Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Синтез Thermogelling поли (N-изопропилакриламида) -graft-хондроитинсульфат композиты с альгинатом микрочастицами для тканевой инженерии

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

Инъекционный тканевой инженерии подмости состоят из поли (N-изопропилакриламида) -graft-хондроитинсульфат получали (PNIPAAm-г-CS) -содержащие микрочастицы альгината. Адгезионная прочность, способность к набуханию и в пробирке биосовместимости анализируются в данном исследовании. Методы определения характеристик, разработанные здесь, могут быть применимы к другим системам thermogelling.

Abstract

Инъекционные биоматериалы определяются как имплантируемые материалы , которые могут быть введены в организм в виде жидкости и затвердевают на месте. Такие материалы обеспечивают клинические преимущества имплантации минимально инвазивным и легко образуя заполняющей пространство твердых веществ в неправильной формы дефектов. Инъекционные биоматериалы широко исследованы в качестве Каркасы для тканевой инженерии. Тем не менее, для ремонта некоторых несущих областей в организме, такие как межпозвоночный диск, каркасы должны обладать адгезивными свойствами. Это позволит свести к минимуму риск дислокации во время движения и обеспечить плотный контакт с окружающей тканью, обеспечивая адекватную передачу усилий. Здесь мы опишем подготовку и характеристику помост, состоящей из термочувствительного поли (N-изопропилакриламида) -graft-хондроитин сульфат (PNIPAAM-г-CS) и альгината микрочастицы. Сополимер PNIPAAm-г-CS образует вязкий раствор в воде при комнатной температуре, в котором альгинате частицы взвешены для улучшения адгезии. Над нижней критической температурой растворения (НКТР), около 30 ° C, сополимер образует твердый гель вокруг микрочастицами. Мы адаптировали стандартные процедуры биоматериалы характеризации учитывать обратимый фазовый переход PNIPAAm-G-CS. Результаты показывают, что введение 50 или 75 мг альгинатных частиц / мл в 5% (вес / объем) растворов PNIPAAm-г-CS вчетверо адгезионная прочность на разрыв PNIPAAm-ГКС в одиночку (р <0,05). Включение альгинатных микрочастиц также значительно увеличивает набухаемость PNIPAAm-G-CS (р <0,05), что помогает поддерживать заполняющей пространство гель внутри дефектов тканей. И, наконец, результаты пробирке токсикологии набора для анализа в, 2,3-бис- (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -2H-тетразолия-5-carboxanilide (ХТТ) и Живой / Мертвый анализа жизнеспособности показывают , что клей способен поддерживать выживание и пролиферацию инкапсулированного эмбриональной почки человека (НЕК) 293 гргезов в течение 5 дней.

Introduction

Инъекционные биоматериалы являются те , которые могут быть удобно доставлены в организм в виде жидкости и затвердевает на месте. Такие материалы широко применяются в регенеративной медицине, где они используются для доставки инкапсулированные клетки на пораженное место 1-4 и действовать в качестве трехмерной временной внеклеточного матрикса для клеток 5. Для пациента, инъекционные биоматериалы являются предпочтительными, так как хирургические процедуры имплантации являются минимально инвазивной и твердая фаза может заполнить неправильной формы дефектов тканей, устраняя необходимость в имплантатах нестандартного размера.

Нагнетаемости может быть достигнуто с помощью различных механизмов. Внешние факторы, как рН, были исследованы в качестве триггера для образования гелей , которые инкапсулируют клетки и биологически активные молекулы 6-8. Тем не менее, рН может быть не самым удобным триггер для использования во всех физиологических условиях. Другой традиционный альтернаный для достижения Нагнетаемость используется на месте химической полимеризации или сшиванию в. Группа разработала водорастворимый окислительно - восстановительной системы , состоящей из персульфата аммония и N, 'N' тетраметилэтилендиамина N, N и использовали его для взаимодействия макромеры , состоящие из полиэтиленгликоля и поли (пропилен) гликоль 9,10. Зан и др. 11 развитых инъекционные хитозан поливиниловый сети сшивают с помощью глутаральдегида. В таких системах, цитотоксичность реактивных компонентов необходимо учитывать, особенно для применений, связанных с клеточной инкапсуляция. Кроме того , экзотермическая полимеризация может произвести достаточно высоких температур , чтобы поставить под угрозу окружающие ткани, о котором было сообщено на полимерную костные цементы 12,13.

Тем не менее другие инъекционные полимерные системы были разработаны, которые демонстрируют переход от жидкого состояния в твердое состояние с температурой в качестве триггера. Известные как системы thermogelling, это aqueoнам полимерные растворы , которые не требуют химического стимула, мономеров или сшиватели для достижения в образовании на месте 14. Скорее всего, происходит фазовый переход, как правило, происходит вблизи физиологической температуре вызывает образование физически сшитый трехмерной сети. Полоксамеры , такие как Pluronic F127 являются одними из наиболее широко изученных полимеров для thermogelling доставки лекарственных средств и клеток 15-17 инкапсуляцию 18,19. Тем не менее, хорошо принято считать, что эти гели нестабильны при физиологических условиях. Исследования показали повышенную стабильность при помощи удлинителей цепи 20 или химические сшиватели 21,22. Тем не менее, использование этих реагентов может ограничить потенциал материалов для клеточного инкапсулирования.

Поли (N-изопропилакриламид) представляет собой синтетический thermogelling полимер , который получил значительное внимание в тканевой инженерии и доставки лекарственных средств 14. Водные растворы поли (N-isopropилакриламида) (PNIPAAm) демонстрируют более низкую критическую температуру раствора (НКТР), как правило , происходит около 32 - 34 ° C 23,24. Ниже НКТР, вода гидратов PNIPAAm цепи. Выше температуры перехода, полимер становится гидрофобным, что приводит к резкому разделению фаз и 25-27 образованием твердого геля без использования токсичных мономеров или сшивающих агентов. Тем не менее, PNIPAAm гомополимеры демонстрируют плохие упругие свойства и удерживать небольшое количество воды при физиологической температуре из - за гидрофобности 28. В этой работе, мы решили включить хондроитин сульфат , ковалентно в сеть PNIPAAm, которая открывает возможности для ферментативного расщеплению 29, противовоспалительной активности 30,31 и увеличение воды и поглощение питательных веществ 32. PNIPAAm сополимеры с CS получали в нашей лаборатории путем полимеризации мономерной NIPAAm в присутствии метакрилата-функционализированного CS с образованием привитой сополимер (PNIPAAm-г-CS). BecAUSE низкой плотности сшивки сополимера, PNIPAAm-г-CS образует вязкий раствор в воде при комнатной температуре и эластичный гель при физиологической температуре из - за НКТР 29. Растворы полимеров становятся текучими снова при охлаждении ниже НКТР благодаря обратимости перехода.

Мы показали , что PNIPAAm-г-CS имеет потенциал , чтобы функционировать в качестве тканевой инженерии строительные леса, из - за механических свойств , которые могут быть адаптированы, к расщеплению и cytocompatibility с эмбриональной почки человека (НЕК) 293 клетках 29. Тем не менее, в некоторых несущих нагрузки областях, таких как межпозвоночный диск, тканевой инженерии каркасы должны иметь возможность сформировать значительный интерфейс с окружающей тканью диска , чтобы исключить риск дислокации 33. Этот интерфейс также необходим для адекватной передачи силы через границу раздела между имплантатом и тканью 33. В нашей работе, мы приостановилиlginate микрочастицы в водных растворах PNIPAAm-G-CS и обнаружили , что гелеобразование локализует микрочастицы, которые обеспечивают сцепление с окружающей тканью 34. В этой статье мы опишем шаги для подготовки thermogelling, липкого полимера. Стандартные методы для биоматериалов характеристик, визуализации клеток, а также тесты на жизнеспособность были адаптированы учитывать чувствительность температуры полимера и обратимость фазового перехода. Полимер инъекционный описанный в этой статье имеет большой потенциал для доставки лекарств и тканевой инженерии применения вне описанных в данной статье. Кроме того, методы определения характеристик, описанные здесь, могут быть применимы и к другим системам thermogelling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Поли (N-изопропилакриламид) -g-хондроитинсульфат Синтез

  1. До синтеза биоадгезивного гидрогеля, очищают N-изопропилакриламид (NIPAAm) мономер и метакрилата хондроитинсульфат (CS).
    1. Взвесить по крайней мере, 10 г NIPAAm и растворения мономера в 400 мл н-гексана при температуре 60 ° С. Перемешать контейнер периодически до полного растворения. Перекристаллизовывают раствор в C морозильной камере -20 ° в течение 24 ч.
    2. Удалите кристаллизуется мономер из контейнера и вакуумного фильтра н-гексана с использованием воронки Бюхнера. Поместите мономер в вакуумной печи при комнатной температуре в течение 24 ч, чтобы удалить остатки н-гексана. Храните мономер в -20 ° C морозильнике для последующего использования (см шаг 1.2).
    3. Взвесить и растворить 2,0 г сульфата хондроитина в 8,0 мл деионизированной воды. Осторожно нагревают раствор до 60 ° С.
    4. Доводят рН раствора до 10, используя примерно от 10 до 40 мкл 50% (вес / вес) раствор NaOH,
    5. Добавить 0,298 мл ангидрида метакриловой кислоты (MA). Нагревание с обратным холодильником в течение 24 ч при перемешивании при 60 ° С.
    6. Налейте 400 мл раствора ацетона в банку и чилл O / N в C морозильной камере -20 °.
    7. Через 24 часа прошло, медленно влить весь раствор метакрилированные CS (MCS) в 400 мл холодного ацетона, при перемешивании магнитной мешалкой.
    8. Удалите MCS из ацетона и помещают осадок в вакуумной печи. Выполните этот шаг быстро, чтобы сохранить нетронутыми и сплоченную состояние для MCS. Разрешить остаточный ацетон испарится в вакууме в течение по меньшей мере 24 ч.
  2. Со-растворять 10 г очищенного NIPAAm и 2.209 г MCS в 232 мл деионизированной воды.
  3. Продувку раствора кислорода с использованием инертного газа азота. Поддерживать энергичное, скорость еще низкий расход потока газа, чтобы предотвратить решение от брызжет в течение 15 мин.
  4. Продолжить продувки раствора газообразным азотом и добавляют 0,976 мл tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Далее, инициировать реакцию полимеризации путем смешивания 97,6 мг персульфата аммония (APS).
  6. Приготовьте раствор в течение примерно 20 секунд и быстро запечатать решение, чтобы предотвратить любое попадание воздуха в сосуд. Дайте раствору полимеризоваться под флуоресцентным светом в течение 24 часов.
  7. Через 24 часа поместите реакционный сосуд в 37 ° C духовке. Разрешить гидрогель переход из жидкости в желеобразное состояние. Submerge полимеризованного гидрогеля в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение в общей сложности на 7 дней, чтобы обеспечить диффузию непрореагировавшего мономера из гидрогеля.
  8. Используя пару ножниц, разрезать гидрогеля на несколько маленьких кусочков, размером не более 5 см в диаметре. Для того, чтобы предотвратить гидрогель от перехода из гелеобразного состояния в жидкое, кости полимера в растворе PBS С 37 °. Перенесите порции в 50 мл конические пробирки.
  9. Подготовка образцов для лиофилизации путем обертывания вершиныпробирки с Kimwipes и резинками. Замораживание труб при температуре -70 ° С в течение от 1 до 2 ч.
  10. Поместите конические пробирки на лиофильной сушилке, чтобы удалить всю воду из гидрогеля. Перед эксплуатацией сублимационной сушилки должна достигать температуры и давления приблизительно -40 ° С и 0,04 мбар, соответственно. Минимум 7 дней требуется для полного высыхания.
  11. Измельчить лиофилизированный полимера в мелкий порошок и хранить в 4 ° C холодильнике для последующего использования (см шаг 3.1).

2. Кальций-альгинат сшитых микрочастицы Синтез

  1. Приготовьте 2% (вес / объем) альгинат раствор путем растворения 400 мг в 20 мл деионизированной воды. Раствор нагревают примерно до 60 ° С, чтобы облегчить растворение.
  2. Приготовьте 2% (вес / объем) раствора хлорида кальция путем добавления 400 мг в 20 мл деионизированной воды.
  3. Создание масло в воде смеси путем объединения 100 мл масла канолы, 1,0 мл Tween 20 и 20 мл2% (вес / объем) альгината. Эмульгировать смесь в течение 10 мин с помощью гомогенизатора при 15000 оборотов в минуту. Кроме того, смесь с помощью магнитной мешалки со скоростью 200 оборотов в минуту или 2000 оборотов в минуту для создания больших или маленьких микрочастицы, соответственно.
  4. Аспирируйте 2% (вес / объем) раствора хлорида кальция с использованием шприца с 18 G кончика иглы. Медленно добавляют хлорид кальция по каплям в эмульсию.
  5. После того, как 20 мл хлористого кальция, были исчерпаны, позволяют микрочастицы внутри эмульсии, сшивание в течение 10 мин.
  6. Равномерно распределить партию микрочастиц в 50 мл крышками конические пробирки и центрифуге с усилием 1,400 х г в течение 2 мин, чтобы удалить первоначальный слой масла канолы.
  7. Последовательная мыть, вихрь, и центрифуга микрочастицы с изопропанолом в общей сложности три раза при 1400 г в течение 2 мин, чтобы удалить остатки масла канолы. Выбросьте изопропиловым супернатант после каждой стадии центрифугирования и промывают свежим изопропанолом.
  8. После того, как О.И.л был удален, повторите процедуру еще три раза деионизированной водой, чтобы удалить остатки изопропиловый спирт. Выбросите деионизированная супернатант воды после каждой стадии центрифугирования и промыть свежей деионизованной водой. Удалить примерно 100 мг влажных микрочастиц и хранить во флаконе. Влажные микрочастицы будут использоваться для измерения среднего диаметра шихты с помощью световой микроскопии.
    1. С помощью световой микроскопии, дисперсных небольшой образец влажных микрочастиц в деионизированной воде на предметное стекло микроскопа. В зависимости от размера микрочастицы, используют объектив 10X или 20x, и регулировать числовую апертуру, пока частицы не попали в фокус. Убедитесь в том, что микроскоп откалиброван для правильной цели и регулировки яркости источника света по мере необходимости. С помощью инструмента линии для измерения длинный диаметр 50 случайных альгинатных микрочастиц и получить средний размер для партии.
  9. Приготовьте микрочастицы для лиофилизации бу обмотав их Kimwipes и обеспечение их резинками. Замораживание микрочастицы при -70 ° С в течение 1 часа.
  10. Поместите микрочастицы на лиофилизации и позволяют образец высохнуть в течение по крайней мере 24 часов. Измельчите лиофилизированный микрочастицы в мелкий порошок с помощью ступки и пестика и хранят в 4 ° C холодильнике для последующего использования (см шаг 3.3).

3. Подготовка Адгезивы

  1. Использование лиофилизированного порошка полимера, создают 5% (вес / объем) раствор PNIPAAm-г-CS путем растворения 50 мг гидрогеля порошка в 1 мл 1х PBS.
  2. Приготовьте раствор, используя вихревой и охладить в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 24 ч.
  3. После того, как вязкие формы раствор, создают однородную композит путем добавления 25 или 50 мг лиофилизированных микрочастицы альгината к раствору гидрогель и вихря. Хранить композитный материал в холодильнике при температуре 4 ° С для последующего использования (см шаги 4.3 и 4.8).

4. биоадгезивный Мехanical Испытания на растяжение

  1. Перед проведением испытаний на растяжение, хрящевой экстракт субстрат из уха свиньи.
    1. Размораживание свиных уха в теплом 0,9% (вес / объем) раствора NaCl; это поможет ослабить ткань.
    2. Используя скальпель, изолировать и участок от плоской прямоугольной области путем разрезания по вертикали, хотя эпидермального слоя, подкожной клетчатки и хряща. Избегайте резки изогнутые хребты свиных уха.
    3. Отделить эпидермальный слой кожи от хряща путем разрезания параллельно через подкожную ткань. Хрящ представляет собой твердый, белый ткань, находящаяся под свиной кожи.
    4. Тщательно очистить подкожную ткань, которая присоединена к хрящу с боковой скальпелем. Избегайте резки в хрящевой ткани с скальпелем.
    5. Убедитесь, что только одна сторона хряща подвергается и плоской во время испытания на растяжение. При необходимости выравнивать хрящ, отрезав неровную кожу на нижней стороне.
    6. Вырезать хрящевой ткани на несколько частей с размерами 1 см х 1 см. Хранить ткани хряща в конических труб, заполненных 0,9% (вес / объем) NaCl, раствором в -20 ° C морозильнике.
  2. Готовят 2,0 л 0,9% (вес / объем) раствора NaCl. Предварительно нагреть физиологический раствор до 37 ° С. Температура этого раствора необходимо будет поддерживаться в течение испытаний.
  3. Размораживание замороженного хрящ. Держите как свиной хрящ и образцы гидрогеля в пенополистирола контейнер с пакетами льда.
  4. Прикрепите датчик силы к руке испытательного стенда. Поместите конфорки на верхней части силового стенда и установить температуру до 50 ° C.
  5. Affix 1 см х 1 см кусок хряща на блок из нержавеющей стали с цианакриловым клеем и пинцетом. Клей дополнительный кусок хряща в цилиндр Delrin и прикрепить цилиндр к датчику силы. Очень важно, чтобы обе поверхности хряща обращены друг к другу и связаться с гидрогелем.
  6. Местоводяная баня из плексигласа на верхней поверхности варочной панели и вставить блок из нержавеющей стали с хрящевой подложкой внутри ванны.
  7. Опустите руку испытательного стенда и выровнять оба хрящевых подложки друг с другом. Поднимите руку и оставить достаточно места, чтобы применить гидрогель.
  8. При положительном пипеткой смещения, обойтись 200 мкл биоадгезивный гидрогеля к нижней части хряща.
  9. Опустите руку силового стенда на расстоянии 1 мм / мин до гидрогеля контактов верхний кусок хряща и не оказывает предварительный натяг 0,001 N.
  10. Налейте 37 ° С солевой раствор в ванне до тех пор, пока объем не достигнет обозначенного уровня воды. Проверьте температуру раствора с термопарой.
  11. Дайте гидрогель установить в общей сложности 5 минут. После того, как гель затвердеет, поднимите руку со скоростью 2 мм / мин. Испытание завершается, как только биоадгезивный отсоединяется от подложки хрящевой или когда значительное падение силы происходит,сигнализации сбоя.
  12. Сбор записанных данных и поднять руку на испытательном стенде. Снимите цилиндр Delrin от датчика силы. Налейте раствор соли в его прежнее емкости и повторного нагрева до 37 ° С.
  13. Расчет напряжений путем вычитания усилие, оказываемое полимером с выталкивающей силой "пустой", вложение Delrin, без хрящей или клея, поднятый с той же скоростью, и деления на области связи.

5. Отек Исследование PNIPAAm-G-CS с альгината микрочастицами

  1. Приготовьте чистые стеклянные флаконы и маркировать их соответствующим образом с точки времени, тип образца и количество образцов. Адгезивы могут также быть созданы, как описано выше. Приготовьте в общей сложности пять образцов (п = 5) для каждого типа образца в момент времени.
  2. Предварительно взвесьте все стеклянные флаконы и записывают их первоначальную массу при комнатной температуре.
  3. С помощью шприца обойтись примерно 0,4 мл приготовленного клеевого образца в каждой из пяти флаконов.Повторите этот шаг для каждого типа образца во всех протестированных временных точках.
  4. Взвешивают и записывают массу каждого флакона с клеевого типа образца при комнатной температуре.
  5. Предварительно нагреть орбитальном инкубаторе и 1 л раствора 1X PBS до 37 ° С.
  6. Организовать все флаконы на стойке и вставьте стойку в инкубатор. Разрешить клей для перехода из жидкости в гель в течение примерно от 5 до 10 мин.
  7. Добавить 5,0 мл 1x PBS в каждую пробирку. Обязательно тщательно добавляют раствор PBS по стенке флакона, чтобы предотвратить гидрогеля диск от распада.
  8. Закрывают каждый флакон для предотвращения испарения раствора PBS и поддерживать внутреннюю температуру инкубаторе при температуре 37 ° С. Каждый набор гидрогеля дисков необходимо будет оставаться под водой в PBS в течение указанного промежутка времени.
  9. После того, как момент времени 7 день было достигнуто, вынимать капсюль набор флаконов и удаления раствора PBS из каждого флакона. Взвесить каждый флакон образца адгезива снова при комнатной температуре.
<р класс = "jove_title"> 6. Качественный Жизнеспособность клеток Использование Live / Dead Пробирной

  1. Перед выполнением Live / Dead анализа с PNIPAAm-G-CS, растут эмбриональных почки человека 293 клеток (НЕК-293) до 80% слияния.
    1. Быстро оттаивают замороженную НЕК-293 клеточной суспензии путем размещения криопробирку на водяной бане 37 ° С, затем центрифугировать клетки при 400 мкг при 4 ° С в течение 5 мин в 15 мл коническую пробирку.
    2. Для того, чтобы сделать среду для роста клеток первого пассажа, сочетают в высоким содержанием глюкозы (4,5 г / л) Игла в модификации орла Средний (DMEM), с инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) до конечной концентрации 20% и 100х пенициллин-стрептомицина раствора ( ручка-Strep) до конечной концентрации 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Для всех других местах, перейти к DMEM с 10% FBS и 1x перо-стрептококк.
    3. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл среды для роста и переноса суспензии в одну 100 мм чашках диаметром тарелки. Равномерно distribute клетки, осторожно наклонив блюдо спереди назад и слева направо несколько раз в каждом направлении.
    4. Культуры клеток в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% CO 2. При необходимости изменить среду каждые два дня.
    5. Когда клетки достигают 80% слитности, размножить культуру на несколько блюд. Извлеките носитель из пластины.
    6. Добавляют 1 мл 0,5% -ного трипсина к пластине. Разрешить планшеты инкубировали при 37 ° С в течение 10 мин. Проверьте, чтобы увидеть, если клетки отделяются от поверхности, осторожно вращая пластину.
    7. Для разделения культуры в соотношении 1:10, добавляют 9 мл регулярной среде роста (DMEM с 10% FBS) к трипсином клетки и аккуратно перемешать, наклоняя тарелку.
    8. Разливают по 1 мл разбавленной суспензии клеток в каждую новую чашку и добавляют 9 мл ростовой среды. Аккуратно перемешайте, наклоняя тарелку.
    9. Культуры клеток в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% CO 2. При необходимости изменить среду когда-либоу два дня до клетки достигают 80% слияния.
  2. Извлеките носитель из двух блюд культуры выращивают до 80% слияния.
  3. Добавляют 1 мл 0,5% -ного трипсина в каждую чашку. Разрешить планшеты инкубировали при 37 ° С в течение 10 мин. Проверьте, чтобы увидеть, если клетки отделяются от поверхности, осторожно вращая пластину.
  4. Промыть клетках НЕК-293 на пластине при помощи 3 мл ростовой среды, в два раза и добавить обе суспензии в те же 15 мл коническую трубку.
  5. Центрифуга 15 мл коническую трубку в течение 10 мин при 400 мкг при 4 ° С.
  6. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл среды с помощью пипетки вверх и вниз.
  7. Пипетка 10 мкл клеточной суспензии в гемоцитомер и выполнять подсчет клеток, чтобы определить плотность клеток. Увеличение объем суспензии в среде, если начальная концентрация клеток слишком высока, и, наоборот, уменьшить громкость, если концентрация слишком низка, чтобы сохранить целевой ОБОГАЩЕНИЯРацион 1 × 10 6 клеток / мл. Центрифуга клетки НЕК-293 в дозе 400 мкг и ресуспендируют осадок клеток в скорректированного объема средств массовой информации, соответственно.
  8. Аккуратно вихрь клеточной суспензии и равномерно распределить смесь клеток на четыре отдельные 15 мл конические пробирки для следующих условий испытаний: положительный контроль однослойных, отрицательный убил управления в PNIPAAm-G-CS с использованием 70% (об / об) метанол, НЕК-293 клетки, инкапсулированные в PNIPAAm-G-CS и НЕК-293 клетки, инкапсулированные в PNIPAAm-G-CS с альгинатных микрочастиц.
  9. Создание положительных монослоев управления пипеткой кратным 300 объемов мкл смеси клеток в 24-луночный планшет для генерации 4-6 образцов репликации.
  10. Извлеките носитель из конических труб, имеющих отношение к убитому управления, PNIPAAm-G-CS и PNIPAAm-G-CS с альгинатных микрочастиц.
    1. Центрифуга конические пробирки в течение 5 минут при 400 х г и удалить супернатант.
    2. Поддерживать такую ​​же концентрацию клеток путем ресуспендирования гргезов в том же объеме PNIPAAm-G-CS в качестве удаленного средства массовой информации. Пипетировать смесь полимера клеток вверх и вниз, не используя серологические пипетки до получения однородной консистенции.
      1. Если затравки альгинатных микрочастиц, перевести суспензию PNIPAAm-г-CS-клеток (полученный, как описано для 6.10.2) в чашку для культивирования 35 мм и ввести частицы в смеси. Пипетировать смесь клеток вверх и вниз, не используя серологические пипетки до получения однородной консистенции.
    3. С помощью серологической пипетки, дозировать множественные 300 мкл смеси полимера клеток в каждую из лунок, для контроля убитой, PNIPAAm-г-CS, и PNIPAAm-г-CS с альгинатных микрочастицами для генерации 4 - 6 образцов репликации.
  11. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение от 10 до 15 мин и позволяют PNIPAAm-G-CS для перехода из жидкости в гель (полимер образует непрозрачный белый диск).
  12. Поместите слайд теплее в капот и установить температуру до 37 ° С. Используйте слайд теплее для поддержания луночного планшетатемпература и пипетка 600 мкл подогретого СМИ в каждую лунку. Для дальнейшего предотвращения переходе полимера в жидком состоянии, положение лампы с флуоресцентной лампой над блюдом прогреть воздух над ним.
  13. Инкубируйте клетки в течение 5 дней при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
  14. Через пять дней прошло, подготовить / смесь живых мертвецов с помощью красителя этидия гомодимер (EthD-1) и кальцеина AM. Оба вещества светочувствительными и подготовлены в день использования.
    1. Разморозьте кальцеина AM и EthD-1 из набора при комнатной температуре.
    2. Добавляют 5 мл стерильного 1x PBS с конической трубкой и завернуть его в алюминиевую фольгу.
    3. Добавить 6,67 мкл 2 мМ EthD-1 в конической трубе. Vortex смесь раствора тщательно.
    4. Затем добавляют 2,5 мкл 4 мМ кальцеина AM к конической трубе. Vortex смесь тщательно.
  15. Выньте материал из лунок монослоя (положительный контроль), PNIPAAm-г-CS и PNIPAAm-г-CS остроумияч альгината микрочастицы. Вымойте все лунки тщательно, но осторожно, с PBS и удалить PBS.
  16. Разрешить гидрогелевые диски, содержащие альгинатные микрочастицы для разжижения при комнатной температуре и добавляют 2 мл 50 мМ цитрат натрия в каждой из лунок.
  17. Извлеките носитель из убитых клеток лунок (отрицательный контроль). Разрешить гидрогелевые диски для разжижения при комнатной температуре и добавляют 300 мкл 70% (об / об) метанола в каждую лунку.
  18. Инкубируйте планшет в течение 45 мин при 37 ° С.
  19. Удалите цитрат натрия и растворов метанола из лунок и пипеткой каждой из гидрогеля суспензий в отдельные микропробирок. Центрифуга пробирки при 2000 х г в течение 10 мин, чтобы отделить клетки от гидрогеля подвески.
  20. Осторожно снимите подвеску с помощью пипетки раствор из коническую трубку и оставляя после клеточного осадка. Ресуспендируют осадок в 300 мкл PBS и переносят в оригинальной луночного планшета.
  21. Добавить 300 мкл тон Live / Dead смесь красителя каждой из лунок. Обертка луночный планшет в алюминиевую фольгу и инкубируют в течение 45 мин на качалке при комнатной температуре.
  22. Изображение все образцы под инвертированным флуоресцентным микроскопом с объективом 10Х. Живые клетки и клетки убитые будут отображаться зеленым и красной флуоресценции, соответственно.

7. Количественный Жизнеспособность клеток с использованием анализа ХТТ

  1. Рост клеток НЕК-293, до 80% слияния. Извлеките носитель роста из двух блюд культуры.
  2. Добавляют 1 мл 0,5% -ного трипсина в каждую чашку. Разрешить планшеты инкубировали при 37 ° С в течение 10 мин. Проверьте, чтобы увидеть, если клетки отделяются от поверхности, осторожно вращая пластину.
  3. Промыть клетках НЕК-293 на пластине при помощи 3 мл среды в два раза и добавить обе суспензии в те же 15 мл коническую трубку.
  4. Центрифуга 15 мл коническую трубку в течение 10 мин при 400 мкг при 4 ° С.
  5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл средыпипетированием вверх и вниз.
  6. Пипетка 10 мкл клеточной суспензии в гемоцитомер и выполнять подсчет клеток, чтобы определить плотность клеток. Как было описано ранее, сохраняют целевую концентрацию 1 × 10 6 клеток / мл. Центрифуга клетки НЕК-293 в дозе 400 мкг и ресуспендируют осадок клеток в скорректированного объема средств массовой информации, соответственно.
  7. Аккуратно вихрь клеточной суспензии и равномерно распределить смесь клеток на четыре отдельные 15 мл конические пробирки для следующих условий испытаний: положительный контроль однослойных, отрицательный убил управления в PNIPAAm-G-CS с использованием 70% (об / об) метанол, НЕК-293 клетки, инкапсулированные в PNIPAAm-G-CS и НЕК-293 клетки, инкапсулированные в PNIPAAm-G-CS с альгинатных микрочастиц.
  8. Создание положительных монослоев управления пипеткой 300 мкл смеси клеток в 24-луночного планшета для создания 4 - 6 образцов дублирующие.
  9. Извлеките носитель из конических труб, имеющих отношение к убитому управления, PNIPAAm-г-CS и PNIPAAm-g-CS с альгинатных микрочастицами.
    1. Центрифуга конические пробирки в течение 5 мин при 400 х г и удалить супернатант.
    2. Поддерживать ту же концентрацию клеток путем ресуспендирования клеток в том же объеме PNIPAAm-G-CS в качестве удаленного средства массовой информации. Пипетировать смесь клеток вверх и вниз, не используя серологические пипетки до получения однородной консистенции.
      1. Если затравки альгинатных микрочастиц, перевести суспензию PNIPAAm-г-CS-клеток в культуре блюдо 35 мм и ввести частицы в смеси. Пипетировать смесь клеток вверх и вниз, не используя серологические пипетки до получения однородной консистенции.
    3. С помощью серологической пипетки, обойтись 300 мкл смеси полимера клеток в каждую из лунок, для контроля убитой, PNIPAAm-г-CS, и PNIPAAm-г-CS с альгинатных микрочастицами для генерации 4 - 6 образцов репликации.
  10. После того, как все ячейки, содержащие образцы, которые были добавлены к 24-луночный планшет, дозировать множественные 300 томов мкл PNIPAAm-G-CS и PNIPAAm-G-CS с альгинатных микрочастиц без клеток в соседних скважинах для создания 4 - 6 образцов дублирующие.
  11. Выдержите 24-луночный планшет при 37 ° С в течение от 10 до 15 мин и позволяют PNIPAAm-G-CS для перехода из жидкости в гель (полимер образует непрозрачный белый диск).
  12. Поместите слайд теплее в капот и установить температуру до 37 ° С. Используйте слайд теплее, чтобы поддерживать температуру пластин также и для пипеток 600 мкл подогретого прозрачного DMEM в каждую лунку. Для дальнейшего предотвращения переходе полимера в жидком состоянии, положение лампы с флуоресцентной лампой над блюдом прогреть воздух над ним.
  13. Инкубируйте клетки в течение 5 дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2.
  14. Через пять дней прошло, готовят 2,3-бис- (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -2H-тетразолия-5-carboxanilide реагента (ХТТ) от производителя. Реагент ХТТ летуч и подготовлен на день использования.
    1. Удалить бутылки янтаря содержатING порошок ХТТ из холодильника. Используя стерильный шприц и иглу, вводят 5 мл прозрачного DMEM (без фенола красного) через резиновую перегородку в бутылку янтарного.
    2. Нагреть реагент до 56 ° С на водяной бане в течение 10 мин или до полного растворения.
    3. Далее разбавить реагента ХТТ до 20% (об / об) в 15 мл коническую трубку заворачивают в алюминиевую фольгу. Алиготе избыток реагента ХТТ в микропробирок и поместить их в -20 ° C морозильнике в течение длительного хранения.
  15. Извлеките носитель из убитых клеток скважин (отрицательный контроль) и добавьте 300 мкл 70% (об / об) метанола в каждую лунку. Инкубировать в течение 45 мин при 37 ° С и удаления метанола из лунок.
  16. Извлеките носитель из остальных скважин монослоя (положительный контроль), PNIPAAm-г-CS и PNIPAAm-г-CS с альгинатных микрочастицами. Вымойте все лунки тщательно, но осторожно, с PBS, а затем удалить PBS.
  17. Добавить 300 мкл 20% ХТТ реагента к каждой из лунок. Обертка 24-луночный планшет в алюминиевую фольгу и инкубируют в течение 24 часов на качалке при комнатной температуре.
  18. Через 24 часа добавляют 200 мкл 50 мМ цитрат натрия, чтобы все лунки и инкубировать на качалке в течение одного дополнительного часа.
  19. Перенесите все полимерные суспензии для микропробирок и центрифуге при 2000 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
  20. Перенести 200 мкл супернатанта из каждой трубки микроцентрифужных на 96-луночный планшет. Использование ридере, получить конкретные показания оптической плотности при длине волны 450 нм и неспецифических значений оптической плотности при 690 нм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Термочувствительный привитый сополимер был успешно синтезированы и охарактеризованы своей биоадгезивный силы, способность к набуханию и экстракорпоральное cytocompatibility. Мы решили исследовать альгинат из-за его хорошо зарекомендовавших мукоадгезивных свойств. Альгинат микрочастицы, со средним диаметром 59,7 ± 14,9 мкм, смешивали с 5% (вес / объем) PNIPAAm-г-CS в концентрациях 25, 50 и 75 мг / мл. Эти концентрации были основаны на одной половине, равной и удвоенной эквивалентной сухой массе PNIPAAm-G-CS в водном растворе. Концентрации микрочастица выше 75 мг / мл выставлялись чрезмерную вязкость и не были исследованы. Максимальная адгезионная прочность на разрыв 5% (вес / объем) PNIPAAm-г-CS с различными концентрациями альгината микрочастицы по сравнению с одним гидрогеля. Добавление 50 или 75 мг / мл альгината микрочастицы суспендируют в 5% (вес / объем) PNIPAAm-г-CS привело к четырехкратному Increase предела прочности при растяжении (р <0,05), как показано на рисунке 1. Концентрация микрочастицами 25 мг / мл не показали значительное увеличение предела прочности на разрыв по сравнению с 5% (вес / объем) PNIPAAm-G-CS (р> 0,05). Там не было никаких существенных изменений в прочности на разрыв 5% (вес / объем) PNIPAAm-г-CS, когда концентрация альгинатных микрочастиц была увеличена с 50 до 75 мг / мл (р> 0,05).

Набухания свойства биоадгезивный гидрогеля характеризовались погружая различные составы в PBS при 37 ° С. Альгинат концентрации микрочастицы 25 и 50 мг / мл были протестированы для выявления каких-либо различий в набухание. Альгинат микрочастицы были измерены с использованием световой микроскопии и имели средний диаметр 25,0 ± 14,4 мкм. Через 7 дней, начальная и конечная влажная масса гидрогеля дисков были записаны и изменение массы было рассчитано для нескольких образцов на клеевой formulatioп (п = 5). На рисунке 2 показано резкое различие в изменении массы среди всех композиций. Клеи, содержащие и 25 и 50 мг / мл альгината микрочастицами продемонстрировали положительные изменения в массе, в то время как 5% (вес / объем) PNIPAAm-г-CS уменьшилась в массе. Обнаружено, что все образцы, значительно отличаются друг от друга (р <0,05) с клеем, содержащим 50 мг / мл альгината микрочастицы обнаруживают высокую степень набухания.

Биосовместимость предлагаемого клея был исследован как качественно, так и количественно за счет использования живого / Dead и ХТТ цитотоксичности. НЕК-293 клетки были инкапсулированы в обоих 5% (вес / объем) PNIPAAm-г-CS и 5% (вес / объем) PNIPAAm-г-CS, содержащего 50 мг / мл альгината микрочастицы со средним диаметром 59,7 ± 14,9 мкм , Монослой клеток и инкапсулированных клеток в PNIPAAm-G-CS убитых с 70% метанола считается положительным и Негативного управления, соответственно. Рецептуры засевали клетками характеризовались после 5 дней роста в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% CO 2. Каждый тест показал хорошую жизнеспособность клеток для обоих PNIPAAm-G-CS и PNIPAAm-G-CS с микрочастицами. Изображения на фиг.3 показаны живые клетки флуоресцирующих зеленым в обоих клеевых составов (панели А и В) и монослой клеток, выступающей в качестве положительного контроля (Группа C). Погибшие клетки (Группа D) флуоресцирует красный цвет и показать гибель клеток. Результаты тестов на цитотоксичность ХТТ подтвердили результаты Live / Dead анализа. Относительную жизнеспособность клеток клея , содержащего 50 мг / мл микрочастицами уменьшилась в 1,3 раза по сравнению с PNIPAAm-G-CS , как показано на фиг.4, но снижение не было статистически значимым (р> 0,05). Оба PNIPAAM-г-CS и PNIPAAM-г-CS с микрочастицами также имели сравнимую жизнеспособность на клеточный монослой (р> 0,05). Капсула в гидрбыли обнаружены OGEL составы и монослой клеток, значительно отличаются по сравнению с отрицательным контролем (р <0,05). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что клей, содержащий микрочастицы, не только проявляет повышенную адгезионную прочность, но хорошую биосовместимость, а также.

Рисунок 1
Рисунок 1. Влияние на прочность на растяжение После внесения различных концентраций альгината микрочастицами в 5% (вес / объем) PNIPAAm-G-CS. Предел прочности на разрыв PNIPAAm-G-CS в четыре раза с добавлением 50 или 75 мг / мл альгината микрочастицами (р <0,5). Столбики ошибок обозначают расчетную 95% доверительный интервал (п = 5). Альгинат микрочастицы имели средний размер 59,7 ± 14,9 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Влияние различных концентраций альгината микрочастицами на набухаемость 5% (вес / объем) PNIPAAm-г-CS. Через 7 дней погружения в 37 ° C в PBS, PNIPAAm-г-CS снизилась в мокрой массы из - за гидрофобные свойства PNIPAAm выше НКТР. PNIPAAm-г-CS с 25 или 50 мг / мл альгинатных микрочастиц экспонируемых отечность способность. Повышение концентрации микрочастиц значительно увеличилось (р <0,05) изменение массы гидрогеля в течение 7 дней, приписываемый поглощения воды. Усы представляют собой рассчитанную 95% доверительный интервал. Альгинат микрочастицы имели средний размер 25,0 ± 14,4 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

gether.within-страница = "1"> Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель Live / Dead Флуоресцентные Изображения культивируемых клеток НЕК-293 в течение 5 дней. Клетки были заключены в (A) PNIPAAm-G-CS и (В) PNIPAAm-G-CS с 50 мг / мл альгината микрочастицами. Клетки выращивают также в (C) монослое и (D) убит с метанолом в PNIPAAm-G-CS для представления положительного и отрицательного контролей соответственно. Эксперимент Живой / Мертвый жизнеспособность повторяли три раза с тремя повторами в данном эксперименте. Шкала баров составляет 100 мкм. Альгинат микрочастицы имели средний размер 59,7 ± 14,9 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ftp_upload / 53704 / 53704fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Кратковременное Жизнеспособность НЕК-293 клеток в PNIPAAm-G-CS с альгинатом микрочастицами. Выживание инкапсулированных клеток НЕК-293 , в пределах PNIPAAm-G-CS с и без альгината микрочастицами оценивали и сравнивали с использованием XTT через 5 дней. Клетка монослой и инкапсулированные клетки в PNIPAAm-G-CS убиты с 70% метанолом, использовали в качестве положительных и отрицательных контролей, соответственно. Оба PNIPAAm-г-CS и PNIPAAm-г-CS с альгинатных микрочастиц не показали значительное снижение (р> 0,05) в жизнеспособности клеток по сравнению с клеточного монослоя, но показали значительное снижение (р <0,05) в жизнеспособности клеток по сравнению с убитыми клетки. Добавление альгината микрочастиц не приводит к существенному компромиссу жизнеспособность клеток PNIPAAm-G-CS (р> 0,05). Столбики ошибок обозначают расчетную 95% доверительный интервал (п = 3, шесть параллельных образцов на эксперимент). Альгинат микрочастицы имели средний размер 59,7 ± 14,9 мкм.исх = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть несколько важных шагов в синтезе гидрогель-микрочастицы композита и оценки ее прочности сцепления, способность к набуханию и клеточный биосовместимость. Радикальной полимеризации PNIPAAm-G-CS требует успешного methacrylation хондроитинсульфата, полное растворение компонентов мономера и условий реакции бескислородные. Был выбран Отношение NIPAAm мономера к метакрилированные хондроитинсульфата в реакционной смеси , так как это было продемонстрировано, в нашей предыдущей работе, для создания сополимеров с механическими свойствами , аналогичными нативный межпозвоночного диска ткани 29. Увеличение количества сульфата хондроитина в гидрогеле уменьшит потери воды во время гелеобразования и, таким образом, уменьшить жесткость на сжатие геля. Выбранная степень methacrylation также была продемонстрирована для получения гидрогелей с благоприятными свойствами для обработки впрыскиваемости через 18 G иглу при растворении в водном растворе <SUP> 29. Повышенная степень метакрилата замещения CS увеличит плотность сшивания полимерной сетки, что вызывает увеличение вязкости раствора ниже НКТР и уменьшая гель набухание способности. Другие исследовали различные подходы в синтезе PNIPAAm гидрогели , такие как с переносом атома радикальной полимеризации (РППА) 35 или обратного добавлени-осколочной передачи цепи (RAFT) 36. Полимеризация с помощью ATRP привело к развитию узких, полидисперсных гидрогелей с настроенным оштрафован молекулярной массой путем изменения мономера к инициатору соотношение. Функциональные группы могут быть привиты в гребенчатой ​​способом с использованием полимеризации плота таким образом воздействуя полимерную цепь, спутывание и фазовое разделение.

Однородная вода-в-масле смесь необходимо при создании однородных, сшитой микрочастицы альгината. Эмульсионная методика проста для выполнения и не требует использования опасных химических веществ, однако оба его micropaСтатья форма и распределение трудно контролировать. размер микрочастицы может быть изменен за счет увеличения скорости перемешайте эмульсии, создавая тем самым более мелкие частицы и наоборот. В данном конкретном исследовании, альгинат размер микрочастицы был исследован в качестве потенциального имущества, которое может повлиять на опухоль, механику, или клеточную жизнеспособность. Рассеяние света также может быть использован в качестве альтернативы измерения среднего размера микрочастицы. Другие свойства , такие как эмульсии типа ПАВ и концентрации альгината будет воздействовать размер микрочастицы и образования агрегатов 37. Уменьшение концентрации альгината уменьшит размер микрочастицы, однако агрегаты, более вероятно, чтобы сформировать. Изменения в гидрофильной и гидрофобной природы поверхностно-активных веществ будет влиять на поверхностное натяжение между фазами масла и воды, следовательно, изменение размера капель внутри эмульсии. Альгинат микрочастицы могут в качестве альтернативы быть получены с использованием микрожидком устройство, которое позволяет для равномерного particlе форма и распределение узкий размер 38. Этот метод включает в себя диспергирование альгинат фазы в непрерывной масляной фазы, который протекает через канал и входит ванну хлорид кальция. Спрей draying это еще один метод , который производит очень маленькие микрочастицы 39. Важно также отметить, что альгинат может быть загружен с белками или факторами роста и могут быть сшиты с другими ионами двухвалентных, таких как цинк или барий.

В этой работе мы описываем клейкую систему потенциального применения в тканевой инженерии. Наше испытание на растяжение специально направлена ​​на количественную оценку адгезионной прочности композита при контакте с свиных хрящей. Этот тип подложки был выбран, чтобы имитировать адгезию гидрогеля композита к торцевым хрящевых пластинок межпозвонкового диска. Другие субстраты ткани, такие как свиной кожи, могут быть использованы в качестве альтернативы для количественной оценки прочности адгезионного 40, но тип ткани будетварьируются в зависимости от предполагаемого применения. Поддержание надлежащего контроля температуры солевого водяной бани и предварительного охлаждения композиционного материала перед его использованием имеют большое значение при точном измерении механических свойств. Повышенные температуры воды ванны выше 37 ° С приведет к тому, что гидрогель быстро сжиматься и застывают, тогда как композитные материалы, которые механически испытанные ниже 37 ° С будет демонстрировать уменьшилась прочность на разрыв из-за отсутствия разделения фаз. В настоящее время мы разрабатываем методы для исследования прочности сцепления при сдвиге различных клеевых составов для инъекций. Будущая работа будет включать в себя выполнение бывших естественных условиях механических испытаний с свиных IVDs , чтобы определить , является ли сопротивляется клеевой экструзии через кольцевое дефекта и восстанавливает биомеханические функциональность спинного сегмента движения.

Выше 32 ° C, PNIPAAm-г-CS сжимается и выталкивает воду из матрицы гидрогеля из-за поведения НКТР из PNIPAAm, в результате чего снизилась масса над7 - дневный период в PBS (Рисунок 2). С другой стороны, добавление альгинатных микрочастиц придает набухания и клей значительно увеличенный по массе (р <0,05) при концентрации микрочастицы 25 мг / м и даже более, при 50 мг / мл. В этом исследовании набухания, изменения в сырую массу гидрогеля, вероятно , связано с обменом воды с окружающей средой, так как PNIPAAm-G-CS было показано, выборочно разлагаются в присутствии ферментов 29. Многие из шагов протокола, разработанных для набухания исследования были адаптированы основаны на thermoreversibility из PNIPAAm-G-CS. Гидрогелевые диски должны полностью переход при 37 ° С перед добавлением предварительно нагретого раствора ПБС, в противном случае гель будет рассеиваться. После того, как набухание в течение одной недели, раствор PBS, должен быть быстро и аккуратно извлекали из ампул до того, как гидрогели вернуться к жидкоподобному состоянию. Следует отметить, что протокол набухание описанный в данной работе, не в полной мере имитироватьв естественных условиях окружающей среды нативного IVD. Набухания свойства помост в естественных условиях будет зависеть от осмотического давления окружающих тканей 41 и процесс деградации геля. Тем не менее, в целом, увеличение набуханию с альгината микрочастицами инкорпорации считается благоприятным, так как это поможет инъекционный гидрогель остаться заполняющей пространство при физиологической температуре. Такие характеристики, как набухания и содержание воды может быть рассчитана с помощью дополнительных сухих измерений массы. Будущие набухание исследования будут включать погружая гидрогелевые диски против полиэтиленгликолем (MW = 20000 г / моль) ванны, которая будет применяться осмотическое давление и имитируют среду в естественных условиях в IVD.

Помимо механических и разбухания, клей должен проявлять клеточный биосовместимость, чтобы рассматривать в качестве подходящего помост. Предыдущие исследования показали, выживание encapsulaКлетки в Ted альгината 42,43 и PNIPAAm материалов на основе 44,45. Результаты как в живых / мертвых и ХТТ анализов согласуются с этими выводами предыдущих, предполагая , соответствующую жизнеспособность клеток в течение 5 дней (3 и 4). Наша лаборатория также провела предварительные исследования жизнеспособности в течение длительного времени курс (21 дней) и наблюдали подобное поведение. В целом, избыток PNIPAAm-G-CS и микрочастицы должны быть подготовлены для учета любых материальных потерь при передаче пипеток. Еще раз, это чрезвычайно важно для сохранения подмостков архитектуры путем поддержания соответствующих условий температуры при 37 ° С. Если сеть строительных лесов переходит из геля до жидкого состояния, как прикрепление клеток и жизнеспособности может стать скомпрометирована. Что касается живой / Мертвая анализа, цитрат натрия играет важную роль в удалении и деконструкции альгинатных микрочастиц. цитрат натрия изменяет сшивающего действие между Calciгм и альгинат и вызывает суспензии с 46. Дополнительные промывок PBS для удаления PNIPAAm-G-CS или альгинат могут быть выполнены, чтобы повысить качество снимков. В ходе анализа ХТТ, полимерные образцы, не содержащие клеток создаются в луночных планшетах. Эти дублирующие служат пустые стандарты и необходимы для расчета точного значения оптической плотности. Наши предварительные исследования жизнеспособности строго основаны на использовании клеток НЕК-293. В будущих исследованиях, дифференциация инкапсулированных полученные из жировой ткани мезенхимальных стволовых клеток (AD-MSC) в студенистое ядро ​​клетки будут продемонстрированы. AD-MSC дифференциация к НП-подобный фенотип было продемонстрировано с помощью динамического сжатия 47 и гипоксию 48,49.

В целом, предлагаемый клей демонстрирует перспективы для тканевой инженерии в несущих областях нагрузки, например, межпозвоночный диск, в котором успех стратегии регенерации будет зависеть от каркасного способности к Резист дислокации во время движения и нагрузки. Эта система является очень гибким в том, что она потенциально может быть адаптирована для высвобождения белки внеклеточного матрикса или факторы роста, специфичные для требуемого применения. Важно отметить, что методы, описанные здесь, могут быть адаптированы к любой характеристике исследования с thermogelling полимеров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить искреннюю признательность за помощь доктора Дженнифер Kadlowec в разработке протокола испытаний на растяжение клея.

В исследовании, опубликованном в данной публикации, была поддержана Национальным институтом артрита и костно-мышечной и кожных заболеваний и Национального института биомедицинской визуализации и биоинженерии Национального института здравоохранения в рамках премии номер 1R15 AR 063920-01. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Tags

Биоинженерия выпуск 116 гидрогель биоадгезивный тканевой инженерии биомедицинской инженерии строительных лесов thermogelling инъекционный
Синтез Thermogelling поли (N-изопропилакриламида) -graft-хондроитинсульфат композиты с альгинатом микрочастицами для тканевой инженерии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christiani, T. R., Toomer, K.,… More

Christiani, T. R., Toomer, K., Sheehan, J., Nitzl, A., Branda, A., England, E., Graney, P., Iftode, C., Vernengo, A. J. Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (116), e53704, doi:10.3791/53704 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter