Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.

Abstract

Injecteerbare biomaterialen worden gedefinieerd als implanteerbare materialen die in het lichaam als een vloeistof kan worden ingebracht en in situ stollen. Dergelijke materialen bieden klinische voordelen worden geïmplanteerd minimaal invasief en gemakkelijk vorming ruimtevullende vaste deeltjes onregelmatig gevormde defecten. Injecteerbare biomaterialen zijn op grote schaal onderzocht als scaffolds voor tissue engineering. Voor het herstel van bepaalde dragende gebieden van het lichaam, zoals de tussenwervelschijf, steigers moeten hechtende eigenschappen bezitten. Dit zal de kans op dislocatie te minimaliseren tijdens beweging en ervoor innig contact met het omringende weefsel, die voldoende krachtoverdracht. Hier beschrijven we de bereiding en karakterisering van een steiger bestaande uit thermisch gevoelige poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) en alginaat microdeeltjes. De PNIPAAm-g-CS copolymeer vormt een viskeuze oplossing in water bij kamertemperatuur, waarin alginate deeltjes gesuspendeerd om de hechting te verbeteren. Boven de onderste kritische oplostemperatuur (LCST), ongeveer 30 ° C, het copolymeer vormt een vaste gel rond de microdeeltjes. We hebben standaard biomaterialen karakterisering procedures aangepast om rekening te houden met de omkeerbare faseovergang van PNIPAAm-G-CS. Resultaten geven aan dat de opname van 50 of 75 mg / ml alginaat deeltjes in 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS oplossingen verviervoudigen de hechtkracht van PNIPAAm-GCS alleen (p <0,05). De opname van alginaatmicrodeeltjes significante toename zwelvermogen van PNIPAAm-G-CS (p <0,05), waardoor een ruimtevullende gel binnen weefseldefecten handhaven. Tenslotte resultaten van de in vitro toxicologie testkit, 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) en Live / Dead levensvatbaarheid-assay duiden dat de kleefstof ingezet worden in de overleving en proliferatie van ingekapselde humane embryonale nier (HEK) 293 cells over 5 dagen.

Introduction

Injecteerbare biomaterialen zijn die gemakkelijk in het lichaam kan worden afgeleverd als een vloeistof en vast in situ. Dergelijke materialen zijn uitgebreid toegepast in de regeneratieve geneeskunde, waar zij worden gebruikt om ingekapselde cellen afleveren op het terrein 1-4 en fungeren als een driedimensionale tijdelijke extracellulaire matrix voor de cellen 5. Voor de patiënt, injecteerbare biomaterialen zijn voordelig omdat de chirurgische procedures voor implantatie zijn minimaal invasieve en de vaste fase kan vullen onregelmatig gevormde weefsel gebreken, waardoor de noodzaak voor aangepast formaat implantaten.

Injecteerbaarheid kan worden bereikt door een verscheidenheid van mechanismen. Externe factoren, zoals pH, werden onderzocht als een trigger voor de vorming van gels die cellen en biologisch actieve moleculen 6-8 kapselen. Evenwel pH niet de meest geschikte trekker te gebruiken in alle fysiologische omgevingen. Een ander traditioneel Alternatief voor het bereiken injecteerbaar is door in situ chemische polymerisatie of verknoping. Een groep ontwikkelde een in water oplosbare redox systeem bestaande uit ammoniumpersulfaat en N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine en gebruikt voor het laten reageren macromeren bestaat uit polyethyleenglycol en poly (propyleen) glycol 9,10. Zan et al. 11 ontwikkelde injecteerbare chitosan netwerken polyvinylalcohol verknoopt met glutaaraldehyd. Bij dergelijke systemen moet de cytotoxiciteit van reactieve componenten worden gehouden, vooral voor toepassingen in celinkapselende. Ook zou exotherme polymerisatie- temperaturen hoog genoeg produceren omringende weefsel, dat is beschreven voor polymeer botcement 12,13 compromitteren.

Nog andere injecteerbare polymere systemen ontwikkeld die een overgang van vloeibare naar vaste toestand met de temperatuur als de trigger vertonen. Bekend als thermogelling systemen, zijn aqueoons polymeeroplossingen die niet behoeft chemische stimulus, monomeren, verknopingsmiddelen of bereiken in situ vorming 14. Eerder een faseovergang zich doorgaans dichtbij fysiologische temperatuur induceert de vorming van een fysisch verknoopt driedimensionaal netwerk. Poloxameren zoals Pluronic F127 behoren tot de meest bestudeerde polymeren voor geneesmiddelafgifte thermogelling 15-17 en celinkapselende 18,19. Het is echter algemeen geaccepteerd dat deze gelen in aan stabiliteit fysiologische omstandigheden. Studies hebben een verhoogde stabiliteit aangetoond met behulp van ketenverlengers 20 of chemische crosslinkers 21,22. Niettemin kan het gebruik van deze reagentia de mogelijkheden van het materiaal voor celinkapselende beperken.

Poly (N-isopropylacrylamide) is een synthetisch polymeer thermogelling dat veel aandacht heeft gekregen in tissue engineering en drug delivery 14. Waterige oplossingen van poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) vertonen een lagere kritische temperatuur-oplossing (LCST), typisch optredende rond 32-34 ° C 23,24. Onder de LCST, water hydrateert PNIPAAm ketens. Boven de overgangstemperatuur, wordt het polymeer hydrofobe, wat resulteert in een dramatische fasescheiding 25-27 en de vorming van een vaste gel zonder het gebruik van toxische monomeren en verknopingsmiddelen. Echter, PNIPAAm homopolymeren vertonen slechte elastische eigenschappen en houden weinig water bij fysiologische temperatuur te wijten aan hydrofobiciteit 28. In dit werk, kiezen we chondroïtinesulfaat covalent nemen in de PNIPAAm netwerk, dat het potentieel voor enzymatische afbraak 29, anti-ontstekingsactiviteit 30,31 en verhoogde water- en voedingsopname 32 biedt. PNIPAAm copolymeren CS werden in ons laboratorium bereid door polymeriseren van het monomeer NIPAAm in aanwezigheid van methacrylaat-gefunctionaliseerde CS entcopolymeer (PNIPAAm-g-CS) te vormen. BecAGebruik de lage verknopingsdichtheid van het copolymeer, PNIPAAm-G-CS vormt een viskeuze oplossing in water bij kamertemperatuur en een elastische gel bij fysiologische temperatuur dankzij het LCST 29. De polymeeroplossingen worden vloeiend weer na afkoeling onder de LCST als gevolg van de omkeerbaarheid van de overgang.

We hebben aangetoond dat PNIPAAm-g-CS heeft de potentie om te functioneren als een scaffold tissue engineering, door mechanische eigenschappen die kunnen worden aangepast, afbreekbaarheid en cytocompatibility met menselijke embryonale nier (HEK) 293-cellen 29. In bepaalde dragende gebieden, zoals de tussenwervelschijf, tissue engineering scaffolds moet in staat zijn een aanzienlijke interface disc omringende weefsel te vormen om het risico van ontwrichting 33 te elimineren. Deze interface is ook noodzakelijk voor een adequate krachtoverbrenging over het grensvlak tussen het implantaat en het weefsel 33. In ons werk, hebben we een opgeschortlginate microdeeltjes in waterige oplossingen van PNIPAAm-G-CS en vond dat geleren lokaliseert de microdeeltjes, die de hechting met het omliggende weefsel 34. In dit artikel schetsen we de stappen voor de voorbereiding van de thermogelling, zelfklevende polymeer. Standaardtechnieken voor biomaterialen en karakterisatie, cell imaging en assays voor levensvatbaarheid werden aangepast om rekening te houden met de temperatuurgevoeligheid van het polymeer en de omkeerbaarheid van de faseovergang. De injecteerbare polymeer beschreven in dit document heeft ruime mogelijkheden voor drug delivery en tissue engineering-toepassingen buiten de in dit document beschreven. Bovendien kan de karakterisering werkwijzen beschreven voor andere thermogelling systemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Poly (N-isopropylacrylamide) -g-chondroïtinesulfaat Synthese

  1. Voor de synthese van de biologisch hechtende hydrogel, zuiveren N-isopropylacrylamide (NIPAAm) methacrylaat monomeer en chondroïtinesulfaat (CS).
    1. Weeg ten minste 10 g NIPAAm en los het monomeer in 400 ml n-hexaan bij 60 ° C. Roer de container periodiek tot volledige oplossing. Herkristalliseer de oplossing in een -20 ° C vriezer gedurende 24 uur.
    2. Verwijder de gekristalliseerde monomeer uit de houder en vacuümfilter het n-hexaan onder toepassing van een Buchner trechter. Plaats het monomeer in een vacuümoven bij kamertemperatuur gedurende 24 uur om eventueel achtergebleven n-hexaan te verwijderen. Bewaar het monomeer in een -20 ° C vriezer voor later gebruik (zie stap 1.2).
    3. Weeg en los 2,0 g chondroïtinesulfaat in 8,0 ml gedeïoniseerd water. Verwarm de oplossing tot 60 ° C.
    4. Stel de pH van de oplossing tot 10 toepassing van ongeveer 10 tot 40 ui van 50% (w / w) NaOH.
    5. Voeg 0,298 ml methacrylzuuranhydride (MA). Reflux gedurende 24 uur onder roeren bij 60 ° C.
    6. Schenk 400 ml aceton oplossing in een pot en chill O / N in een -20 ° C vriezer.
    7. Na 24 uur zijn verstreken, giet langzaam de gehele oplossing methacrylbevattend CS (MCS) in 400 ml koude aceton onder roeren met een magnetische roerstaaf.
    8. Verwijder de MCS uit de aceton en breng het neerslag in een vacuümoven. Voer deze stap snel een intact en samenhangende staat voor mcs handhaven. Laat de residuele aceton verdampen onder vacuüm gedurende minimaal 24 uur.
  2. Co-op te lossen 10 g gezuiverd NIPAAm en 2,209 g MCS in 232 ml gedemineraliseerd water.
  3. Spoel de oplossing van zuurstof door het gebruik van inert stikstofgas. Zorg voor een krachtige, maar toch lage gasstroom om te voorkomen dat de oplossing uit borrelen meer dan 15 min.
  4. Ga door het spoelen van de oplossing met stikstofgas en voeg 0,976 ml tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Vervolgens starten de polymerisatiereactie door het mengen van 97,6 mg ammoniumpersulfaat (APS).
  6. Meng de oplossing gedurende ongeveer 20 seconden en de oplossing snel om de lucht verhinderen het vat af te dichten. Laat de oplossing polymeriseren onder tl-licht gedurende 24 uur.
  7. Na 24 uur werd het reactievat plaats in een 37 ° C oven. Laat de hydrogel om de overgang van een vloeistof naar een gel-achtige toestand. Dompel de gepolymeriseerde hydrogel in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende een totaal van 7 dagen om diffusie van ongereageerd monomeer uit de hydrogel.
  8. Met behulp van een schaar, snijden de hydrogel in verschillende kleine stukjes, niet groter dan 5 cm in diameter. Om de hydrogel uit de overgang van een gel-achtige toestand naar een vloeistof te voorkomen, snijd het polymeer binnen de 37 ° C PBS-oplossing. Breng de porties in 50 ml conische buizen.
  9. Bereid de monsters voor vriesdrogen door het wikkelen van de toppen vande buizen met Kimwipes en elastiekjes. Bevries de buizen bij -70 ° C gedurende 1 tot 2 uur.
  10. Plaats de conische buizen op de vriesdroger om al het water uit de hydrogel te verwijderen. Voordat de vriesdroger moet een temperatuur en druk van ongeveer -40 ° C en 0,04 mbar bereikt, respectievelijk. Een minimum van 7 dagen is vereist voor volledige droging.
  11. Maal de gevriesdroogde polymeer tot een fijn poeder en op te slaan in een 4 ° C koelkast voor later gebruik (zie stap 3.1).

2. Calcium-alginaat verknoopte microdeeltjes Synthesis

  1. Bereid een 2% (w / v) alginaat oplossing door het oplossen van 400 mg in 20 ml gedeïoniseerd water. Verwarm de oplossing tot ongeveer 60 ° C om het oplossen te vergemakkelijken.
  2. Bereid een 2% (w / v) calciumchloride-oplossing door toevoeging van 400 mg tot 20 ml gedeïoniseerd water.
  3. Een olie in water mengsel door het combineren van 100 ml canolaolie, 1,0 ml Tween 20 en 20 mlvan 2% (w / v) alginaat. Emulgeren het mengsel gedurende 10 min met een homogenisator bij 15.000 rpm. Bovendien mengen met een magnetische roerstaaf bij 200 rpm en 2000 rpm te grote of kleine microdeeltjes maken, respectievelijk.
  4. Zuig het 2% (w / v) calciumchloride oplossing met een injectiespuit met een naald 18 G. Voeg langzaam calciumchloride druppelsgewijs in de emulsie.
  5. Zodra de 20 ml calciumchloride zijn uitgeput, kan de microdeeltjes in de emulsie te verknopen gedurende 10 min.
  6. Verdelen de partij microdeeltjes in capped 50 ml conische buizen en centrifugeer tot een kracht van 1400 g gedurende 2 minuten om de eerste laag canola olie te verwijderen.
  7. Achtereenvolgens wassen, vortex en gecentrifugeerd microdeeltjes met isopropanol in totaal drie keer bij 1400 g gedurende 2 minuten om eventuele canola olie te verwijderen. Gooi het isopropanol supernatant na elke stap centrifugeren en wassen met verse isopropanol.
  8. Zodra de oil is verwijderd, herhaalt u de wasprocedure drie extra keer met gedemineraliseerd water om eventueel achtergebleven isopropanol te verwijderen. Gooi het gedemineraliseerd water supernatant na elke stap centrifugeren en wassen met vers gedemineraliseerd water. Verwijder ongeveer 100 mg van natte microdeeltjes en op te slaan in een flacon. De natte microdeeltjes worden gebruikt om de gemiddelde diameter van de lading te meten met lichtmicroscopie.
    1. Middels lichtmicroscopie, dispergeren een klein monster van natte microdeeltjes in gedeïoniseerd water op een microscoopglaasje. Afhankelijk van de grootte van de microdeeltjes, gebruikt een 10x of 20x objectief, en stel de numerieke apertuur totdat de deeltjes scherp worden. Controleer of de microscoop wordt gekalibreerd voor juiste doelstelling en de helderheid van de lichtbron naar wens aanpassen. Gebruik een line tool om de langste diameter van 50 willekeurige alginaat microdeeltjes te meten en het verkrijgen van een gemiddelde grootte van de partij.
  9. Bereid de microdeeltjes voor vriesdrogen by het verpakken ze met Kimwipes en het veiligstellen van hen met elastiekjes. Bevries de microdeeltjes bij -70 ° C gedurende 1 uur.
  10. Plaats de microdeeltjes op de vriesdroger en laat het monster drogen gedurende ten minste 24 uur. Maal de gevriesdroogde microdeeltjes tot een fijn poeder met behulp van een vijzel en op te slaan in een 4 ° C koelkast voor later gebruik (zie stap 3.3).

3. Bereiding van de Adhesives

  1. Met het gevriesdroogde polymeerpoeder, voer een 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS oplossing door het oplossen van 50 mg hydrogel poeder in 1 ml 1X PBS.
  2. Meng de oplossing met behulp van een vortex en kou in een koelkast bij 4 ° C gedurende 24 uur.
  3. Zodra de viskeuze oplossing vormt, maakt een homogene samenstelling door het toevoegen van 25 of 50 mg gevriesdroogd alginaatmicrodeeltjes de hydrogel oplossing en vortex. Bewaar de composiet in de koelkast bij 4 ° C voor later gebruik (zie stap 4.3 en 4.8).

4. Bioadhesieve Mechnische trekproeven

  1. Voorafgaand aan het uitvoeren van trekproeven, extract kraakbeen substraat een varken oor.
    1. Ontdooi een varken oor in een warme 0,9% (w / v) NaCl-oplossing; dit zal helpen om het weefsel los te maken.
    2. Met behulp van een scalpel, isoleren en deel uit een vlak, rechthoekig gebied door verticaal te snijden terwijl de epidermale laag, onderhuids weefsel en kraakbeen. Vermijd het snijden van de gekromde ruggen van de varkens oor.
    3. Scheid de epidermale laag van de huid van het kraakbeen door parallelle snijden door het subcutane weefsel. Het kraakbeen is een hard, wit weefsel gevonden onder de varkens huid.
    4. Voorzichtig schrapen het subcutane weefsel dat voor het kraakbeen is verbonden met de zijde van de scalpel. Vermijd het snijden in het kraakbeenweefsel met de scalpel.
    5. Gewaarborgd dat slechts één zijde van het kraakbeen wordt blootgesteld en vlak tijdens trekproeven. Indien nodig, plat het kraakbeen van de ongelijke huid afsnijden aan de onderzijde.
    6. Snijd het kraakbeenweefsel in meerdere stukken met afmetingen van 1 cm x 1 cm. Bewaar de kraakbeenweefsel in conische buizen gevuld met 0,9% (w / v) NaCl oplossing in een -20 ° C vriezer.
  2. Bereid 2,0 L van 0,9% (w / v) NaCl oplossing. Verwarm de zoutoplossing tot 37 ° C. De temperatuur van deze oplossing moet gedurende het testen worden gehandhaafd.
  3. Ontdooi de bevroren kraakbeen. Houd zowel de varkens kraakbeen en de hydrogel monsters in een piepschuim container met ijs packs.
  4. Bevestig de krachtmeter aan de arm van de testbank. Plaats een kookplaat bovenop de kracht stand en de temperatuur op 50 ° C.
  5. Kleef een 1 cm x 1 cm stukje kraakbeen aan de roestvrij stalen blok met cyanoacrylaatlijm en een pincet. Lijm een ​​extra stukje kraakbeen aan de Delrin cilinder en bevestig de cilinder aan de krachtmeter. Het is zeer belangrijk dat zowel kraakbeen oppervlakken naar elkaar contact hydrogel.
  6. PlaatsPlexiglas waterbad boven op de hete plaat en steek de roestvrijstalen blok met het kraakbeen substraat in het bad.
  7. Laat de arm van de testbank en lijn beide kraakbeen substraten met elkaar. Breng de arm en laat voldoende ruimte om de hydrogel toe te passen.
  8. Met een verdringerpomp pipet afzien 200 gl van de bioadhesieve hydrogel onderaan stukje kraakbeen.
  9. Laat de arm van de kracht stand op 1 mm / min tot het hydrogel contact maakt met de bovenste stukje kraakbeen en oefent een voorspanning van 0.001 N.
  10. Giet de 37 ° C een zoutoplossing in het bad tot het volume de aangewezen water niveau bereikt. Controleer de temperatuur van de oplossing met een thermokoppel.
  11. Laat de hydrogel om in totaal 5 minuten. Zodra de gel gestold, til de arm met een snelheid van 2 mm / min. De test is voltooid wanneer de bioadhesieve los van het kraakbeen substraat of als een aanzienlijke daling van kracht optreedt,signalering falen.
  12. Verzamel de geregistreerde gegevens en de arm van de testbank te verhogen. Verwijder de Delrin cilinder uit de krachtmeter. Giet de zoutoplossing in de vorige houder en verwarm tot 37 ° C.
  13. Bereken benadrukt door het aftrekken van de kracht uitgeoefend door het polymeer uit de opwaartse kracht van een "blanco", de Delrin bevestiging zonder kleefmiddel of kraakbeen, verhoogd met dezelfde snelheid, en delen door de binding gebied.

5. zwelling Studie van PNIPAAm-G-CS met Alginaatmicrodeeltjes

  1. Bereid schone glazen flesjes en label ze op de juiste wijze met een tijdstip, het type monster en steekproefomvang. De kleefstoffen kunnen ook worden gemaakt, zoals hiervoor beschreven. Bereid een totaal van vijf monsters (n = 5) voor elk type monster per tijdstip.
  2. Pre-wegen alle glazen flesjes en hun oorspronkelijke massa op te nemen bij RT.
  3. Met behulp van een injectiespuit, afzien ongeveer 0,4 ml van de bereide lijm monster in elk van de vijf flesjes.Herhaal deze stap voor elk type monster in alle geteste tijdstippen.
  4. Wegen en de massa van elk flesje met de klevende monstertype bij kamertemperatuur opnemen.
  5. Voorverwarmen een orbitale incubator 1 l 1x PBS oplossing tot 37 ° C.
  6. Organiseren van de flesjes op een rek en plaats het rek in de incubator. Laat de lijm om de overgang van een vloeistof naar een gel gedurende ongeveer 5-10 minuten.
  7. Voeg 5,0 ml 1x PBS aan elk flesje. Zorg ervoor dat de PBS-oplossing voorzichtig toe te voegen aan de zijkant van de flacon te voorkomen dat de hydrogel schijf uit elkaar te breken.
  8. Cap elke injectieflacon verdamping van de PBS-oplossing te voorkomen en de temperatuur van de incubator handhaven op 37 ° C. Elke set van hydrogel schijven zal moeten ondergedompeld blijven in PBS voor een aangegeven tijdsduur.
  9. Eén keer per 7 dagen de tijd punt is bereikt, Haal het beschermkapje van de set van flesjes en verwijder de PBS-oplossing uit elke flacon. Weeg elk flesje met de klevende monster weer bij RT.
<p class = "jove_title"> 6. Kwalitatieve Cell levensvatbaarheid Met behulp van een Live / Dead Assay

  1. Voordat de Live / Dead test met PNIPAAm-G-CS, groei humane embryonale 293-niercellen (HEK-293) tot 80% confluentie.
    1. Quick-dooi bevroren HEK-293 celsuspensie door het plaatsen van de cryovial in een 37 ° C waterbad, centrifugeer de cellen bij 400 xg bij 4 ° C gedurende 5 min in een 15 ml conische buis.
    2. De eerste doorgang celkweekmedium te combineren in hoge glucose (4,5 g / l) Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) tot een eindconcentratie van 20% en 100x penicilline-streptomycine-oplossing ( pen-strep) tot een uiteindelijke concentratie van 100 IU / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Voor alle andere passages, overschakelen naar DMEM met 10% FBS en 1x pen-strep.
    3. Resuspendeer de celpellet in 10 ml groeimedium en breng de suspensie in een 100 mm petrischaal. gelijkmatig distribute de cellen door voorzichtig kantelen van de schaal van voor naar achter en van links naar een paar keer per richting rechts.
    4. De cellen te kweken in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Wijzig zo nodig het medium om de twee dagen.
    5. Wanneer cellen te bereiken 80% samenvloeiing, een kopie van de cultuur in meerdere gerechten. Verwijder het medium uit de plaat.
    6. Voeg 1 ml van 0,5% trypsine aan de plaat. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Controleer om te zien of de cellen los te maken van het oppervlak onder voorzichtig schudden de plaat.
    7. Voor het splitsen van de kweek 01:10, voeg 9 ml normale groeimedium (DMEM met 10% FBS) aan de cellen getrypsiniseerd en meng door het kantelen van de schotel.
    8. Verdeel 1 ml van de verdunde celsuspensie in elk nieuw gerecht en voeg 9 ml kweekmedium. Meng door het kantelen van het gerecht.
    9. De cellen te kweken in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Wijzig zo nodig het medium ooity twee dagen tot cellen te bereiken 80% samenvloeiing.
  2. Verwijder de media uit twee kweekschalen gegroeid tot 80% confluentie.
  3. Voeg 1 ml van 0,5% trypsine aan elke plaat. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Controleer om te zien of de cellen los te maken van het oppervlak onder voorzichtig schudden de plaat.
  4. Was de HEK-293-cellen op de plaat met 3 ml groeimedium tweemaal en voegen zowel suspensies dezelfde 15 ml conische buis.
  5. Centrifugeer de 15 ml conische buis gedurende 10 minuten bij 400 xg bij 4 ° C.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml medium door en neer te pipetteren.
  7. Pipetteer 10 ul van de celsuspensie in een hemocytometer en voer een celtelling de celdichtheid bepaald. Verhoog de suspensie volume medium als de initiële celconcentratie te hoog, en omgekeerd het volume te verlagen als de concentratie te laag is, om een ​​doel concent behoudenverhouding van 1 x 10 6 cellen / ml. Centrifugeer de HEK-293 cellen bij 400 xg en resuspendeer de celpellet in het gecorrigeerde hoeveelheid media dienovereenkomstig.
  8. Voorzichtig vortex de celsuspensie en verdelen de celmengsel in vier afzonderlijke 15 ml conische buis voor de volgende proefomstandigheden: positieve controle monolaag, negatieve gedood control in PNIPAAm-g-CS middels 70% (v / v) methanol, HEK-293 cellen ingekapseld in PNIPAAm-g-CS en HEK-293-cellen ingekapseld in PNIPAAm-g-CS met alginaatmicrodeeltjes.
  9. Maak positieve controle monolagen pipetteren meerdere 300 gl volumes van het celmengsel in een 24-well plaat 4-6 analysemonsters genereren.
  10. Verwijder de media uit de conische buizen met betrekking tot de gedode controle, PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaat microdeeltjes.
    1. Centrifugeer de conische buizen gedurende 5 minuten bij 400 xg en verwijder het supernatant.
    2. Handhaaf dezelfde cel concentratie door resuspenderen de cells in hetzelfde volume PNIPAAm-G-CS de media verwijderd. Pipet het polymeer cel mix op en neer met behulp van een serologische pipet tot homogeen.
      1. Als enten met alginaatmicrodeeltjes, dragen de PNIPAAm-g-CS-celsuspensie (verkregen zoals beschreven 6.10.2) in een 35 mm kweekschaal en de deeltjes te introduceren in de mix. Pipet de cel mix op en neer met behulp van een serologische pipet tot homogeen.
    3. 6 replicaatmonsters - gebruikt serologische pipet afzien meerdere 300 gl van het polymeer celmengsel in elk van de putjes gedood control, PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaatmicrodeeltjes tot 4 te genereren.
  11. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 10 tot 15 minuten en laat de PNIPAAm-G-CS om de overgang van een vloeistof naar een gel (polymeer vormt een ondoorzichtige, witte schijf).
  12. Plaats een dia warmer in de kap en de temperatuur op 37 ° C. Gebruik de dia warmer goed plaat te behoudentemperatuur en pipetteer 600 ul voorverwarmde media in elk putje. Om verder te voorkomen dat de overgang van het polymeer tot een vloeibare toestand achtereenvolgens een lamp met een fluorescerende lamp boven de schaal te warmen de lucht erboven.
  13. Incubeer de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C met 5% CO2.
  14. Na vijf dagen zijn verstreken, de voorbereiding van de Live / Dead kleurstof mix met behulp van ethidiumhomodimeer (EthD-1) en calceïne AM. Beide stoffen zijn lichtgevoelig en bereid op de dag van gebruik.
    1. Ontdooi de calceïne AM en EthD-1 uit de set bij RT.
    2. Voeg 5 ml steriel 1x PBS tot een conische buis en wikkel het in aluminiumfolie.
    3. Voeg 6,67 ui 2 mM EthD-1 de conische buis. Vortex de oplossing mengsel goed.
    4. Voeg vervolgens 2,5 ul 4 mM calceïne AM de conische buis. Vortex het mengsel goed.
  15. Verwijder de media uit de putjes van de monolaag (positieve controle), PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-g-CS with alginaatmicrodeeltjes. Was alle van de putten grondig, maar voorzichtig, met PBS en verwijder de PBS.
  16. Laat de hydrogel schijven met alginaat microdeeltjes vloeibaar bij kamertemperatuur en voeg 2 ml 50 mM natriumcitraat aan elk van de putjes.
  17. Verwijder de media uit de gedode cel putten (negatieve controle). Laat de hydrogel schijven vloeibaar bij kamertemperatuur en voeg 300 pl 70% (v / v) methanol aan elk putje.
  18. Incubeer de plaat gedurende 45 min bij 37 ° C.
  19. Verwijder de natriumcitraat en methanol oplossingen van de putten en pipet elk van de hydrogel suspensies in afzonderlijke microcentrifugebuizen. Centrifugeer de buizen bij 2000 xg gedurende 10 minuten om de cellen te scheiden van de hydrogel suspensie.
  20. Verwijder de suspensie voorzichtig pipetteren de oplossing uit de conische buis en achterlating de celpellet. Resuspendeer de pellet in 300 pl PBS en transfer naar de oorspronkelijke putjesplaat.
  21. Voeg 300 gl thij leven / dood kleurstof mix aan elk van de putjes. Wikkel de wells plaat in aluminiumfolie en incubeer gedurende 45 minuten op een rocker bij RT.
  22. Afbeelding alle monsters onder een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met een 10X objectief. Levende cellen en gedode cellen een groene en rode fluorescentie in, respectievelijk.

7. Kwantitatieve levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een XTT Assay

  1. Kweek HEK-293-cellen tot 80% confluentie. Verwijder de groeimedia van twee cultuur gerechten.
  2. Voeg 1 ml van 0,5% trypsine aan elke plaat. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Controleer om te zien of de cellen los te maken van het oppervlak onder voorzichtig schudden de plaat.
  3. Was de HEK-293-cellen op de plaat met 3 ml medium tweemaal en voegen zowel suspensies dezelfde 15 ml conische buis.
  4. Centrifugeer de 15 ml conische buis gedurende 10 minuten bij 400 xg bij 4 ° C.
  5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml mediumdoor op en neer pipetteren.
  6. Pipetteer 10 ul van de celsuspensie in een hemocytometer en voer een celtelling de celdichtheid bepaald. Zoals eerder beschreven, behouden een doelconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. Centrifugeer de HEK-293 cellen bij 400 xg en resuspendeer de celpellet in het gecorrigeerde hoeveelheid media dienovereenkomstig.
  7. Voorzichtig vortex de celsuspensie en verdelen de celmengsel in vier afzonderlijke 15 ml conische buis voor de volgende proefomstandigheden: positieve controle monolaag, negatieve gedood control in PNIPAAm-g-CS middels 70% (v / v) methanol, HEK-293 cellen ingekapseld in PNIPAAm-g-CS en HEK-293-cellen ingekapseld in PNIPAAm-g-CS met alginaatmicrodeeltjes.
  8. Maak positieve controle monolagen pipetteren 300 ul van de cel mengsel in een 24-well plaat 4 te genereren - 6 analysemonsters.
  9. Verwijder de media uit de conische buizen met betrekking tot de gedode controle, PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-g-CS met alginaatmicrodeeltjes.
    1. Centrifugeer de conische buizen gedurende 5 minuten bij 400 x g en de bovenstaande vloeistof.
    2. Handhaven dezelfde celconcentratie door resuspenderen van de cellen in dezelfde hoeveelheid PNIPAAm-G-CS de media verwijderd. Pipet de cel mix op en neer met behulp van een serologische pipet tot homogeen.
      1. Als enten met alginaatmicrodeeltjes, dragen de PNIPAAm-g-CS-celsuspensie in een 35 mm kweekschaal en de deeltjes te introduceren in de mix. Pipet de cel mix op en neer met behulp van een serologische pipet tot homogeen.
    3. 6 replicaatmonsters - gebruikt serologische pipet afzien 300 gl van het polymeer celmengsel in elk van de putjes gedood control, PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaatmicrodeeltjes tot 4 te genereren.
  10. Zodra alle celbevattende monsters werden toegevoegd aan de 24-well plaat, afzien meerdere 300 gl volumes PNIPAAm-G-CS en PNIPA6 analysemonsters - am-G-CS met alginaatmicrodeeltjes zonder cellen in naburige putten 4 te genereren.
  11. Incubeer de 24-well plaat bij 37 ° C gedurende 10 tot 15 minuten en laat de PNIPAAm-G-CS om de overgang van een vloeistof naar een gel (polymeer vormt een ondoorzichtige, witte schijf).
  12. Plaats een dia warmer in de kap en de temperatuur op 37 ° C. Gebruik de dia warmer goed plaat temperatuur en pipet 600 ul van voorverwarmde duidelijke DMEM te behouden in elk putje. Om verder te voorkomen dat de overgang van het polymeer tot een vloeibare toestand achtereenvolgens een lamp met een fluorescerende lamp boven de schaal te warmen de lucht erboven.
  13. Incubeer de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in 5% CO2.
  14. Na vijf dagen verstreken, bereidt de 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) reagens van de fabrikant. De XTT reagens is lichtgevoelig en voorbereid op de dag van gebruik.
    1. Verwijder de amber fles bevattening de XTT poeder uit de koelkast. Met behulp van een steriele spuit en naald, injecteer 5 ml van duidelijke DMEM (zonder fenol rood) door het rubberen septum in de amberkleurige fles.
    2. Verwarm het reagens 56 ° C in een waterbad gedurende 10 minuten of totdat het is opgelost.
    3. Verdun de XTT-reagens tot 20% (v / v) in een 15 ml conische buis gewikkeld in aluminiumfolie. Aliquot de overmaat XTT reagens in microcentrifugebuizen en plaats ze in de -20 ° C vriezer voor langdurige opslag.
  15. Verwijder het medium uit de putjes gedode cellen (negatieve controle) en voeg 300 pl 70% (v / v) methanol aan elk putje. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C en verwijdert de methanol uit de putjes.
  16. Verwijder de media uit de resterende putjes van de monolaag (positieve controle), PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaat microdeeltjes. Was alle van de putten grondig, maar voorzichtig, met PBS en verwijder de PBS.
  17. Voeg 300 ul van de 20% XTT-reagens aan elk van de putjes. Wikkel de 24-well plaat in aluminiumfolie en incubeer gedurende 24 uur op een rocker bij RT.
  18. Na 24 uur, voeg 200 pl 50 mM natriumcitraat aan alle putjes en incubeer op wip voor een extra uur.
  19. Overdracht van al het polymeer suspensies te microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  20. Transfer 200 ul van de supernatant uit elke microcentrifugebuis een 96-wells plaat. Met behulp van een microtiter plaatlezer verkrijgen specifieke absorptiemetingen bij 450 nm en aspecifieke absorptiemetingen bij 690 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een thermisch gevoelige geënte copolymeer werd met succes gesynthetiseerd en gekarakteriseerd op de bioadhesieve sterkte, zwelvermogen en in vitro cytocompatibility. We kozen ervoor om alginaat te onderzoeken vanwege de gerenommeerde slijmvlieshechtende eigenschappen. Alginaatmicrodeeltjes, met een gemiddelde diameter van 59,7 ± 14,9 urn, werden gemengd met 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS in concentraties van 25, 50 en 75 mg / ml. Deze concentraties waren gebaseerd op de helft, gelijk aan, en tweemaal de equivalente drooggewicht van PNIPAAm-G-CS in waterige oplossing. Microdeeltje concentraties hoger dan 75 mg / ml vertoonde overmatige viscositeit en werden niet onderzocht. De maximale treksterkte kleefkracht van 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS met variërende concentraties alginaat microdeeltjes werden vergeleken met de hydrogel alleen. De toevoeging van 50 of 75 mg / ml alginaat microdeeltjes gesuspendeerd in 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS resulteerde in een viervoudige increase treksterkte (p <0,05), zie figuur 1. microdeeltjes concentratie van 25 mg / ml had een significante toename van de treksterkte vergeleken met 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS (p niet weergegeven> 0,05). Er was geen significante verandering van de treksterkte van 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS wanneer de concentratie van alginaat microdeeltjes werd verhoogd van 50 tot 75 mg / ml (p> 0,05).

De zweieigenschappen van de hydrogel bioadhesieve gekenmerkt door onderdompeling verschillende formuleringen in PBS bij 37 ° C. Alginaat microdeeltjes concentraties van 25 en 50 mg / ml werden getest om eventuele verschillen in zweigedrag identificeren. Alginaatmicrodeeltjes werden gemeten met lichtmicroscopie en hadden een gemiddelde diameter van 25,0 ± 14,4 urn. Na 7 dagen werd de begin- en eindwaarden natte massa van de hydrogel disks werden geregistreerd en een verandering in massa berekend voor meerdere monsters per hechtmiddel formulation (n = 5). Figuur 2 toont een drastische verschil in de verandering in massa tussen alle formuleringen. Lijmen die zowel 25 en 50 mg / ml alginaatmicrodeeltjes aangetoond positieve veranderingen in massa, terwijl 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS in massa verminderd. Alle monsters bleken significant verschillend van elkaar te zijn (p <0,05) met het hechtmiddel bevattende 50 mg / ml alginaat microdeeltjes die het hardste zwellende werking.

De biocompatibiliteit van de voorgestelde hechtmiddel werd kwalitatief en kwantitatief onderzocht door het gebruik van een Live / Dead en XTT cytotoxiciteit assay. HEK-293-cellen werden ingekapseld in zowel 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS en 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS bevattende 50 mg / ml alginaat microdeeltjes met een gemiddelde diameter van 59,7 ± 14,9 urn . Een monolaag van cellen en ingekapselde cellen in PNIPAAm-g-CS gedood met 70% methanol werden beschouwd als de positieve en negatief controles, respectievelijk. Formuleringen geënt met cellen werden gekarakteriseerd na 5 dagen kweek in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Elke test aangegeven goede levensvatbaarheid van de cellen voor zowel PNIPAAm-g-CS en PNIPAAm-G-CS met microdeeltjes. Beelden uit Figuur 3 illustreert levende cellen groen fluorescerend zowel hechtmiddelformuleringen (Panels A en B) en de monolaag van cellen, die als de positieve controle (Panel C). Gedode cellen (Panel D) fluoresceren een rode kleur en toon celdood. Resultaten van de XTT cytotoxiciteit tests bevestigden de resultaten Live / Dead assay. De relatieve levensvatbaarheid van de cellen van het hechtmiddel bevattende 50 mg / ml micropartikels afgenomen 1,3 voudige van de PNIPAAm-G-CS zoals geïllustreerd in figuur 4, maar de daling was niet statistisch significant (p> 0,05). Zowel PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met microdeeltjes had ook vergelijkbare levensvatbaarheid van de cel monolaag (p> 0,05). Ingekapselde cellen in hydrOGEL formuleringen en de monolaag van cellen bleken significant verschillend in vergelijking met de negatieve controle (p <0,05). Samengevat suggereren deze resultaten dat het hechtmiddel bevattende microdeeltjes niet alleen vertoont verhoogde hechtsterkte, maar goede biocompatibiliteit ook.

Figuur 1
Figuur 1. Effecten op treksterkte Na inbouwen variërende concentraties alginaatmicrodeeltjes tot 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS. De treksterkte van PNIPAAm-G-CS verviervoudigd met de toevoeging van 50 of 75 mg / ml alginaat microdeeltjes (p <0,5). Foutbalken vertegenwoordigen een berekende 95% betrouwbaarheidsinterval (n = 5). Alginaat microdeeltjes had een gemiddelde grootte van 59,7 ± 14,9 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Het effect van verschillende concentraties van alginaatmicrodeeltjes op het zwelvermogen van 5% (w / v) PNIPAAm-G-CS. Na 7 dagen onderdompeling in 37 ° C PBS, PNIPAAm-G-CS afgenomen vochtige massa door de hydrofobe eigenschappen van PNIPAAm boven de LCST. PNIPAAm-G-CS met 25 of 50 mg / ml alginaatmicrodeeltjes vertoonden zwelling vermogen. Verhogen van de concentratie van microdeeltjes significant verhoogd (p <0,05) de verandering in massa van het hydrogel dan 7 dagen, toegeschreven wateropname. Foutbalken vertegenwoordigen een berekende 95% betrouwbaarheidsinterval. Alginaat microdeeltjes had een gemiddelde grootte van 25,0 ± 14,4 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

gether.within-page = "1"> figuur 3
Figuur 3. Representatieve Levend / dood Fluorescentie afbeeldingen van gekweekte HEK-293-cellen gedurende 5 dagen. De cellen werden ingekapseld in (A) PNIPAAm-G-CS en (B) PNIPAAm-G-CS met 50 mg / ml alginaat microdeeltjes. Cellen werden gekweekt in een (C) monolaag en (D) gedood methanol in PNIPAAm-G-CS een positieve en negatieve controle respectievelijk voorstellen. De Live / Dead levensvatbaarheid experiment werd driemaal herhaald met drie herhalingen per experiment. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn. Alginaat microdeeltjes had een gemiddelde grootte van 59,7 ± 14,9 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ftp_upload / 53704 / 53704fig4.jpg "/>
Figuur 4. Korte termijn levensvatbaarheid van HEK-293 cellen in PNIPAAm-G-CS met alginaatmicrodeeltjes. De overleving van ingekapselde HEK-293 cellen in PNIPAAm-g-CS met en zonder alginaat microdeeltjes werd bepaald en vergeleken met behulp XTT na 5 dagen. Cel monolaag en ingekapselde cellen in PNIPAAm-g-CS gedood met 70% methanol werden toegepast als positieve en negatieve controles, respectievelijk. Zowel PNIPAAm-G-CS en PNIPAAm-G-CS met alginaatmicrodeeltjes toonde geen significante vermindering (p> 0,05) in cellevensvatbaarheid in vergelijking met de cel monolaag, maar een significante reductie (p <0,05) in cellevensvatbaarheid in vergelijking met de gedode cellen. De toevoeging van alginaatmicrodeeltjes niet ernstig verstoren de cellevensvatbaarheid van PNIPAAm-G-CS (p> 0,05). Foutbalken vertegenwoordigen een berekende 95% betrouwbaarheidsinterval (n = 3, zes replicaten per experiment). Alginaatmicrodeeltjes hadden een gemiddelde grootte van 59,7 ± 14,9 urn.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn verschillende kritische stappen in de synthese van de hydrogel micropartikels composiet en evalueren van de hechtsterkte, zwelling vermogen en cellulaire biocompatibiliteit. Vrije radicaalpolymerisatie van PNIPAAm-G-CS vereist een succesvolle methacrylation chondroïtinesulfaat, volledige oplossing van monomeercomponenten en zuurstofvrije reactiecondities. De verhouding van monomeer tot NIPAAm methacrylbevattend chondroitin sulfaat in het reactiemengsel werd gekozen omdat is aangetoond, in ons eerder werk copolymeren met mechanische eigenschappen die vergelijkbaar zijn natieve tussenwervelschijf weefsel 29 te genereren. Verhogen van de hoeveelheid chondroïtinesulfaat in de hydrogel zal geleren tijdens waterverlies verminderen en aldus de samendrukkende stijfheid van de gel te verlagen. De gewenste mate van methacrylation is ook aangetoond dat hydrogels met gunstige verwerkingseigenschappen voor injecteerbaar produceren door een 18 G naald wanneer opgelost in waterige oplossing <sup> 29. Een verhoogde mate van substitutie van het methacrylaat CS de verknopingsdichtheid van het polymeer netwerk te vergroten, waardoor verhoogde viscositeit oplossing beneden de LCST en reducerende gel zwellen vermogen. Anderen hebben verschillende benaderingen onderzocht in het synthetiseren PNIPAAm hydrogels zoals atoomoverdrachtsradicaalpolymerisatie (ATRP) 35 of omgekeerde toevoeging-fragmentatie keten overdracht (VLOT) 36. Polymerisatie via ATRP heeft geleid tot de ontwikkeling van smalle, polydisperse hydrogels met gezuiverd afgestemd molecuulgewicht door het veranderen van de verhouding monomeer tot initiator. Functionele groepen kunnen worden geënt in een kam-achtige wijze met RAFT polymerisatie, hetgeen van invloed polymeerketen verstrengeling en fase scheiding.

Een homogene water-in-oliemengsel moet in de vorming van homogene, verknoopt alginaat microdeeltjes. Een emulsie techniek is eenvoudig uit te voeren en vereist niet het gebruik van gevaarlijke chemicaliën vereisen echter zowel micropaArtikel vorm en distributie zijn moeilijk te controleren. Microdeeltjesgrootte kan worden veranderd door het verhogen van de emulsie roersnelheid, waardoor kleinere deeltjes en vice-versa. In dit specifieke onderzoek, werd alginaat microdeeltjes grootte onderzocht als een mogelijke eigenschap die van invloed kunnen zijn zwelling, mechanica, of cellulaire levensvatbaarheid. Lichtverstrooiing kan ook worden gebruikt als alternatief voor het meten van de gemiddelde microdeeltjesgrootte. Andere emulsie eigenschappen zoals het type surfactant en alginaatconcentratie invloed microdeeltjesgrootte en aggregaatvorming 37. Het verminderen van de alginaatconcentratie zal het microdeeltje verkleinen echter aggregaten vaker te vormen. Variaties in de hydrofiele en hydrofobe aard van oppervlakteactieve invloed op de oppervlaktespanning tussen de olie- en waterfasen, waardoor de druppelgrootte in de emulsie verandert. Alginaat microdeeltjes kan ook worden vervaardigd via een microfluïdische inrichting, waardoor uniforme deeltjes;e vorm en nauwe grootteverdeling 38. Deze techniek omvat het dispergeren van een alginaat fase in een continue oliefase die stroomt door een kanaal en voert een calciumchloridebad. Spray draying is een andere techniek die erg klein microdeeltjes 39 geproduceerd. Het is ook belangrijk op te merken dat alginaat kan worden geladen met eiwitten of groeifactoren en kunnen verknoopt met andere divalente ionen zoals zink of barium zijn.

In dit werk karakteriseren we een lijmsysteem met potentiële toepassingen in de tissue engineering. De trekproef specifiek gericht op de hechtsterkte van het samengestelde kwantificeren bij contact met varkens kraakbeen. Dit type substraat werd gekozen om de hechting van de hydrogel composiet nabootsen aan het kraakbeen eindplaten van de tussenwervelschijf. Andere Papier substraten, zoals varkenshuid, kan worden gebruikt als alternatief voor de sterkte van een kleefstof 40 kwantificeren, maar het zal weefseltypeAfhankelijk van de beoogde toepassing. Behoud van een goede temperatuurregeling van het zout waterbad en voorkoelen het composiet voor gebruik zijn cruciaal bij het nauwkeurig meten van de mechanische eigenschappen. Verhoogde waterbad temperaturen boven 37 ° C zal de hydrogel snel krimpen en verstijven, terwijl samenstellingen die mechanisch beneden 37 ° C getest zal vertonen verminderde treksterkte door het ontbreken van fasenscheiding. Momenteel ontwikkelen we methoden om de afschuiving bestendige sterkte van verschillende injecteerbare hechtmiddelformuleringen onderzoeken. Toekomstige werkzaamheden omvatten uitvoeren ex vivo mechanische proeven met varkens IVD te bepalen of het kleefmiddel bestand tegen extrusie door een ringvormig defect en herstelt biomechanische functionaliteit aan de wervelkolom bewegingssegment.

Boven 32 ° C, PNIPAAm-G-CS krimpt en voert water uit de hydrogel matrix door het LCST gedrag van PNIPAAm, wat resulteert in een verminderde massa engedurende 7 dagen in PBS (figuur 2). Omgekeerd toevoeging van alginaat microdeeltjes zorgt voor een zwellende werking en de lijm massa significant verhoogd (p <0,05) bij een microdeeltje concentratie van 25 mg / m en nog meer bij 50 mg / ml. In deze studie zwelling, veranderingen in natte gewicht van de hydrogel zijn waarschijnlijk worden veroorzaakt door wateruitwisseling met de omgeving, aangezien PNIPAAm-g-CS is gebleken selectief afgebroken in aanwezigheid van enzymen 29 zijn. Veel van de stappen protocol ontwikkeld voor de zwellende studie werden aangepast op basis van de thermoreversibility van PNIPAAm-G-CS. Hydrogel schijven moeten volledig overzetten bij 37 ° C voor het toevoegen van de voorverwarmde PBS-oplossing, anders wordt de gel te dispergeren. Na zwellen gedurende één week, moet de PBS-oplossing snel en voorzichtig uit de flacons voor de hydrogels terug naar een vloeistof-achtige toestand terugkeren. Opgemerkt wordt dat de zwelling protocol beschreven in dit document niet volledig simulerenin vivo omgeving van de inheemse IVD. De zweleigenschappen van de steiger in vivo hangt af van de osmotische druk van de omringende weefsels 41 en afbraakgedrag van de gel. In het algemeen, de toegenomen zwelvermogen met alginaat microdeeltjes opname wordt gunstig beschouwd, omdat de injecteerbare hydrogel zal helpen ruimtevullende verblijf bij fysiologische temperatuur. Kenmerken, zoals de zwelling verhouding en het watergehalte kunnen worden berekend met extra droge massa metingen. Toekomst zwellingsstudies omvat dompelen hydrogel disks tegen een polyethyleenglycol (MW = 20.000 g / mol) bad, dat een osmotische druk toepassen en bootsen de in vivo omgeving van de IVD.

Naast de mechanische eigenschappen en zwelling, moet het kleefmiddel cellulaire biocompatibiliteit vertonen om als geschikt steiger worden beschouwd. Eerdere studies hebben het voortbestaan ​​van encapsula aangetoondted cellen in alginaat 42,43 en PNIPAAm-gebaseerde materialen 44,45. Resultaten van zowel de Live / Dead XTT en assays zijn in overeenstemming met deze eerdere bevindingen suggereren geschikte levensvatbaarheid van de cellen gedurende 5 dagen (figuren 3 en 4). Ons laboratorium heeft ook uitgevoerd vooronderzoek van de levensvatbaarheid over een langere tijdsverloop (21 dagen) en de waargenomen vergelijkbaar gedrag. In het algemeen moet een overschot van PNIPAAm-G-CS en microdeeltjes bereid om eventuele materiële schade tijdens overdracht pipet. Nogmaals, het is uiterst kritisch voor steiger architectuur te behouden door het handhaven van de juiste temperatuur bij 37 ° C. Als het schavot netwerk terugkeert van een gel om een ​​vloeistof-achtige toestand, celhechting en de levensvatbaarheid kunnen gecompromitteerd worden. Met betrekking tot de Live / Dead assay, natriumcitraat speelt een belangrijke rol bij de verwijdering en afbraak van alginaatmicrodeeltjes. Natriumcitraat keert de verknoping actie tussen calcium en alginaat en veroorzaakt een suspensie te vormen 46. Extra wassingen met PBS om PNIPAAm-G-CS verwijderen of alginaat kan worden uitgevoerd om de kwaliteit van de beelden te verbeteren. Tijdens de XTT assay worden polymeermonsters die geen cellen afgelopen de putjes. Deze duplo's dienen als blanco standaarden en vereist een nauwkeurige absorptiewaarde berekenen. Onze voorlopige haalbaarheidsstudies zijn strikt gebaseerd op het gebruik van HEK-293-cellen. In toekomstige studies zal de differentiatie van ingekapselde adipeus afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC-AD) in nucleus pulposus cellen worden aangetoond. AD-MSC differentiatie richting NP-fenotype is aangetoond door dynamische compressie 47 en hypoxie 48,49.

Kortom, de voorgestelde kleefstof toont belofte voor weefselregeneratie toepassingen lastdragende gebieden, zoals de tussenwervelschijf, waarbij het succes van de strategie regeneratie zal afhangen scaffold vermogen resist ontwrichting tijdens de beweging en het laden. Dit systeem is zeer veelzijdig omdat het zou kunnen worden aangepast aan extracellulaire matrixeiwitten of groeifactoren die specifiek zijn voor de gewenste gebruiksdoeleinden. Belangrijk, kan de hier beschreven werkwijzen worden aangepast aan elke karakteriseringsonderzoek met thermogelling polymeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag de hulp van Dr. Jennifer Kadlowec dankbaar erkennen in de ontwikkeling van de lijm trekproef protocol.

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten en het Nationaal Instituut voor Biomedische beeldvorming en Bioengineering van de National Institutes of Health onder Award Number 1R15 AR 063920-01. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Tags

Bioengineering hydrogel biologisch hechtende tissue engineering biomedische engineering steiger thermogelling injecteerbare
Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christiani, T. R., Toomer, K.,… More

Christiani, T. R., Toomer, K., Sheehan, J., Nitzl, A., Branda, A., England, E., Graney, P., Iftode, C., Vernengo, A. J. Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (116), e53704, doi:10.3791/53704 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter