar Synthesis

  1. Bered en 2% (vikt / volym) alginatlösningen genom upplösning 400 mg i 20 ml avjoniserat vatten. Värm lösningen till cirka 60 ° C för att underlätta upplösning.
  2. Bered en 2% (vikt / volym) kalciumkloridlösning genom att tillsätta 400 mg till 20 ml avjoniserat vatten.
  3. Skapa en olja i vatten-blandning genom att kombinera 100 ml canolaolja, 1,0 ml Tween 20 och 20 mlav 2% (vikt / volym) alginat. Emulgera blandningen under 10 min med en homogenisator vid 15.000 varv per minut. Dessutom, blanda med en magnetisk omrörarstav vid 200 rpm eller 2000 rpm för att skapa stora eller små mikropartiklar, respektive.
  4. Aspirera 2% (vikt / volym) kalciumkloridlösning med hjälp av en spruta med en 18 G nålspetsen. Tillsätt långsamt den kalciumklorid droppvis i emulsionen.
  5. När väl de 20 ml av kalciumklorid har uttömts, tillåta mikropartiklarna inom emulsionen för att tvärbinda under 10 min.
  6. Jämnt fördela sats av mikropartiklar in i capped 50 ml koniska rör och centrifugera för en kraft av 1400 xg under 2 minuter för att avlägsna utgångsskiktet av rapsolja.
  7. Konsekutivt tvätta, virvel, och centrifugera mikropartiklarna med isopropanol totalt tre gånger vid 1400 g under 2 min för att avlägsna eventuellt kvarvarande kanolaolja. Kassera isopropanol supernatanten efter varje centrifugeringssteg och tvätta med färsk isopropanol.
  8. När oil har tagits bort, upprepa tvättförfarandet ytterligare tre gånger med avjoniserat vatten för att avlägsna eventuellt kvarvarande isopropanol. Kassera det avjoniserade vattnet supernatanten efter varje centrifugeringssteg och tvätta med färskt avjoniserat vatten. Ta bort cirka 100 mg våt mikropartiklar och lagra i en injektionsflaska. De våta mikropartiklar kommer att användas för att mäta den genomsnittliga diametern av partiet med Ijusmikroskopi.
    1. Med användning av Ijusmikroskopi, dispergera ett litet prov av våta mikropartiklar i avjoniserat vatten på ett objektglas. Beroende på storleken av mikropartiklarna, använder en 10X eller 20X objektiv och justera den numeriska bländaröppningen tills partiklarna kommer i fokus. Se till att mikroskopet är kalibrerad för rätt objektiv och justera ljusstyrkan hos ljuskällan efter behov. Använd en rad verktyg för att mäta den längsta diameter på 50 slumpmässigt alginatmikropartiklar och få en genomsnittlig storlek för partiet.
  9. Förbered mikropartiklar för frystorkning By linda dem med Kimwipes och säkra dem med gummiband. Frysa mikropartiklarna vid -70 ° C under 1 timme.
  10. Placera mikropartiklarna på lyofilisatorn och tillåta provet att torka under minst 24 tim. Slipa frystorkade mikropartiklar till ett fint pulver med hjälp av en mortel och mortelstöt och förvara i en 4 ° C kylskåp för senare användning (se steg 3,3).

3. Framställning av Lim

  1. Med användning av den frystorkade polymerpulver, skapa en 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS-lösning genom att lösa upp 50 mg av hydrogel pulver i 1 ml 1 x PBS.
  2. Blanda lösningen med användning av en vortex och kyla i ett kylskåp vid 4 ° C under 24 h.
  3. När de viskösa lösning bildas, skapa en homogen komposit genom att lägga till 25 eller 50 mg av frystorkade alginatmikropartiklar till hydrogelen lösning och skaka. Förvara kompositen i kylskåp vid 4 ° C för senare användning (se steg 4.3 och 4.8).

4. Biovidhäftande Mechanical dragtester

  1. Innan du utför dragprov, extrahera brosksubstrat från en svin öra.
    1. Avfrosta en porcin öra i en varm 0,9% (vikt / volym) NaCl-lösning; Detta kommer att bidra till att lossa vävnaden.
    2. Med hjälp av en skalpell, isolera och avsnitt av en platt, rektangulär yta genom att skära vertikalt om epidermal lagret, subkutan vävnad och brosk. Undvik att skära böjda åsar svin örat.
    3. Separera den epidermala lagret av huden från brosk genom att skära parallellt genom den subkutana vävnaden. Brosket är en hård, vit vävnad som finns under porcin hud.
    4. Skrapa den subkutana vävnad som är ansluten till brosket med den sida av skalpell. Undvik att skära i broskvävnaden med skalpellblad.
    5. Säkerställa att endast en sida av brosk är exponerad och platt under dragprovning. Om det är nödvändigt, platta brosk genom att skära av den ojämna huden på undersidan.
    6. Skär broskvävnaden i flera bitar med måtten 1 cm x 1 cm. Lagra broskvävnaden i koniska rör fyllda med 0,9% (vikt / volym) NaCl-lösning i en -20 ° C frys.
  2. Förbereda 2,0 L av 0,9% (vikt / volym) NaCl-lösning. Förvärm saltlösningen till 37 ° C. Temperaturen hos denna lösning måste bibehållas under hela testningen.
  3. Tina den frusna brosk. Hålla både svin brosk och hydrogel proverna i en frigolit behållare med is förpackningar.
  4. Fäst kraftgivaren till armen av försöksuppställningsplatsen. Placera en värmeplatta ovanpå den kraft stativet och ställa in temperaturen på 50 ° C.
  5. Anbringa en 1 cm x 1 cm bit av brosk till det rostfria stålblock med cyanoakrylatlim och en pincett. Limma ett ytterligare stycke av brosk till Delrin cylindern och fäst cylindern till kraftmätare. Det är mycket viktigt att båda broskytor vända mot varandra, och kontakta hydrogel.
  6. Platsplexiglasvattenbadet ovanpå den heta plattan och sätt i rostfritt stålblock med brosksubstrat inne i badet.
  7. Sänk armen av provbänk och rikta både brosksubstrat med varandra. Höj armen och tillräckligt med utrymme för att tillämpa hydrogel.
  8. Med en positiv förskjutning pipett avstå 200 ul av bioadhesiva hydrogel till botten bit brosk.
  9. Sänka armen av den kraft som monter på 1 mm / min tills hydrogelpartiklarna i kontakt med den övre bit av brosk och utövar en förspänningskraft 0,001 N.
  10. Häll 37 ° C saltlösning in i badet tills volymen når den utsedda vattennivån. Kontrollera temperaturen av lösningen med ett termoelement.
  11. Göra det möjligt för hydrogelen att ställa under totalt 5 minuter. När väl gelén har stelnat, höja armen vid en hastighet av 2 mm / min. Testet är klart när det bioadhesiva lossnar från brosksubstrat eller när en betydande nedgång i kraft inträffarsignalering misslyckande.
  12. Samla in de registrerade uppgifterna och höja armen av försöksuppställningsplatsen. Avlägsna Delrin cylindern från kraftmätaren. Häll saltlösning i dess tidigare behållare och reheat till 37 ° C.
  13. Beräkna spänningar genom att subtrahera den kraft som utövas av polymeren från flytkraft i en "tom", den Delrin fastsättning utan brosk eller lim, uppåt i samma takt, och dividera med bindningsområdet.

5. Svullnad studie av PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar

  1. Förbered rena glasflaskor och märka dem på lämpligt sätt med en tidpunkt, provtyp och provnummer. Limmen kan också skapas, såsom tidigare beskrivits. Förbereda totalt fem prover (n = 5) för varje provtyp per tidpunkt.
  2. Pre-väga alla glasflaskor och spela sin ursprungliga massan vid RT.
  3. Med hjälp av en spruta, fördela cirka 0,4 ml av det beredda bindemedel provet i vart och ett av de fem flaskor.Upprepa detta steg för varje typ prov i alla testade tidpunkter.
  4. Väg och registrera mängden av varje ampull med den självhäftande provtyp vid RT.
  5. Pre-värma en orbital inkubator och ett L av 1x PBS-lösning till 37 ° C.
  6. Organisera alla flaskorna på ett rack och införande av gallret i inkubatorn. Tillåt limmen att övergå från en vätska till en gel i ungefär 5 till 10 min.
  7. Lägg 5,0 ml 1x PBS till varje flaska. Var noga med att lägga till PBS-lösning längs sidan av flaskan för att förhindra att hydrogel skiva från att bryta isär.
  8. Cap varje flaska för att förhindra avdunstning av PBS-lösning och upprätthålla den inre temperaturen i inkubatorn vid 37 ° C. Varje uppsättning av hydrogel-skivor kommer att behöva förbli nedsänkt i PBS under en angiven tidsperiod.
  9. En gång per 7 dag tid punkt har nåtts, fixed uppsättningen av ampuller och avlägsna PBS-lösningen från varje flaska. Väg varje flaska med limmet provet igen vid RT.
<p class = "jove_title"> 6. Kvalitativ cellviabiliteten med hjälp av en Live / Dead Assay

  1. Innan du utför Live / Dead analys med PNIPAAm-g-CS, växa humana embryonala njur-293-celler (HEK-293) till 80% konfluens.
    1. Quick-tina den frysta HEK-293 cellsuspension genom att placera köldkärlet i ett 37 ° C vattenbad, sedan centrifugera cellerna vid 400 xg vid 4 ° C under 5 min i en 15 ml koniska rör.
    2. För att göra den första passagen celltillväxtmedium, kombinera i hög glukos (4,5 g / L) Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) till en slutlig koncentration av 20% och 100x penicillin-streptomycin-lösning ( pen-strep) till en slutlig koncentration av 100 lU / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin. För alla andra passager, växla till DMEM med 10% FBS och 1 x pen-strep.
    3. Resuspendera cellpelleten i 10 ml tillväxtmedium och överför suspensionen i en 100 mm petri diameter skål. jämnt distribute cellerna genom att försiktigt luta skålen fram och tillbaka och från vänster till höger ett par gånger varje riktning.
    4. Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2. Om det behövs ändrar mediet varannan dag.
    5. När cellerna når 80% konfluens, replikera kulturen i flera rätter. Avlägsna mediet från plattan.
    6. Tillsätt 1 ml 0,5% trypsin till plattan. Tillåta plattorna inkubera vid 37 ° C under 10 min. Kontrollera för att se om cellerna lossnar från ytan genom att försiktigt virvla plattan.
    7. För att dela kulturen 1:10, tillsätt 9 ml regelbunden tillväxtmedium (DMEM med 10% FBS) till de trypsiniserade cellerna och blanda försiktigt genom att luta skålen.
    8. Dispensera 1 ml av den utspädda cellsuspensionen till varje ny skål och tillsätt 9 ml odlingsmedium. Blanda försiktigt genom att luta skålen.
    9. Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2. Om det behövs ändrar mediet någonsiny två dagar tills cellerna når 80% konfluens.
  2. Ta bort materialet från två odlingsskålar vuxit till 80% konfluens.
  3. Tillsätt 1 ml 0,5% trypsin till varje platta. Tillåta plattorna inkubera vid 37 ° C under 10 min. Kontrollera för att se om cellerna lossnar från ytan genom att försiktigt virvla plattan.
  4. Tvätta HEK-293-celler på plattan med 3 ml tillväxtmedium två gånger och lägga till både suspensioner till samma 15 ml koniska rör.
  5. Centrifugera 15 ml koniskt rör i 10 min vid 400 xg vid 4 ° C.
  6. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 3 ml medium genom att pipettera upp och ned.
  7. Pipettera 10 pl av cellsuspensionen i en hemocytometer och utföra ett celltal för att bestämma celldensitet. Öka suspensionsvolym av medium om den initiala cellkoncentrationen är för hög, och omvänt minska volymen om koncentrationen är för låg, för att bevara ett mål concentranson av 1 x 10 6 celler / ml. Centrifugera HEK-293-celler vid 400 xg och resuspendera cellpelleten i den korrigerade volymen av media i enlighet därmed.
  8. Vortexa försiktigt cellsuspensionen och jämnt fördela cellblandningen i fyra separata 15 ml koniska rör för följande testbetingelser: positiv kontroll monoskikt, negativ dödade kontroll i PNIPAAm-g-CS med användning av 70% (volym / volym) metanol, HEK-293 celler inkapslade i PNIPAAm-g-CS, och HEK-293-celler inkapslade i PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar.
  9. Skapa positiva kontrollmonoskikt genom pipettering flera 300 | il volymer av cellblandningen i en 24-brunnars platta för att generera 4-6 replikatprover.
  10. Ta bort materialet från de koniska rör som hänför sig till dödade kontroll, PNIPAAm-g-CS, och PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar.
    1. Centrifugera koniska rör under 5 minuter vid 400 xg och avlägsna supernatanten.
    2. Bibehålla samma cellkoncentrationen genom att återsuspendera calnar i samma volym av PNIPAAm-g-CS som den avlägsnas media. Pipett polymercellblandningen upp och ned med hjälp av en serologisk pipett tills homogen.
      1. Om ympning med alginatmikropartiklar, överföra PNIPAAm-g-CS-cellsuspension (erhållen såsom beskrivs för 6.10.2) till en 35 mm odlingsskål och införa partiklarna i blandningen. Pipett cell blanda upp och ned med hjälp av en serologisk pipett tills homogen.
    3. Med hjälp av serologiska pipett avstå flera 300 pl av polymercellblandningen i var och en av brunnarna för dödade kontroll, PNIPAAm-g-CS, och PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar generera 4 - 6 likadana prover.
  11. Inkubera plattan vid 37 ° C i 10 till 15 min och låta PNIPAAm-g-CS att övergå från en vätska till en gel (polymeren bildar en opak, vit skiva).
  12. Placera en bild varmare i huven och ställ in temperaturen till 37 ° C. Använda bild varmare för att upprätthålla brunnartemperatur och pipett 600 ul förvärmda media i varje brunn. För att ytterligare förhindra övergår av polymeren till ett flytande tillstånd, placera en lampa med en fluorescerande lampa ovanför skålen för att värma upp luften ovanför den.
  13. Inkubera cellerna i 5 dagar vid 37 ° C med 5% CO2.
  14. Efter fem dagar har förflutit, förbereda Live / Dead färgämne blandning med hjälp av etidium homodimer (EthD-1) och kalcein AM. Båda substanserna är ljuskänsliga och ställdes på dagen för användningen.
    1. Frosta av kalcein AM och EthD-1 ur satsen vid RT.
    2. Tillsätt 5 ml steril 1x PBS till en konisk tub och slå in den i aluminiumfolie.
    3. Lägga 6,67 pl av 2 mM EthD-1 till det koniska röret. Vortex lösningen blandning noggrant.
    4. Därefter till 2,5 pl 4 mM kalcein AM till den koniska röret. Vortexa blandningen grundligt.
  15. Ta bort media från brunnarna i monolager (positiv kontroll), PNIPAAm-g-CS, och PNIPAAm-g-CS with alginatmikropartiklar. Tvätta alla brunnarna ordentligt, men försiktigt, med PBS och avlägsna PBS.
  16. Tillåt hydrogelpartiklarna skivor som innehåller alginatmikropartiklar för att smälta vid RT och tillsätt 2 ml av 50 mM natriumcitrat till var och en av brunnarna.
  17. Ta bort materialet från de dödade cellbrunnarna (negativ kontroll). Tillåt hydrogelpartiklarna skivor för att övergå till vätskeform vid RT och tillsätt 300 pl 70% (volym / volym) metanol till varje brunn.
  18. Inkubera plattan i 45 minuter vid 37 ° C.
  19. Avlägsna natriumcitrat och metanollösningar från brunnarna och pipettera var och en av hydrogelpartiklarna suspensioner i enskilda mikrocentrifugrör. Centrifugera rören vid 2000 xg under 10 min för att separera cellerna från hydrogelen suspensionen.
  20. Försiktigt bort suspensionen genom att pipettera lösningen från det koniska röret och lämnar bakom cellpelleten. Återsuspendera pelleten i 300 pl PBS och överför till den ursprungliga brunnar.
  21. Tillsätt 300 | il tHan Live / Dead färgämne blandning till var och en av brunnarna. Slå in brunnsplatta i aluminiumfolie och inkubera i 45 minuter på en rocker vid RT.
  22. Bild alla prover under ett inverterat fluorescensmikroskop med en 10X objektiv. Levande celler och dödade celler visas en grön och röd fluorescens, respektive.

7. Kvantitativ cellviabilitet Använda en XTT-analys

  1. Växa HEK-293-celler till 80% sammanflytning. Avlägsna odlingsmediet från två odlingsskålar.
  2. Tillsätt 1 ml 0,5% trypsin till varje platta. Tillåta plattorna inkubera vid 37 ° C under 10 min. Kontrollera för att se om cellerna lossnar från ytan genom att försiktigt virvla plattan.
  3. Tvätta HEK-293-celler på plattan med 3 ml media två gånger och lägga till både suspensioner till samma 15 ml koniska rör.
  4. Centrifugera 15 ml koniskt rör i 10 min vid 400 xg vid 4 ° C.
  5. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 3 ml mediagenom att pipettera upp och ned.
  6. Pipettera 10 pl av cellsuspensionen i en hemocytometer och utföra ett celltal för att bestämma celldensitet. Såsom tidigare beskrivits, bevara en målkoncentration av 1 x 10 6 celler / ml. Centrifugera HEK-293-celler vid 400 xg och resuspendera cellpelleten i den korrigerade volymen av media i enlighet därmed.
  7. Vortexa försiktigt cellsuspensionen och jämnt fördela cellblandningen i fyra separata 15 ml koniska rör för följande testbetingelser: positiv kontroll monoskikt, negativ dödade kontroll i PNIPAAm-g-CS med användning av 70% (volym / volym) metanol, HEK-293 celler inkapslade i PNIPAAm-g-CS, och HEK-293-celler inkapslade i PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar.
  8. Skapa positiva kontrollmonoskikt genom att pipettera 300 ul av cellblandningen i en 24-brunnars platta för att generera 4 - 6 replikatprover.
  9. Ta bort materialet från de koniska rör som hänför sig till dödade kontroll, PNIPAAm-g-CS, och PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar.
    1. Centrifugera koniska rör under 5 minuter vid 400 xg och avlägsna supernatanten.
    2. Bibehålla samma cellkoncentration genom återsuspendering av cellerna i samma volym av PNIPAAm-g-CS som den avlägsnas media. Pipett cell blanda upp och ned med hjälp av en serologisk pipett tills homogen.
      1. Om ympning med alginatmikropartiklar, överföra PNIPAAm-g-CS-cellsuspension i en 35 mm odlingsskål och införa partiklarna i blandningen. Pipett cell blanda upp och ned med hjälp av en serologisk pipett tills homogen.
    3. Med hjälp av serologiska pipett avstå 300 ul av polymercellblandningen i var och en av brunnarna för dödade kontroll, PNIPAAm-g-CS, och PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar generera 4 - 6 likadana prover.
  10. När alla cellinnehållande prov har lagts till i 24-brunnar, fördela flera 300 il volymer av PNIPAAm-g-CS och PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar utan celler i intilliggande brunnar för att generera 4 - 6 likadana prover.
  11. Inkubera 24-brunnars platta vid 37 ° C i 10 till 15 min och låta PNIPAAm-g-CS att övergå från en vätska till en gel (polymeren bildar en opak, vit skiva).
  12. Placera en bild varmare i huven och ställ in temperaturen till 37 ° C. Använd bilden varmare att upprätthålla brunnar temperatur och pipett 600 pl förvärmd klar DMEM i varje brunn. För att ytterligare förhindra övergår av polymeren till ett flytande tillstånd, placera en lampa med en fluorescerande lampa ovanför skålen för att värma upp luften ovanför den.
  13. Inkubera cellerna i 5 dagar vid 37 ° C vid 5% CO2.
  14. Efter fem dagar har gått, förbereda 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-karboxanilid (XTT) reagens från tillverkaren. XTT reagens är ljuskänsliga och beredda på dagen för användning.
    1. Ta bort den gula flaskan innehållering XTT pulvret från kylskåpet. Med användning av en steril spruta och nål, injicera 5 ml klar DMEM (inget fenolrött) genom gummiväggen in i bärnstensfärgad flaska.
    2. Värma reagens till 56 ° C i ett vattenbad under 10 min eller tills det är upplöst.
    3. Ytterligare späda XTT reagens till 20% (volym / volym) i ett 15 ml koniskt rör inlindad i aluminiumfolie. Alikvotera överskottet XTT reagens i mikrocentrifugrör och placera dem i -20 ° C frys för långtidsförvaring.
  15. Ta bort materialet från de dödade cellbrunnarna (negativ kontroll) och tillsätt 300 pl 70% (v / v) metanol till varje brunn. Inkubera i 45 min vid 37 ° C och avlägsnande av metanolen från brunnarna.
  16. Ta bort materialet från de återstående brunnarna i monolager (positiv kontroll), PNIPAAm-g-CS, och PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar. Tvätta alla brunnarna ordentligt, men försiktigt, med PBS och sedan ta bort PBS.
  17. Tillsätt 300 ul av 20% XTT reagens till varje brunn. Linda 24-brunnsplatta i aluminiumfolie och inkubera i 24 h på en rocker vid RT.
  18. Efter 24 h, tillsätt 200 | il av 50 mM natriumcitrat till alla brunnarna och inkubera på vipparmen för en ytterligare timme.
  19. Överföra alla polymersuspension till mikrocentrifugrör och centrifugera vid 2000 xg under 10 min vid RT.
  20. Överföra 200 | il av supernatanten från varje mikrocentrifugrör till en 96-brunnsplatta. Med användning av en mikrotiterplattläsare, erhålla specifika absorbansavläsningar vid 450 nm och icke-specifika absorbansavläsningar vid 690 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En värmekänsliga ympade sam-polymeren framgångsrikt syntetiserats och kännetecknas för sin bioadhesiva styrka, svullnad egenskaper, och in vitro cytocompatibility. Vi valde att undersöka alginat på grund av dess väletablerade mukoadhesiva egenskaper. Alginatmikropartiklar, med en medeldiameter av 59,7 ± 14,9 | j, m, blandades med 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS vid koncentrationer av 25, 50, och 75 mg / ml. Dessa koncentrationer var baserade på en-halv, lika med, och två gånger den ekvivalenta torrvikten av PNIPAAm-g-CS i vattenlösning. Mikropartikel koncentrationer över 75 mg / ml uppvisade överdriven viskositet och undersöktes inte. Den maximala dragvidhäftningshållfasthet av 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS med varierande koncentrationer av alginatmikropartiklar jämfördes med hydrogelen ensam. Tillsatsen av 50 eller 75 mg / ml av alginatmikropartiklar suspenderade i 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS resulterade i en fyrfaldig increase i draghållfasthet (p <0,05), såsom visas i figur 1. En mikropartikel koncentration av 25 mg / ml uppvisade inte en signifikant ökning av draghållfasthet jämfört med 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). Det fanns ingen signifikant förändring i draghållfasthet av 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS när koncentrationen av alginatmikropartiklar ökades från 50 till 75 mg / ml (p> 0,05).

Svällningsegenskaper den bioadhesiva hydrogelen karakteriserades genom nedsänkning olika formuleringar i PBS vid 37 ° C. Alginat mikropartikelkoncentrationer av 25 och 50 mg / ml testades för att identifiera eventuella skillnader i svullnad beteende. Alginatmikropartiklar mättes med användning av Ijusmikroskopi och hade en medeldiameter av 25,0 ± 14,4 ^ m. Efter 7 dagar, var den första och sista våta massan av hydrogel-skivor var inspelade och en förändring i massa beräknad för flera prover per klister formulation (n = 5). Figur 2 visar en drastisk skillnad i förändringen i massa bland alla formuleringar. Lim som innehåller både 25 och 50 mg / ml av alginatmikropartiklar demonstrerade positiva förändringar i massa, medan 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS minskat i massa. Alla prover befanns vara signifikant skilda från varandra (p <0,05) med bindemedlet som innehåller 50 mg / ml av alginatmikropartiklar som visade störst svällande effekt.

Biokompatibilitet den föreslagna limmet undersöktes både kvalitativt och kvantitativt genom användning av en Live / Dead och XTT cytotoxicitetsanalys. HEK-293-celler inkapslade i både 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-KS och 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS innehållande 50 mg / ml av alginatmikropartiklar med en medeldiameter av 59,7 ± 14,9 ^ m . Ett monoskikt av celler och inkapslade celler i PNIPAAm-g-CS dödade med 70% metanol ansågs positiva och negativ kontroller, respektive. Formuleringar sådda med celler karakteriserades efter 5 dagars tillväxt i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2. Varje test indikerade god cellviabilitet för både PNIPAAm-g-CS och PNIPAAm-g-CS med mikropartiklar. Bilder Figur 3 illustrerar levande celler fluorescerande grönt i båda limkompositioner (Paneler A och B) och cell-monoskiktet, som tjänar som den positiva kontrollen (panel C). Avdödade celler (panel D) fluorescerar en röd färg och visa celldöd. Resultat från XTT cytotoxicitetstester bekräftade resultaten av Live / Dead analys. Den relativa cellviabiliteten av klistret innehållande 50 mg / ml av mikropartiklar minskade 1,3 gånger jämfört med PNIPAAm-g-CS såsom illustreras i figur 4, men minskningen var inte statistiskt signifikant (p> 0,05). Både PNIPAAM-g-CS och PNIPAAM-g-CS med mikropartiklar hade också jämförbar livskraft cellmonoskiktet (p> 0,05). Inkapslade celler i hydrogel formuleringar och cell-monoskiktet befanns vara signifikant annorlunda jämfört med den negativa kontrollen (p <0,05). Sammantaget tyder dessa resultat på att bindemedlet innehåller mikropartiklarna inte bara uppvisar ökad vidhäftningshållfasthet, men god biokompatibilitet också.

Figur 1
Figur 1. Effekter på Draghållfasthet efter infogande varierande koncentrationer av alginatmikropartiklar i 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS. Draghållfastheten hos PNIPAAm-g-CS fyrdubblades med tillsats av 50 eller 75 mg / ml av alginatmikropartiklar (p <0,5). Felstaplar representerar en beräknad 95% konfidensintervall (n = 5). Alginatmikropartiklar hade en genomsnittlig storlek på 59,7 ± 14,9 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Effekten av varierande koncentrationer av alginatmikropartiklar på svällningskapacitet av 5% (vikt / volym) PNIPAAm-g-CS. Efter 7 dagar nedsänkning i 37 ° C PBS, PNIPAAm-g-CS minskat i våta massan på grund av de hydrofoba egenskaperna hos PNIPAAm ovanför LCST. PNIPAAm-g-CS med 25 eller 50 mg / ml av alginatmikropartiklar uppvisade svällande förmåga. Ökning av koncentrationen av mikropartiklar ökade signifikant (p <0,05) förändringen i massa av hydrogelen under 7 dagar, tillskriven vattenupptagning. Felstaplar representerar en beräknad 95% konfidensintervall. Alginatmikropartiklar hade en genomsnittlig storlek på 25,0 ± 14,4 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

gether.within-page = "1"> Figur 3
Figur 3. Representant Live / Dead fluorescensbilder av odlade HEK-293-celler under en period av 5 dagar. Cellerna inkapslas i (A) PNIPAAm-g-CS och (B) PNIPAAm-g-CS med 50 mg / ml av alginat mikropartiklar. Celler odlades också i en (C) monoskikt och (D) dödades med metanol i PNIPAAm-g-CS för att representera en positiv och negativ kontroll, respektive. Live / Dead viabilitet försök upprepades tre gånger med tre replikat per försök. Skalstrecken representerar 100 ^ m. Alginatmikropartiklar hade en genomsnittlig storlek på 59,7 ± 14,9 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ftp_upload / 53704 / 53704fig4.jpg "/>
Figur 4. kort sikt av HEK-293-celler i PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar. Överlevnad av inkapslade HEK-293-celler inom PNIPAAm-g-CS med och utan alginatmikropartiklar bedömdes och jämfördes med XTT efter 5 dagar. En cellmonoskiktet och inkapslade celler i PNIPAAm-g-CS dödas med 70% metanol användes som positiva och negativa kontroller, respektive. Både PNIPAAm-g-CS och PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartiklar visade ingen signifikant reduktion (p> 0,05) i cellviabilitet jämfört med cellmonoskiktet, men visade en signifikant minskning (p <0,05) i cellviabilitet jämfört med dödade celler. Tillsatsen av alginatmikropartiklar inte signifikant äventyrar cellviabiliteten av PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). Felstaplar representerar en beräknad 95% konfidensintervall (n = 3, sex replikat per experiment). Alginatmikropartiklar hade en medelstorlek av 59,7 ± 14,9 ^ m.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns flera viktiga steg i syntetisera hydrogel-mikropartikel komposit och utvärdera sin häftförmåga, svullnad förmåga och cellulära biokompatibilitet. Friradikalpolymerisation av PNIPAAm-g-CS kräver ett framgångsrikt methacrylation av kondroitinsulfat, fullständig upplösning av monomerkomponenter, och syrefria reaktionsbetingelser. Förhållandet mellan NIPAAm monomer metakrylerat kondroitinsulfat i reaktionsblandningen valdes eftersom det har visats i vårt tidigare arbete, för att generera sampolymerer med mekaniska egenskaper som liknar nativ intervertebral skiva vävnad 29. Att öka mängden av kondroitinsulfat i hydrogelen kommer att minska vattenförlusten under gelning och därmed minska den kompressiva styvheten hos gelén. Den valda graden av methacrylation har också visats att producera hydrogeler med gynnsamma hanteringsegenskaper för injicerbarhet genom en 18 G-nål vid upplösning i vattenhaltig lösning <sup> 29. En ökad grad av metakrylat substitution av CS kommer att öka tvärbindningstätheten av polymernätverket, vilket orsakar en ökad lösningsviskositet under LCST och minska gel svullnad förmåga. Andra har undersökt olika metoder vid syntes PNIPAAm hydrogeler såsom atom transfer radikalpolymerisation (ATRP) 35 eller omvänt additionsfragmentering kedjeöverföring (RAFT) 36. Polymerisation via ATRP har lett till utvecklingen av smala, polydispersa hydrogeler med fined avstämd molekylvikt genom att förändra monomeren till initiator förhållandet. Funktionella grupper kan ympas på ett kamliknande sätt med användning RAFT polymerisation, vilket påverkar polymer kedjeintrassling och fasseparation.

En homogen vatten-i-olja-blandning som är nödvändigt för att skapa enhetliga, tvärbundna alginatmikropartiklar. En emulsion Tekniken är enkel att utföra och inte kräver användning av farliga kemikalier, men båda micropaArtikel form och fördelning är svåra att kontrollera. Mikropartikelstorleken kan ändras genom att man ökar emulsionsomrörningshastighet, vilket skapar mindre partiklar och vice-versa. I denna studie var alginat mikropartikelstorleken undersöktes som en potentiell egenskap som kan påverka svullnad, mekanik, eller cellulär viabilitet. Ljusspridning kan också användas som ett alternativ till mätning av den genomsnittliga mikropartikelstorleken. Andra emulsions egenskaper såsom tensid av typen och alginat koncentrationen kommer att påverka mikropartikelstorlek och aggregatbildning 37. Minskning av alginatkoncentrationen kommer att minska mikropartiklarnas storlek, men aggregaten är mer benägna att bilda. Variationer i den hydrofila och hydrofoba naturen hos ytaktiva medel kommer att påverka ytspänningen mellan olje- och vattenfaserna, därav att ändra droppstorleken inom emulsionen. Alginatmikropartiklar kan alternativt framställas med användning av en mikrofluidanordning, som medger likformig particle form och snäv storleksfördelning 38. Denna teknik innefattar att dispergera ett alginat fas i en kontinuerlig oljefas som flyter genom en kanal och kommer in i en kalciumkloridbadet. Spray draying är en annan teknik som ger mycket små mikropartiklar 39. Det är också viktigt att notera att alginat kan laddas med proteiner eller tillväxtfaktorer och kan vara tvärbundna med andra tvåvärda joner, såsom zink eller barium.

I detta arbete, karaktäriserar vi ett limsystem med potentiella tillämpningar inom tissue engineering. Vår dragprov specifikt syftar till att kvantifiera den adhesiva styrkan hos kompositen när den är i kontakt med porcint brosk. Denna typ av substrat valdes för att efterlikna vidhäftning av hydrogelen kompositen till de brosk ändplattor mellankotskivan. Andra vävnads substrat, såsom porcin hud, kan användas som ett alternativ för att kvantifiera styrkan hos ett lim 40, men vävnadstypen kommervariera beroende på den avsedda tillämpningen. Upprätthålla god temperaturreglering av saltlösning vattenbadet och förkylare kompositen före användning är avgörande för att noggrant mäta de mekaniska egenskaperna. Förhöjda vatten badtemperaturer över 37 ° C kommer att orsaka hydrogelen att snabbt krympa och stelna, medan kompositer som mekaniskt är testade under 37 ° C kommer att uppvisa minskad draghållfasthet på grund av bristen på fasseparation. För närvarande utvecklar vi metoder för att undersöka skjuvning vidhäftningshållfasthet av olika injicerbara limkompositioner. Framtida arbete kommer att inkludera att utföra ex vivo mekaniska tester med svin IVDs att avgöra om limmet motstår extrudering genom en ringformad defekt och återställer biomekaniska funktionalitet till ryggradsrörelsesegmentet.

Över 32 ° C, krymper och driver ut vatten från hydrogelen matrisen på grund av LCST beteendet hos PNIPAAm PNIPAAm-g-CS, vilket resulterar i en minskad massa överen 7-dagars period i PBS (Figur 2). Omvänt, tillsats av alginatmikropartiklar förlänar en svällande effekt och adhesivet signifikant förhöjd i massa (p <0,05) vid en mikropartikelkoncentration av 25 mg / m och ännu mer vid 50 mg / ml. I detta svullnad studie, förändringar i våt massa hydrogel sannolikt tillskrivas vattenutbytet med omgivningen, eftersom PNIPAAm-g-CS har visat sig vara selektivt brytas ned i närvaro av enzymer 29. Många av protokollsteg utvecklats för svullnad studien anpassas utifrån den thermoreversibility av PNIPAAm-g-CS. Hydrogel-skivor måste till fullo övergången vid 37 ° C före tillsats av förvärmda PBS-lösning, annars gelén löses. Efter svallning i en vecka, måste PBS-lösningen snabbt och försiktigt bort från flaskorna innan de hydrogeler återgå till ett vätskeliknande tillstånd. Det bör noteras att svalln protokoll som beskrivs i detta dokument inte till fullo simulerain vivo miljö infödda IVD. Svällningsegenskaper byggnadsställningen in vivo kommer att bero på det osmotiska trycket hos omgivande vävnader 41 och beteendet hos gelén nedbrytning. Men i allmänhet är den ökade svällförmåga med alginat mikropartikel inkorporering anses fördelaktigt, eftersom det kommer att hjälpa den injicerbara hydrogel att stanna rymdfyllning vid fysiologisk temperatur. Egenskaper såsom svällningsförhållandet och vatteninnehåll kan beräknas med ytterligare mätningar torr massa. Framtida svullnad studier kommer att omfatta nedsänkning hydrogel skivor mot en polyetylenglykol (MW = 20.000 g / mol) bad, som kommer att gälla en osmotiska trycket och efterlikna miljön i IVD in vivo.

Bortsett från de mekaniska och svällningsegenskaper, måste limmet uppvisa cellulära biokompatibilitet för att betraktas som en lämplig byggnadsställning. Tidigare studier har visat att överlevnaden av encapsulated celler i alginat 42,43 och PNIPAAm-baserade material 44,45. Resultaten från både Live / Dead och XTT analyser är i överensstämmelse med dessa tidigare upptäckter, vilket tyder på lämpligt cellviabiliteten under en period av 5 dagar (figur 3 och 4). Vårt laboratorium har också genomfört förundersökningar av lönsamheten över en längre tidsförlopp (21 dagar) och observerade liknande beteende. I allmänhet bör ett överskott på PNIPAAm-g-CS och mikropartiklarna vara beredd att redogöra för någon väsentlig förlust under pipett överföringar. Återigen är det ytterst viktigt att bevara byggnadsställning arkitektur genom att upprätthålla lämpliga temperaturförhållanden vid 37 ° C. Om ställningen nätverket återgår från en gel till en vätskeliknande tillstånd, cellvidhäftning och livskraft kan bli försämrad. När det gäller Live / Dead analys spelar natriumcitrat en viktig roll i att avlägsna och dekonstruktion av alginatmikropartiklar. Natriumcitrat vänder tvärbindningsverkan mellan Calcium och alginat och orsakar en slurry för att bilda 46. Ytterligare tvättar med PBS för att avlägsna PNIPAAm-g-CS eller alginat kan utföras för att förbättra kvaliteten på bilderna. Under XTT-analys, är polymerprover innehållande inga celler skapas inom de brunnsplattor. Dessa replikat fungerar som tomma standarder och är skyldiga att beräkna en exakt absorbansvärde. Våra preliminära genomförbarhetsstudier är strikt bygger på att HEK-293-celler. I framtida studier kommer differentieringen av inkapslade adipos-härledda mesenkymala stamceller (AD-MSC) i nucleus pulposus-celler påvisas. AD-MSC-differentiering mot NP-liknande fenotyp har demonstrerats med hjälp av dynamisk kompression 47 och hypoxi 48,49.

Sammantaget visar den föreslagna klister löfte för vävnadstekniska tillämpningar inom bärande områden, såsom mellankotskivan, där framgång regenereringsstrategi kommer att bero på ställningen förmåga att resist dislokation under rörelse och lastning. Detta system är mycket mångsidigt i det att det potentiellt skulle kunna anpassas för att frisätta extracellulära matrisproteiner eller tillväxtfaktorer som är specifika för den önskade tillämpningen. Viktigt, kan de metoder som beskrivs här anpassas till varje karakterisering studie med värmegelande polymerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacksamt erkänna hjälp av Dr Jennifer Kadlowec i utvecklingen av vidhäftande dragprovningsprotokoll.

Research rapporterade i denna publikation stöddes av National Institute of Arthritis och muskuloskeletala och hudsjukdomar och National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering av National Institutes of Health i Award Antal 1R15 AR 063.920 till 01. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Tags

Bioteknik hydrogel bioadhesiv vävnadsteknik medicinsk teknik byggnadsställning värmegelande injicerbara
Syntes av värmegelande Poly (N-isopropylakrylamid) -graft-kondroitinsulfat Composites med alginatmikropartiklar för Tissue Engineering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christiani, T. R., Toomer, K.,… More

Christiani, T. R., Toomer, K., Sheehan, J., Nitzl, A., Branda, A., England, E., Graney, P., Iftode, C., Vernengo, A. J. Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (116), e53704, doi:10.3791/53704 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter