Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese af termogelerende Poly (N-isopropylacrylamid) X-graft-chondroitinsulfat Composites med alginatmikropartikler for Tissue Engineering

Published: October 26, 2016 doi: 10.3791/53704
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 3, 2, 1
1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

Summary

En injicerbar vævsmanipulering stillads bestående af poly (N-isopropylacrylamid) X-graft-chondroitinsulfat (PNIPAAm-g-CS) holdige alginatmikropartikler blev fremstillet. Klæbestyrken, hævelse egenskaber og in vitro biokompatibilitet analyseres i denne undersøgelse. De karakteriseringsteknikker udviklet her, kan være gældende for andre termogelerende systemer.

Abstract

Injicerbare biomaterialer er defineret som implanterbare materialer, som kan føres ind i kroppen som en væske og størkner in situ. Sådanne materialer tilbyde de kliniske fordele ved at blive implanteret minimalt invasivt og nemt danne rum-påfyldning faste stoffer i uregelmæssigt formede defekter. Injicerbare biomaterialer er blevet bredt undersøgt som stilladser til vævsopbygning. Men til reparation af visse belastningsbærende områder i kroppen, såsom intervertebral disc, stilladser bør besidde adhæsive egenskaber. Dette vil minimere risikoen for dislokation under bevægelse og sikrer intim kontakt med det omgivende væv, hvilket giver tilstrækkelig overførsel af kræfter. Her beskriver vi fremstilling og karakterisering af et stillads bestående af termisk følsomme poly (N-isopropylacrylamid) X-graft-chondroitinsulfat (PNIPAAM-g-CS) og alginatmikropartikler. Den PNIPAAm-g-CS copolymer danner en viskos opløsning i vand ved stuetemperatur, i hvilket Alginate partikler er suspenderet kan forbedre vedhæftningen. Over den nedre kritiske opløsningstemperatur (LCST), omkring 30 ° C, copolymeren danner en fast gel omkring mikropartiklerne. Vi har tilpasset standard biomaterialer karakterisering procedurer for at tage hensyn til den reversible faseovergangen for PNIPAAm-g-CS. Resultaterne viser, at inkorporering af 50 eller 75 mg / ml alginat partikler til 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS løsninger firdobler klæbende trækstyrke på PNIPAAm-GCS alene (p <0,05). Inkorporeringen af ​​alginatmikropartikler også øger hævelse kapacitet PNIPAAm-g-CS (p <0,05), medvirker til at opretholde et rum-påfyldning gel inden vævsdefekter. Endelig Resultaterne af in vitro toksikologi assaykit, 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilid (XTT) og live / dead levedygtighedsassay indikerer, at lim er i stand til at understøtte overlevelse og spredning af indkapslet humane embryonale nyre (HEK) 293 calen over 5 dage.

Introduction

Injicerbare biomaterialer er dem, der bekvemt kan afgives til legemet som en væske og størkner in situ. Sådanne materialer er blevet anvendt i udstrakt grad i regenerativ medicin, hvor de anvendes til at levere indkapslede celler til det angrebne sted 1-4 og fungere som en tredimensional midlertidig ekstracellulær matrix for cellerne 5. For patienten injicerbare biomaterialer er fordelagtige, fordi de kirurgiske procedurer for implantation er minimalt invasiv og den faste fase kan udfylde uregelmæssigt formet vævsdefekter, hvilket eliminerer behovet for specialfremstillede størrelse implantater.

Injicerbarhed kan opnås gennem en række forskellige mekanismer. Eksterne faktorer, ligesom pH, er blevet undersøgt som en udløsende faktor for dannelsen af geler, der indkapsler celler og bioaktive molekyler 6-8. Dog kan pH ikke være den mest bekvemme trigger til brug i alle fysiologiske miljøer. En anden traditionel alternative til at opnå injicerbarhed bruger in situ kemisk polymerisation eller tværbinding. En gruppe udviklede en vandopløselig redoxsystem bestående af ammoniumpersulfat og N, N, N ', N' tetramethylethylendiamin og brugt det til omsætning af makromere sammensat af polyethylenglycol og poly (propylen) glycol 9,10. Zan et al. 11 udviklede injicerbare chitosan polyvinylalkohol netværk tværbundet med glutaraldehyd. I sådanne systemer skal cytotoksicitet af reaktive komponenter overvejes, især for applikationer, der involverer celle indkapsling. Også kunne exoterm polymerisation producere høje nok temperaturer at kompromittere omgivende væv, som er blevet rapporteret for polymert knoglecement 12,13.

Endnu andre injicerbare polymere systemer er blevet udviklet som udviser en ændring fra væske til fast tilstand med temperaturen som aftrækkeren. Kendt som termogelerende systemer, disse er aqueoos polymeropløsninger, der ikke kræver kemisk stimulus, monomerer eller tværbindere at opnå in situ-dannelse 14. Snarere en faseovergang normalt forekommende nær fysiologisk temperatur inducerer dannelsen af ​​en fysisk tværbundet tredimensionalt netværk. Poloxamerer såsom Pluronic F127 er blandt de mest undersøgte polymerer til termogelerende lægemiddeladministration 15-17 og celleindkapsling 18,19. Det er imidlertid godt accepteret, at disse geler mangler stabilitet ved fysiologiske betingelser. Undersøgelser har vist øget stabilitet ved hjælp kædeforlængere 20 eller kemiske tværbindingsmidler 21,22. Ikke desto mindre kan anvendelsen af ​​disse reagenser begrænse muligheden af ​​materialerne til celleindkapsling.

Poly (N-isopropylacrylamid) er en syntetisk termogelerende polymer, der har fået stor opmærksomhed i tissue engineering og drug delivery 14. Vandige opløsninger af poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) udviser en lavere kritisk opløsningstemperatur (LCST), typisk forekommende omkring 32-34 ° C 23,24. Under LCST, vand hydrater PNIPAAm kæder. Over overgangstemperaturen, bliver polymeren hydrofob, hvilket resulterer i en dramatisk faseadskillelse 25-27 og dannelse af en fast gel uden anvendelse af giftige monomerer eller tværbindere. Men PNIPAAm homopolymerer udviser dårlige elastiske egenskaber og holde lidt vand ved fysiologisk temperatur grundet hydrofobicitet 28. I dette arbejde, vælger vi at indarbejde chondroitin sulfat kovalent til PNIPAAm netværk, som giver mulighed for enzymatisk nedbrydelighed 29, anti-inflammatorisk aktivitet 30,31, og øget vand og næringsstoffer 32. PNIPAAm copolymerer med CS blev fremstillet i vores laboratorium ved at polymerisere monomeren NIPAAm i nærvær af methacrylat-funktionaliserede CS til dannelse podet copolymer (PNIPAAm-g-CS). BecABrug af den lave tværbindingsdensitet af copolymeren, PNIPAAm-g-CS danner en viskos opløsning i vand ved stuetemperatur og en elastisk gel ved fysiologisk temperatur på grund af LCST 29. Polymeropløsningerne bliver flydbare igen ved afkøling under LCST grund af reversibiliteten af ​​overgangen.

Vi har vist, at PNIPAAm-g-CS har potentiale til at fungere som en vævsmanipulering stillads, på grund af mekaniske egenskaber, der kan være skræddersyet, nedbrydelighed og cytocompatibility med human embryonisk nyre (HEK) 293-celler 29. I visse bærende områder, såsom intervertebral disk, skulle tissue engineering scaffolds har evnen til at danne en væsentlig grænseflade med omgivende skive væv for at eliminere risikoen for dislokation 33. Denne grænseflade er også nødvendigt for en tilstrækkelig transmission af kraft i hele grænsefladen mellem implantatet og vævet 33. I vores arbejde har vi suspenderet enlginate mikropartikler i vandige opløsninger af PNIPAAm-g-CS og fandt, at gelering lokaliserer de mikropartikler, som giver vedhæftning med omgivende væv 34. I dette papir, vi skitsere de skridt til forberedelse af termogelerende, klæbende polymer. Standardteknikker for biomaterialer karakterisering, cell imaging, og assays for levedygtighed blev tilpasset for at tage højde for temperaturfølsomhed af polymeren og reversibiliteten af ​​faseovergangen. Den injicerbare polymer er beskrevet i dette papir har bred potentiale for drug delivery og vævsdyrkningsapplikationer uden for dem, der beskrives i dette dokument. Endvidere kan karakteriseringsmetoder beskrevet her anvendes i andre termogelerende systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Poly (N-isopropylacrylamid) -g-chondroitin sulfat Synthesis

  1. Forud for syntese af det bioadhæsive hydrogel, oprense N-isopropylacrylamid (NIPAAm) monomer og methacrylat chondroitinsulfat (CS).
    1. Afvej mindst 10 g NIPAAm og opløse monomeren i 400 ml n-hexan ved 60 ° C. Omrør beholderen periodisk indtil fuldstændig opløsning. Omkrystalliseres opløsning i en -20 ° C fryser i 24 timer.
    2. Fjern det krystalliserede monomer fra beholderen og vakuumfilter n-hexan under anvendelse af en Buchner-tragt. Placer monomeren i en vakuumovn ved stuetemperatur i 24 timer til fjernelse af eventuelt resterende n-hexan. Opbevar monomeren i en -20 ° C fryser til senere brug (se trin 1.2).
    3. Afvej og opløs 2,0 g chondroitinsulfat i 8,0 ml deioniseret vand. Opvarm forsigtigt opløsningen til 60 ° C.
    4. Indstil pH af opløsningen til 10 under anvendelse af ca. 10 til 40 pi 50% (vægt / vægt) NaOH.
    5. Tilsættes 0,298 ml methacrylanhydrid (MA). Tilbagesvaling i 24 timer under omrøring ved 60 ° C.
    6. Hæld 400 ml acetone opløsning i en krukke og chill O / N i en -20 ° C fryser.
    7. Efter der er gået 24 timer, langsomt hæld hele methacrylerede CS (MCS) opløsning i 400 ml kold acetone, under omrøring med en magnetisk omrører.
    8. Fjern MC'er fra acetone og bundfaldet i en vakuumovn. Udfør dette trin hurtigt for at bevare en intakt og sammenhængende stat for MC'er. Tillad det tilbageværende acetone til at fordampe under vakuum i mindst 24 timer.
  2. Co-opløses 10 g renset NIPAAm og 2,209 g af MCS i 232 ml deioniseret vand.
  3. Rense opløsning af oxygen ved hjælp af inert nitrogengas. Oprethold en kraftig, men alligevel lav gasstrømningshastighed for at forhindre opløsningen fra sprudlede i 15 min.
  4. Fortsæt rensning af opløsningen med nitrogengas og tilsættes 0,976 ml tetramethylethylenediamine (TEMED).
  5. Dernæst initiere polymeriseringsreaktionen ved blanding 97,6 mg ammoniumpersulfat (APS).
  6. Bland opløsningen til ca. 20 sek og hurtigt tætne løsning for at forhindre eventuel luft i at komme ind i karret. Lad opløsningen polymerisere under fluorescerende lys i 24 timer.
  7. Efter 24 timer anbringe reaktionsbeholderen i en 37 ° C varm ovn. Tillad hydrogelen til at skifte fra en væske til en gel-lignende tilstand. Sænk den polymeriserede hydrogel i 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) i i alt 7 dage for at tillade diffusion af uomsat monomer ud af hydrogelen.
  8. Ved hjælp af en saks, klippe hydrogelen i adskillige små stykker, ikke større end 5 cm i diameter. At forhindre hydrogelen fra skifter fra en gel-lignende tilstand til en væske, terninger polymeren inden for 37 ° C PBS-opløsning. Overfør portionerne i 50 ml koniske rør.
  9. Forberede prøverne for lyofilisering af indpakning toppen afrørene med Kimwipes og elastikker. Frys glassene ved -70 ° C i 1 til 2 timer.
  10. Placer koniske rør på frysetørreren at fjerne alt vand fra hydrogelen. Før betjening, frysetørreren skal nå en temperatur og tryk på ca. -40 ° C og 0,04 mbar, hhv. Et minimum på 7 dage er nødvendig for fuldstændig tørring.
  11. Grind den frysetørrede polymer til et fint pulver og opbevares i et 4 ° C køleskab til senere brug (se trin 3.1).

2. Calcium-alginat krydskæder mikropartikel Synthesis

  1. En 2% (vægt / volumen) alginat opløsning ved opløsning 400 mg i 20 ml deioniseret vand. Opvarm opløsningen til ca. 60 ° C for at lette opløsningen.
  2. En 2% (vægt / volumen) calciumchloridopløsning ved tilsætning 400 mg til 20 ml deioniseret vand.
  3. Opret en olie i vand-blanding ved at kombinere 100 ml canolaolie, 1,0 ml Tween 20 og 20 ml2% (vægt / volumen) alginat. Emulgere blandingen i 10 minutter med en homogenisator ved 15.000 rpm. Derudover, blandes med en magnetisk omrører ved 200 omdrejninger i minuttet eller 2.000 rpm at skabe store eller små mikropartikler, hhv.
  4. Aspirer 2% (vægt / volumen) calciumchloridopløsning anvendelse af en sprøjte med en 18 G nål spids. Tilsæt langsomt calciumchlorid dråbevis i emulsionen.
  5. Når de 20 ml calciumchlorid er udtømt, tillade mikropartiklerne inden emulsionen til tværbinding i 10 min.
  6. Jævnt distribuere batch af mikropartikler i udjævnede 50 ml koniske rør og centrifugeres til en kraft på 1400 xg i 2 min for at fjerne det oprindelige lag af rapsolie.
  7. Fortløbende vask, vortex, og centrifuger mikropartikler med isopropanol i alt tre gange ved 1.400 g i 2 min for at fjerne eventuel resterende canolaolie. Bortkast isopropanol supernatanten efter hvert centrifugeringstrin og vaskes med frisk isopropanol.
  8. Når OIl er fjernet, Bundfaldet vaskes yderligere tre gange med deioniseret vand for at fjerne eventuelt tilbageværende isopropanol. Kassér deioniseret vand supernatanten efter hvert centrifugeringstrin og vask med frisk deioniseret vand. Fjern ca. 100 mg våde mikropartikler og butik i et hætteglas. De våde mikropartikler vil blive anvendt til at måle den gennemsnitlige diameter af portionen ved lysmikroskopi.
    1. Under anvendelse af lysmikroskopi, dispergere en lille prøve af våde mikropartikler i deioniseret vand på et objektglas. Afhængigt af størrelsen af ​​mikropartiklerne, bruge et 10X eller 20X objektiv, og justere den numeriske apertur indtil partiklerne kommer i fokus. Sørg for, at mikroskopet er kalibreret til den korrekte mål og justere lysstyrken af ​​lyskilden efter behov. Brug en linje værktøj til at måle den længste diameter på 50 tilfældige alginatmikropartiklerne og opnå en gennemsnitlig størrelse for batchen.
  9. Forbered mikropartikler til lyofilisering By pakke dem med Kimwipes og sikre dem med elastikker. Frys mikropartiklerne ved -70 ° C i 1 time.
  10. Placer mikropartiklerne på lyofilisatoren og lad prøven tørres i mindst 24 timer. Grind den frysetørrede mikropartikler til et fint pulver ved hjælp af en morter og støder og opbevar det i et 4 ° C køleskab til senere brug (se trin 3.3).

3. Forberedelse af Lim

  1. Brug af den frysetørrede polymerpulver, oprette en 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS-opløsning ved at opløse 50 mg hydrogel pulver i 1 ml 1x PBS.
  2. Bland opløsningen under anvendelse af en vortex og chill i køleskab ved 4 ° C i 24 timer.
  3. Når Den viskøse opløsning former, skabe en homogen komposit ved tilsætning af 25 eller 50 mg frysetørrede alginatmikropartikler til hydrogelen opløsning og vortex. Opbevar komposit i køleskab ved 4 ° C til senere brug (se trin 4.3 og 4.8).

4. bioadhæsive Mechnisk trækprøvning

  1. Forud for udførelse af trækprøvning, udtrække brusk underlag fra en svine øre.
    1. Optø et porcint øre i en varm 0,9% (vægt / volumen) NaCl-opløsning; dette vil bidrage til at løsne vævet.
    2. Ved hjælp af en skalpel, isolere og afsnittet ud et fladt, rektangulært område ved at skære lodret selvom epidermale lag, subkutant væv, og brusk. Undgå at skære de krumme rygge af den porcine øre.
    3. Adskil den epidermale lag af huden fra brusk ved at skære parallelt gennem det subkutane væv. Brusken er en hård, hvid væv findes under svinehud.
    4. Skrab forsigtigt det subkutane væv, der er fastgjort til brusk med siden af ​​skalpellen. Undgå at skære ind i bruskvæv med skalpelblad.
    5. Sikre, at kun den ene side af brusk udsættes og flad under trækprøvning. Hvis det er nødvendigt, flade brusk ved at afskære den ujævn hud på undersiden.
    6. Skær bruskvæv i flere stykker med dimensioner på 1 cm x 1 cm. Opbevar bruskvæv i koniske rør fyldt med 0,9% (vægt / volumen) NaCl-opløsning i en -20 ° C fryser.
  2. Forbered 2,0 I 0,9% (vægt / volumen) NaCI-opløsning. Forvarm saltopløsningen til 37 ° C. Temperaturen af ​​denne opløsning skal opretholdes gennem afprøvning.
  3. Optøning den frosne brusk. Holde både den porcine brusk og hydrogelpartiklerne prøver i en Styrofoam beholder med ice packs.
  4. Fastgør kraftmåler til armen af ​​prøvestand. Placer en kogeplade på toppen af ​​kraft stå og indstille temperaturen til 50 ° C.
  5. Anbringe en 1 cm x 1 cm stykke af brusk til rustfrit stål blok med cyanoacrylat lim og en pincet. Lim et ekstra stykke brusk til Delrin cylinder og fastgør cylinderen til kraftmåler. Det er meget vigtigt, at begge brusk overflader vender mod hinanden og kontakt hydrogelen.
  6. Placereplexiglasset vandbad oven på den varme plade og sæt rustfrit stål blok med brusk substrat inde i badet.
  7. Sænk arm prøvestand og tilpasse både brusk substrater med hinanden. Hæv armen og efterlade nok plads til at anvende hydrogel.
  8. Med en pipette med positiv fortrængning, dispensere 200 pi af det bioadhæsive hydrogel til bunden stykke brusk.
  9. Sænk armen af ​​force stand på 1 mm / min, indtil de hydrogel kontakter den øvre stykke af brusk og udøver en forbelastningskraft på 0,001 N.
  10. Hæld 37 ° C saltvandsopløsning ind i badet, indtil volumenet når den udpegede vandstand. Kontrollere temperaturen af ​​opløsningen med et termoelement.
  11. Tillad hydrogelen angive for i alt 5 minutter. Når gelen er størknet, hæve armen med en hastighed på 2 mm / min. Testen er færdig, når bioadhæsiv løsner fra brusk substrat eller når et markant fald i kraft opstår,signalering fiasko.
  12. Saml de registrerede data og hæve armen af ​​prøvestand. Fjern Delrin cylinder fra kraftmåler. Hæld saltopløsningen ind i sin tidligere beholder og genopvarmning til 37 ° C.
  13. Beregne spændinger ved at subtrahere den kraft, der udøves af polymeren fra opdriften af ​​en "blank", Delrin fastgørelse uden brusk eller klæbemiddel, hævet med samme hastighed, og dividere med limfugen.

5. Hævelse Undersøgelse af PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler

  1. Forbered rene hætteglas og mærke dem korrekt med et tidspunkt, prøvetype og antal stikprøver. Klæbemidlerne kan også skabes som tidligere beskrevet. Forbered alt fem prøver (n = 5) for hver prøvetype per tids- punkt.
  2. Pre-afveje alle hætteglas og registrere deres oprindelige masse ved RT.
  3. Ved hjælp af en sprøjte, dispensere ca. 0,4 ml af det forberedte klæbende prøve i hver af de fem hætteglas.Gentag dette trin for hver prøvetype på tværs af alle testede tidspunkter.
  4. Afvej og registrer massen af ​​hvert hætteglas med klæbemidlet prøvetypen ved stuetemperatur.
  5. Pre-varme en orbital inkubator og 1 I 1x PBS-opløsning til 37 ° C.
  6. Organiser alle hætteglassene på en rist og sæt stativet i inkubatoren. Tillad klæbemidlerne til at skifte fra en væske til en gel til ca. 5 til 10 min.
  7. Tilsættes 5,0 ml 1x PBS til hvert hætteglas. Vær sikker på at omhyggeligt tilføje PBS løsning langs siden af ​​hætteglasset for at forhindre, at hydrogel disken fra at bryde fra hinanden.
  8. Cap hvert hætteglas for at forhindre fordampning af PBS-opløsning og opretholde den indre temperatur inkubator ved 37 ° C. Hvert sæt af hydrogel diske skal forblive nedsænket i PBS i en udpeget tidsperiode.
  9. Når en 7 dages tid punkt er nået, Tag hætten af ​​sæt af hætteglas og fjern PBS-opløsning fra hvert hætteglas. Afvej hvert hætteglas med klæbemidlet prøve igen ved stuetemperatur.
<p class = "jove_title"> 6. Kvalitativ Cell levedygtighed Brug en Live / Dead Assay

  1. Før du udfører Live / Dead assay med PNIPAAm-g-CS, vokse humane embryonale nyre 293 celler (HEK-293) til 80% sammenløb.
    1. Quick-tø det frosne HEK-293 cellesuspension ved at placere cryovialet i et 37 ° C vandbad, centrifugeres cellerne ved 400 x g ved 4 ° C i 5 minutter i et 15 ml konisk rør.
    2. For at gøre den første passage cellevækstmediet, kombinere i høj glucose (4,5 g / L) Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) til en slutkoncentration på 20% og 100x penicillin-streptomycin-opløsning ( pen-strep) til en endelig koncentration på 100 IU / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. For alle andre passager, skifte til DMEM med 10% FBS og 1 x pen-strep.
    3. Resuspender cellepelleten i 10 ml vækstmedium og overfør suspensionen til et 100 mm petri diameter skål. jævnt distribute cellerne ved langsomt at vippe parabol til bag og venstre mod højre et par gange hver retning.
    4. Dyrke cellerne i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Hvis det er nødvendigt, ændre medium hver to dage.
    5. Når cellerne når 80% konfluens, replikere kulturen i flere retter. Fjern mediet fra pladen.
    6. Der tilsættes 1 ml 0,5% trypsin til pladen. Tillad pladerne til at inkubere ved 37 ° C i 10 min. Kontroller, om cellerne løsnes fra overfladen ved forsigtigt at hvirvle pladen.
    7. Til opdeling kulturen 1:10, tilsættes 9 ml regelmæssig vækstmedium (DMEM med 10% FBS) til de trypsiniserede celler og bland forsigtigt ved at vippe skålen.
    8. Dispensér 1 ml af den fortyndede cellesuspension til hver ny skål og tilsæt 9 ml vækstmedium. Bland forsigtigt ved at vippe fadet.
    9. Dyrke cellerne i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Hvis det er nødvendigt, ændre mediet nogensindey to dage, indtil cellerne når 80% sammenløb.
  2. Fjern mediet fra to dyrkningsskåle dyrket til 80% konfluens.
  3. Der tilsættes 1 ml 0,5% trypsin til hver plade. Tillad pladerne til at inkubere ved 37 ° C i 10 min. Kontroller, om cellerne løsnes fra overfladen ved forsigtigt at hvirvle pladen.
  4. Vask de HEK-293-celler på pladen med 3 ml vækstmedium to gange og tilføje både suspensioner til samme 15 ml konisk rør.
  5. Centrifugeres 15 ml konisk rør i 10 minutter ved 400 xg ved 4 ° C.
  6. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml medium ved pipettering op og ned.
  7. Afpipetteres 10 pi af cellesuspensionen i et hæmocytometer, og udføre en celletælling at bestemme celletætheden. Øge mængden af ​​medium suspension, hvis den oprindelige koncentration cellen er for høj, og omvendt reducere lydstyrken hvis koncentrationen er for lav, for at bevare et mål concentration på 1 x 10 6 celler / ml. Centrifuger HEK-293-celler ved 400 xg og resuspender cellepelleten i det korrigerede volumen af ​​medier i overensstemmelse hermed.
  8. vortexes forsigtigt cellesuspensionen og fordeles jævnt celle mix i fire separate 15 ml koniske rør for følgende testbetingelser: positiv kontrol monolag, negativ dræbt kontrol i PNIPAAm-g-CS anvendelse af 70% (v / v) methanol, HEK-293 celler indkapslet i PNIPAAm-g-CS og HEK-293 celler indkapslet i PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler.
  9. Skabe positive kontrolceller monolag ved pipettering multipel 300 pi volumener af cellen blandes ind en 24-brønds plade til at generere 4-6 udtages.
  10. Fjern medier fra koniske rør vedrørende den dræbte kontrol, PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler.
    1. Centrifuger koniske rør i 5 minutter ved 400 xg og fjern supernatanten.
    2. Opretholde samme cellekoncentration ved at resuspendere calen i den samme mængde PNIPAAm-g-CS som den fjernede medier. Pipette polymer celle mix op og ned ved hjælp af en serologisk pipette indtil homogen.
      1. Hvis podning med alginatmikropartikler, overføre PNIPAAm-g-CS-cellesuspension (opnået som beskrevet for 6.10.2) i en 35 mm dyrkningsskål og indføre partiklerne i blandingen. Pipette cellen mix op og ned ved hjælp af en serologisk pipette indtil homogen.
    3. Brug af den serologiske pipette, dispensere flere 300 pi polymeren celle mix i hver af brøndene til dræbt kontrol, PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler at generere 4 - 6 udtages.
  11. Inkubér pladen ved 37 ° C i 10 til 15 min og tillade PNIPAAm-g-CS til at skifte fra en væske til en gel (polymeren danner en uigennemsigtig, hvid disk).
  12. Placer et dias varmere i hætten og sæt temperaturen til 37 ° C. Brug objektglasvarmer at opretholde brønds pladetemperatur og pipette 600 pi forvarmet medier i hver brønd. For yderligere at forhindre Overgang af polymeren til en flydende tilstand, placere en lampe med en fluorescerende pære over skålen at opvarme luften ovenover.
  13. Inkubér cellerne i 5 dage ved 37 ° C med 5% CO2.
  14. Efter der er gået fem dage, forberede Live / Dead farvestof miks med ethidiumhomodimer (EthD-1) og calcein AM. Begge stoffer er lysfølsomme og forberedt på dagen for brug.
    1. Optøning af calcein AM og EthD-1 fra sættet ved RT.
    2. Der tilsættes 5 ml sterilt 1x PBS til en konisk rør og pak det ind i alufolie.
    3. Tilføj 6,67 pi 2 mM EthD-1 til det konisk rør. Vortex løsningen blandingen grundigt.
    4. Dernæst tilsættes 2,5 pi 4 mM calcein AM til den konisk rør. Vortex blandingen grundigt.
  15. Fjern mediet fra brøndene i monolag (positiv kontrol), PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS with alginatmikropartikler. Vaske alle brøndene grundigt, men forsigtigt, med PBS og fjern PBS.
  16. Tillad hydrogelsammensætningerne diske, der indeholder alginatmikropartikler til at flydende ved stuetemperatur, og der tilsættes 2 ml 50 mM natriumcitrat til hver af brøndene.
  17. Fjern mediet fra de dræbte celle brønde (negativ kontrol). Tillad hydrogelsammensætningerne skiver til at flydende ved stuetemperatur, og der tilsættes 300 pi 70% (v / v) methanol til hver brønd.
  18. Inkubér pladen i 45 minutter ved 37 ° C.
  19. Fjern natriumcitrat og methanolopløsninger fra brøndene og pipette hver af hydrogelen suspensioner i individuelle mikrocentrifugerør. Centrifuger rørene ved 2000 x g i 10 min for at separere cellerne fra hydrogelen suspensionen.
  20. Fjern forsigtigt suspensionen ved pipettering af opløsningen fra det konisk rør og efterlod cellepelleten. Pellet resuspenderes i 300 pi PBS og overførsel til den oprindelige brønd plade.
  21. Der tilsættes 300 pi than bor / Dead farvestof mix til hver af brøndene. Wrap brønds plade i aluminiumsfolie og inkuberes i 45 minutter på en rocker ved stuetemperatur.
  22. Billede alle prøverne under et omvendt fluorescens mikroskop med en 10X mål. Levende celler og dræbte celler vil vise en grøn og rød fluorescens, hhv.

7. Kvantitativ Cell levedygtighed Brug af en XTT Assay

  1. Grow HEK-293-celler til 80% sammenflydning. Fjern vækstmedierne fra to dyrkningsskåle.
  2. Der tilsættes 1 ml 0,5% trypsin til hver plade. Tillad pladerne til at inkubere ved 37 ° C i 10 min. Kontroller, om cellerne løsnes fra overfladen ved forsigtigt at hvirvle pladen.
  3. Vask de HEK-293-celler på pladen med 3 ml medium to gange og tilføje både suspensioner til samme 15 ml konisk rør.
  4. Centrifugeres 15 ml konisk rør i 10 minutter ved 400 xg ved 4 ° C.
  5. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml medierved pipettering op og ned.
  6. Afpipetteres 10 pi af cellesuspensionen i et hæmocytometer, og udføre en celletælling at bestemme celletætheden. Som tidligere beskrevet, bevare en målkoncentration på 1 x 10 6 celler / ml. Centrifuger HEK-293-celler ved 400 xg og resuspender cellepelleten i det korrigerede volumen af ​​medier i overensstemmelse hermed.
  7. vortexes forsigtigt cellesuspensionen og fordeles jævnt celle mix i fire separate 15 ml koniske rør for følgende testbetingelser: positiv kontrol monolag, negativ dræbt kontrol i PNIPAAm-g-CS anvendelse af 70% (v / v) methanol, HEK-293 celler indkapslet i PNIPAAm-g-CS og HEK-293 celler indkapslet i PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler.
  8. Skabe positive kontrolceller monolag ved pipettering 300 pi cellen blandes ind en 24-brønds plade til at generere 4 - 6 udtages.
  9. Fjern medier fra koniske rør vedrørende den dræbte kontrol, PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler.
    1. Centrifuger koniske rør i 5 minutter ved 400 xg og fjern supernatanten.
    2. Opretholde samme cellekoncentration ved resuspendering af cellerne i det samme volumen PNIPAAm-g-CS som den fjernede medie. Pipette cellen mix op og ned ved hjælp af en serologisk pipette indtil homogen.
      1. Hvis podning med alginatmikropartikler, overføre PNIPAAm-g-CS-cellesuspension i en 35 mm dyrkningsskål og indføre partiklerne i blandingen. Pipette cellen mix op og ned ved hjælp af en serologisk pipette indtil homogen.
    3. Brug af den serologiske pipette, dispensere 300 pi polymeren celle mix i hver af brøndene til dræbt kontrol, PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler at generere 4 - 6 udtages.
  10. Når alle de celleholdige prøver er blevet tilsat til 24-brønds plade, dispensere flere 300 pi volumener af PNIPAAm-g-KS og PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler uden celler i tilstødende brønde til at generere 4 - 6, der udtages.
  11. Inkubér 24-brønds plade ved 37 ° C i 10 til 15 min og tillade PNIPAAm-g-CS til at skifte fra en væske til en gel (polymeren danner en uigennemsigtig, hvid disk).
  12. Placer et dias varmere i hætten og sæt temperaturen til 37 ° C. Brug objektglasvarmer at opretholde brønds plade temperatur og pipette 600 pi forvarmet klar DMEM i hver brønd. For yderligere at forhindre Overgang af polymeren til en flydende tilstand, placere en lampe med en fluorescerende pære over skålen at opvarme luften ovenover.
  13. Inkubér cellerne i 5 dage ved 37 ° C ved 5% CO2.
  14. Efter fem dage, forberede 2,3-bis- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilid (XTT) reagens fra producenten. Den XTT reagenset er lysfølsomt og forberedt på dagen for brug.
    1. Fjern den gule flaske indeholdering XTT pulver fra køleskabet. Ved hjælp af en steril sprøjte og kanyle injiceres 5 ml klar DMEM (intet phenolrødt) gennem gummimembranen i den ravgule flasker.
    2. Opvarm reagens til 56 ° C i et vandbad i 10 minutter eller indtil opløsning.
    3. Fortynd XTT reagens til 20% (v / v) i en 15 ml konisk rør omviklet med aluminiumfolie. Alikvot det overskydende XTT reagens i mikrocentrifugerør og placere dem i -20 ° C fryser til langtidsopbevaring.
  15. Fjern mediet fra de dræbte celle brøndene (negativ kontrol) og tilsæt 300 pi 70% (v / v) methanol til hver brønd. Inkuber i 45 minutter ved 37 ° C og fjernelse af methanolen fra brøndene.
  16. Fjern mediet fra de resterende brønde i monolag (positiv kontrol), PNIPAAm-g-CS, og PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler. Vask alle brøndene grundigt, men forsigtigt, med PBS og derefter fjerne PBS.
  17. Der tilsættes 300 pi af 20% XTT reagens til hver af brøndene. Wrap plade med 24 brønde i aluminiumsfolie og inkuberes i 24 timer på en rocker ved stuetemperatur.
  18. Efter 24 timer tilsættes 200 pi 50 mM natriumcitrat til alle brøndene og inkuberes på rocker i yderligere time.
  19. Overføre alle de polymere suspensioner til mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 2000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
  20. Overfør 200 ul af supernatanten fra hvert mikrocentrifugerør til en 96-brønds plade. Ved hjælp af en mikrotiterpladelæser, opnå specifikke absorbansaflæsninger ved 450 nm og ikke-specifikke absorbansaflæsninger ved 690 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En termisk reagerende podet copolymer blev med held syntetiseret og karakteriseret for sin bioadhæsiv styrke, kvældningsegenskaber, og in vitro cytocompatibility. Vi valgte at undersøge alginat grund af sine veletablerede mucoadhæsive egenskaber. Alginatmikropartikler, med en gennemsnitlig diameter på 59,7 ± 14,9 um, blev blandet med 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS i koncentrationer på 25, 50 og 75 mg / ml. Disse koncentrationer var baseret på en halv, er lig med, og to gange den ækvivalente tørvægt PNIPAAm-g-CS i vandig opløsning. Mikropartikler koncentrationer over 75 mg / ml udstillet overdreven viskositet og blev ikke undersøgt. Den maksimale trækstyrke klæbestyrke på 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS med varierende koncentrationer af alginatmikropartikler blev sammenlignet med alene hydrogelen. Tilsætning af 50 eller 75 mg / ml alginatmikropartikler suspenderet i 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS resulterede i en firedobbelt increase i trækstyrke (p <0,05), som vist i figur 1. En mikropartikel koncentration på 25 mg / ml viste ikke en signifikant stigning i trækstyrke sammenlignet med 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). Der var ingen signifikant ændring i trækstyrken af ​​5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS når koncentrationen af ​​alginatmikropartikler blev øget fra 50 til 75 mg / ml (p> 0,05).

Kvældningsegenskaber det bioadhæsive hydrogel blev karakteriseret ved at dyppe forskellige formuleringer i PBS ved 37 ° C. Alginat mikropartikel koncentrationer på 25 og 50 mg / ml blev testet for at identificere eventuelle forskelle i kvældningsadfærd. Alginatmikropartikler blev målt under anvendelse af lysmikroskopi og havde en gennemsnitlig diameter på 25,0 ± 14,4 um. Efter 7 dage blev indledende og afsluttende våd masse af hydrogel skiver blev optaget og en ændring i masse beregnet for flere prøver pr klæbende formulation (n = 5). Figur 2 viser en drastisk forskel i ændringen i massen blandt alle formuleringer. Klæbemidler indeholdende både 25 og 50 mg / ml alginatmikropartikler vist positive ændringer i massen, mens 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS faldt i massen. Alle prøver viste sig at være signifikant forskellige fra hinanden (p <0,05) med klæbemiddel indeholdende 50 mg / ml alginatmikropartikler viser den største hævelse virkning.

Den biokompatibilitet af det foreslåede lim blev undersøgt både kvalitativt og kvantitativt ved hjælp af en Live / Dead og XTT cytotoksicitetsbestemmelse. HEK-293-celler blev indkapslet i både 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-KS og 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS indeholdende 50 mg / ml alginatmikropartikler med en gennemsnitlig diameter på 59,7 ± 14,9 um . Et monolag af celler og indkapslede celler i PNIPAAm-g-CS aflivet med 70% methanol blev betragtet de positive og negative kontrol hhv. Formuleringer podet med celler blev karakteriseret efter 5 dages vækst i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Hver test angivne god cellelevedygtighed for både PNIPAAm-g-CS og PNIPAAm-g-CS med mikropartikler. Billeder fra figur 3 illustrerer levende celler fluorescerende grøn i begge klæbende formuleringer (panel A og B) og cellemonolaget, der tjener som den positive kontrol (panel C). Dræbte celler (panel D) fluorescerer en rød farve og viser celledød. Resultater fra XTT cytotoksicitetstests bekræftede resultaterne af Live / Dead assay. Den relative cellelevedygtighed af klæbemidlet indeholdende 50 mg / ml af mikropartikler faldt 1,3 gange sammenlignet med PNIPAAm-g-CS som illustreret i figur 4, men faldet var ikke statistisk signifikant (p> 0,05). Både PNIPAAM-g-CS og PNIPAAM-g-CS med mikropartikler havde også sammenlignelig levedygtighed til cellemonolaget (p> 0,05). Indkapslede celler i hydrogel formuleringer og cellemonolaget blev fundet at være signifikant forskellig i forhold til den negative kontrol (p <0,05). Samlet set tyder disse resultater på, at klæbemidlet indeholder mikropartikler ikke kun udviser forøget klæbestyrke, men god biokompatibilitet samt.

figur 1
Figur 1. Virkninger på Trækstyrke efter indarbejdelse af varierende koncentrationer af alginatmikropartikler i 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS. Trækstyrken af ​​PNIPAAm-g-CS firedoblet med tilsætning af 50 eller 75 mg / ml alginatmikropartikler (p <0,5). Fejlbjælkerne viser et beregnet 95% konfidensinterval (n = 5). Alginatmikropartikler havde en gennemsnitlig størrelse på 59,7 ± 14,9 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Effekt af varierende koncentrationer af alginatmikropartikler om kvældeevne på 5% (vægt / volumen) PNIPAAm-g-CS. Efter 7 dages nedsænkning i 37 ° C PBS, PNIPAAm-g-CS faldt i våd masse på grund af de hydrofobe egenskaber af PNIPAAm over LCST. PNIPAAm-g-CS med 25 eller 50 mg / ml alginatmikropartikler udstillet hævelse kapacitet. Forøgelse af koncentrationen af ​​mikropartikler signifikant forøget (p <0,05) ændringen i massen af ​​hydrogelen over 7 dage, tilskrevet vandoptagelse. Fejlbjælkerne viser et beregnet 95% konfidensinterval. Alginatmikropartikler havde en gennemsnitlig størrelse på 25,0 ± 14,4 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

gether.within-side = "1"> Figur 3
Figur 3. Repræsentant live / Dead Fluorescens Billeder af dyrkede HEK-293 celler over en periode på 5 dage. Cellerne blev indkapslet i (A) PNIPAAm-g-CS og (B) PNIPAAm-g-CS med 50 mg / ml alginat mikropartikler. Cellerne blev også dyrket i en (C) monolag og (D) dræbt med methanol i PNIPAAm-g-CS til at repræsentere en positiv og negativ kontrol, hhv. Live / Dead levedygtighed forsøg blev gentaget tre gange med tre replikater pr eksperiment. Scale søjler repræsenterer 100 um. Alginatmikropartikler havde en gennemsnitlig størrelse på 59,7 ± 14,9 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

ftp_upload / 53704 / 53704fig4.jpg "/>
Figur 4. Kortsigtede levedygtighed HEK-293 celler i PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler. Overlevelse af indkapslede HEK-293 celler inden PNIPAAm-g-CS med og uden alginatmikropartikler blev vurderet og sammenlignet ved hjælp af XTT efter 5 dage. En cellemonolaget, og indkapslede celler i PNIPAAm-g-CS dræbt med 70% methanol blev anvendt som positive og negative kontroller, henholdsvis. Både PNIPAAm-g-KS og PNIPAAm-g-CS med alginatmikropartikler viste ingen signifikant reduktion (p> 0,05) i cellelevedygtighed sammenlignet med cellemonolaget, men viste en signifikant reduktion (p <0,05) i cellelevedygtighed sammenlignet med dræbte celler. Tilsætningen af ​​alginatmikropartikler ikke væsentligt kompromitterer cellens levedygtighed PNIPAAm-g-CS (p> 0,05). Fejlbjælkerne viser et beregnet 95% konfidensinterval (n = 3, seks replikater pr eksperiment). Alginatmikropartikler havde en gennemsnitlig størrelse på 59,7 ± 14,9 um.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53704/53704fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere kritiske trin i syntese af hydrogel-mikropartiklen komposit og vurdere dens klæbestyrke, hævelse evne, og cellulære biokompatibilitet. Fri radikal polymerisation af PNIPAAm-g-CS kræver en vellykket methacrylation af chondroitinsulfat, fuldstændig opløsning af monomere bestanddele, og oxygenfrie reaktionsbetingelser. Forholdet mellem NIPAAm monomer til methacryleret chondroitinsulfat i reaktionsblandingen blev valgt, fordi det er blevet påvist, i vores tidligere arbejde, at generere copolymerer med mekaniske egenskaber svarende til nativt intervertebral disc væv 29. Forøgelse af mængden af ​​chondroitinsulfat i hydrogelen vil reducere vandtab under gelering og således formindske trykstivhed af gelen. Den valgte grad af methacrylation er også blevet vist at producere hydrogeler med favorable håndteringsegenskaber for injicerbarhed gennem en 18 G nål ved opløsning i vandig opløsning <sup> 29. En øget grad af methacrylat substitution af CS vil øge tværbindingsdensiteten af polymernetværket, forårsager øget opløsningsviskositet under LCST og reducerende gel hævelse kapacitet. Andre har undersøgt forskellige fremgangsmåder til syntese PNIPAAm hydrogeler såsom atom overførsel radikal polymerisation (ATRP) 35 eller omvendt tilsætning-fragmentering kædeoverførsel (RAFT) 36. Polymerisation via ATRP har ført til udviklingen af ​​smalle, polydisperse hydrogeler med bøde tunet molekylvægt ved at ændre monomer til initiator-forholdet. Funktionelle grupper kan podes i en kamlignende måde under anvendelse FLÅDE polymerisation, hvilket påvirker polymerkæde sammenfiltring og faseseparation.

En homogen vand-i-olie-blanding er nødvendigt at skabe ensartede, tværbundne alginatmikropartikler. En emulsion teknik er enkel at udføre og kræver ikke anvendelse af farlige kemikalier, dog begge micropaArtikel form og fordeling er svære at kontrollere. Mikropartikelstørrelse kan ændres ved at forøge emulsionen omrøringshastigheden og dermed skabe mindre partikler og vice-versa. I dette særlige undersøgelse blev alginat mikropartikelstørrelse undersøgt som en potentiel ejendom, der kan påvirke hævelse, mekanik, eller cellulær levedygtighed. Lysspredning kan også anvendes som et alternativ til måling af gennemsnitlige mikropartikelstørrelse. Andre emulsions egenskaber, såsom det overfladeaktive type og alginat koncentration vil påvirke mikropartikelstørrelse og aggregatdannelse 37. Formindskelse af alginat-koncentration vil reducere mikropartikelstørrelse dog aggregater er mere tilbøjelige til at danne. Variationer i den hydrofile og hydrofobe natur af overfladeaktive vil påvirke overfladespændingen mellem olie- og vandfaserne, dermed skiftende Dråbestørrelsen i emulsionen. Alginatmikropartikler kan alternativt fremstilles ved en mikrofluid anordning, som giver mulighed for ensartet partike form og snæver størrelsesfordeling 38. Denne teknik involverer at dispergere et alginat fase i en kontinuert oliefase, der strømmer gennem en kanal og kommer ind i en calciumchlorid bad. Spray draying er en anden teknik, som producerer meget små mikropartikler 39. Det er også vigtigt at bemærke, at alginat kan fyldes med proteiner eller vækstfaktorer, og kan være tværbundet med andre divalente ioner, såsom zink eller barium.

I dette arbejde, vi karakterisere et klæbemiddelsystem med potentielle anvendelser i vævsmanipulation. Vores trækprøve specifikt formål at kvantificere den adhæsive styrke af kompositten ved kontakt med porcin brusk. Denne type substrat blev udvalgt til efterligning adhæsion af hydrogelen komposit til brusk endeplader intervertebral diskus. Andre væv substrater, såsom porcin hud, kan anvendes som et alternativ til at kvantificere styrken af et klæbemiddel 40, men vævet type vilvarierer afhængigt af den tilsigtede anvendelse. Opretholde korrekt temperaturstyring af saltvand vandbad og forkøling kompositten før brug er afgørende i nøjagtig måling af de mekaniske egenskaber. Forhøjede vandbad temperaturer over 37 ° C vil medføre hydrogelen til hurtigt skrumpe og stivne, mens kompositter, der er mekanisk testet under 37 ° C vil udvise nedsat trækstyrke på grund af manglen på faseadskillelse. I øjeblikket er vi ved at udvikle metoder til at undersøge den forskydning klæbestyrke af forskellige injicerbare klæbende formuleringer. Fremtidige arbejde vil omfatte udførelse ex vivo mekaniske tests med svin IVDs at afgøre, om klæbemidlet modstår ekstrudering gennem en ringformet defekt og genskaber biomekaniske funktionalitet til spinalbevægelsessegmentet.

Over 32 ° C, PNIPAAm-g-CS krymper og ekskluderer vand fra hydrogelmatriksen grund af LCST adfærd PNIPAAm, hvilket resulterer i en nedsat masse i løbeten periode på 7 dage i PBS (figur 2). Omvendt tilsætning af alginatmikropartikler bibringer en hævelse virkning og klæbemidlet betydeligt forøget i masse (p <0,05) ved en mikropartikel koncentration på 25 mg / m og endnu mere ved 50 mg / ml. I denne hævelse studie, ændringer i våd masse af hydrogelen sandsynligvis tilskrives vandudveksling med omgivelserne, idet PNIPAAm-g-CS er blevet vist at være selektivt nedbrydelige i nærvær af enzymer 29. Mange af de protokoltrin udviklet til hævelse undersøgelsen blev tilpasset på grundlag af thermoreversibility af PNIPAAm-g-CS. Hydrogel diske skal fuldt ud overgang ved 37 ° C før tilsætning af forvarmet PBS løsning, ellers gelen vil sprede. Efter kvældning i en uge, skal PBS-opløsning hurtigt og forsigtigt fjernet fra hætteglassene før hydrogelerne vende tilbage til et væske-lignende tilstand. Det skal bemærkes, at den i dette papir hævelse protokollen ikke fuldt simulerein vivo miljø af den native IVD. Kvældningsegenskaber stilladset in vivo vil afhænge af det osmotiske tryk i det omgivende væv 41 og nedbrydning opførsel af gelen. Men generelt, er den øgede hævelse strøm med alginat mikropartikel inkorporering anses gunstigt, da det vil hjælpe den injicerbare hydrogel at bo rum-påfyldning ved fysiologisk temperatur. Egenskaber såsom hævelse forholdet og vandindhold kan beregnes med yderligere tørre masse målinger. Fremtidige hævelse undersøgelser vil omfatte nedsænke hydrogel diske mod en polyethylenglycol (MW = 20.000 g / mol) bad, som vil anvende et osmotisk tryk og efterligne in vivo-miljø i IVD.

Bortset fra de mekaniske og kvældningsegenskaber, skal klæbemidlet udviser cellulære biokompatibilitet for at blive betragtet som en egnet stillads. Tidligere undersøgelser har vist, at overlevelsen af ​​encapsulated celler i alginat 42,43 og PNIPAAm-baserede materialer 44,45. Resultater fra både de levende / Dead og XTT assays er i overensstemmelse med disse kendte fund tyder passende cellelevedygtighed over et tidsrum på 5 dage (figur 3 og 4). Vores laboratorium har også gennemført indledende undersøgelser af levedygtigheden over en længere tidsforløb (21 dage) og observerede lignende adfærd. Generelt bør et overskud på PNIPAAm-g-CS og mikropartikler være parat til at tage højde for ethvert materiale tab under pipette overførsler. Igen, det er yderst kritisk at bevare stillads arkitektur ved at opretholde passende temperaturer ved 37 ° C. Hvis stilladset netværket vender tilbage fra en gel til en væske-lignende tilstand, cellevedhæftning og levedygtighed kan blive kompromitteret. Med hensyn til Live / Dead assay, natriumcitrat spiller en vigtig rolle i fjernelsen og dekonstruktion af alginatmikropartikler. Natriumcitrat vender tværbindende handling mellem Calcium og alginat og forårsager en opslæmning til dannelse 46. Yderligere vask med PBS for at fjerne PNIPAAm-g-CS eller alginat kan udføres for at forbedre kvaliteten af ​​billederne. Under XTT-assayet, er polymere prøver indeholdende ingen celler oprettet inden for de brønds plader. Disse gentagelser tjener som tomme standarder og er forpligtet til at beregne en nøjagtig absorbans værdi. Vores indledende undersøgelser levedygtighed er strengt baseret på brug af HEK-293 celler. I fremtidige studier, vil differentieringen af ​​indkapslede adipøst afledte mesenkymale stamceller (AD-MSC) i nucleus pulposus-celler påvises. AD-MSC differentiering mod NP-lignende fænotype er blevet påvist ved hjælp af dynamisk kompression 47 og hypoxi 48,49.

Samlet set den foreslåede lim demonstrerer løfte til vævsteknologiske applikationer i bærende områder, såsom diskusprolaps, hvor succes regenerering strategi vil afhænge af stillads evne til resist dislokation under bevægelse og belastning. Dette system er meget alsidig, idet den potentielt kan være indrettet til at frigive extracellulære matrixproteiner eller vækstfaktorer er specifikke for den ønskede anvendelse. Vigtigt er det, kan fremgangsmåderne beskrevet her tilpasses enhver karakterisering studie med termogelerende polymerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takker bistand fra Dr. Jennifer Kadlowec i udviklingen af ​​klæbemidlet trækprøvning protokol.

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of Arthritis og bevægeapparatet og hudsygdomme og National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering af National Institutes of Health under Award nummer 1R15 AR 063.920-01. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized Acros Organics 2210-25-5 Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea) Sigma-Aldrich 39455-18-0 Refrigerate
Hexanes Fisher Scientific H302-4 Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide Fisher Scientific SS254-1 Caustic in nature
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 276685 Strong fumes; use in a fume hood
Acetone Fisher Scientific A18-4 Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas Praxair 7727-37-9 Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure Acros Organics 110-18-9
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678 Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets Fisher Scientific BP2944 Keep dry
Alginic acid, sodium salt Acros Organics 177775000 Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79
Canola oil Local store Obtain from a local store
Tween 20 Sigma-Aldrich 93773
70% (v/v) Isopropoanol Fisher Scientific A416-4
Porcine ears Haine's Pork Shop Obtain from a local butcher
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Human embryonic kidney 293 cells ATCC ATCC CRL-1573 Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate Life Technologies 11965126 Refrigerate
Fetal bovine serum Life Technologies 10082-147 Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml Life Technologies 15140-122 Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x Life Technologies 15400-054 Refrigerate
Methanol VWR AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit Life Technologies L3224 Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit Sigma Aldrich TOX2-1KT Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol Life Technologies 21063-029 Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x Life Technologies 14190136 Refrigerate
Sodium citrate EMD SX0445-1
Positive displacement pipette BrandTech Scientific, INC 2702904 Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle Sigma Aldrich S2896
Miltex sterile surgical blades Fisher Scientific 12-460-440 Size 10
Power gem homogenizer Fisher Scientific 08-451-660 Model # 125
Porcelain mortar and pestle Sigma Aldrich Z247464 Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system Labconco 7740020 Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump Edwards A65301906 Model # RV5
Incubating orbital shaker VWR 12620-946 Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge Forma Scientific, INC Model # 5682
Heated ovens VWR Model # 1235PC
2 N force gauge Shimpo FGV-0.5XY Model # FGV-0.5XY
E-force test stand Shimpo FGS-200PV Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge Beckman Coulter 366830 Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge Eppendorf Model #5415C
Hemacytometer set Hausser Scientific 3720 Requires replacement cover glass slips
Slide warmer Lab Scientific XH-2022 Model # XH-2002
Portable heating lamp Underwriters Laboratories Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope Zeiss Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath VWR Model # 1235PC
Rocking platform VWR Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader Thermo Scientific Type 357
Cell culture incubator VWR Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet Labconco Delta Series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bidarra, S. J., Barrias, C. C., Granja, P. L. Injectable alginate hydrogels for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomater. 10, 1646-1662 (2014).
  2. Choi, J., et al. Human extracellular matrix (ECM) powders for injectable cell delivery and adipose tissue engineering. J. Control. Release. 139, 2-7 (2009).
  3. Selvam, S., Pithapuram, M. V., Victor, S. P., Muthu, J. Injectable in situ. forming xylitol-PEG-based hydrogels for cell encapsulation and delivery. Colloid Surface B. 126, 35-43 (2015).
  4. Park, K. M., Lee, S. Y., Joung, Y. K., Na, J. S., Lee, M. C., Park, K. D. Thermosensitive chitosan-pluronic hydrogel as an injectable cell delivery carrier for cartilage regeneration. Acta Biomater. 5, 1956-1965 (2009).
  5. Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
  6. Chiu, Y. L., et al. pH-triggered injectable hydrogels prepared from aqueous N-palmitoyl chitosan: In vitro characteristics and in vivo biocompatibility. Biomaterials. 30, 4877-4888 (2009).
  7. Shim, W. S., et al. pH- and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel. Int. J. Pharm. 331, 11-18 (2007).
  8. Singh, N. K., Insitu Lee, D. S. gelling pH- and temperature-sensitive biodegradable block copolymer hydrogels for drug delivery. J. Control. Release. 193, 214-227 (2014).
  9. Wang, B., Zhu, W., Zhang, Y., Yang, Z., Ding, J. Synthesis of a chemically-crosslinked thermo-sensitive hydrogel film and in situ of model protein drugs. React. Funct. Polym. 66, 509-518 (2006).
  10. Zhu, W., Ding, J. Synthesis and characterization of a redox-initiated, injectable, biodegradable hydrogel. J. Appl. Polym. Sci. 99, 2375-2383 (2006).
  11. Zan, J., Chen, H., Jiang, G., Lin, Y., Ding, F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. J. Appl. Polym. Sci. 101, 1892-1898 (2006).
  12. Togawa, D., Bauer, T. W., Lieberman, I. H., Takikawa, S. Histologic evaluation of human vertebral bodies after vertebral augmentation with polymethyl methacrylate. Spine. 28, 1521-1527 (2003).
  13. Berman, A. T., Reid, J. S., Yanicko, D. R., Sih, G. C., Zimmerman, M. R. Thermally induced bone necrosis in rabbits: relation to implant failure in humans. Clin. Orthop. Relat. R. 186, 284-292 (1984).
  14. Kretlow, J. D., Klouda, L., Mikos, A. G. Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug. Deliver. Rev. 59, 263-273 (2007).
  15. Ye, F., Yaghmur, A., Jensen, H., Larsen, S. W., Larsen, C., Ostergaard, J. Real-time UV imaging of drug diffusion and release from Pluronic F127 hydrogels. Eur. J. Pharm. Sci. 43, 236-243 (2011).
  16. Akash, M. S., Rehman, K. Recent progress in biomedical applications of pluronic (PF127): Pharmaceutical perspectives. J. Control Release. 209, 120-138 (2015).
  17. Sellers, D. L., Kim, T. H., Mount, C. W., Pun, S. H., Horner, P. J. Poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres encapsulated in Pluronic F-127 prolong hirudin delivery and improve functional recovery from a demyelination lesion. Biomaterials. 35, 8895-8902 (2014).
  18. Jung, H., Park, K., Han, D. K. Preparation of TGF-β1-conjugated biodegradable pluronic F127 hydrogel and its application with adipose-derived stem cells. J. Control. Release. 147, 84-91 (2010).
  19. Lee, S. Y., Tae, G. Formulation and in vitro of an in situ photo-polymerizable pluronic hydrogel suitable for injection. J. Control. Release. 119, 313-319 (2007).
  20. Chen, Y. Y., Wu, H. C., Sun, J. S., Dong, G. C., Wang, T. W. Injectable and thermoresponsive self-assembled nanocomposite hydrogel for long-term anticancer drug delivery. Langmuir. 19, 3721-3729 (2013).
  21. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Materials for cell encapsulation via a new tandem approach combining reverse thermal gelation and covalent crosslinking. Macromol. Chem. Physic. 203, 1466-1472 (2002).
  22. Cellesi, F., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Towards a fully-synthetic substitute of alginate: development of a new process using thermal gelation and chemical cross-linking. Biomaterials. 25, 5115-5124 (2004).
  23. Hirokawa, Y., Tanaka, T. Volume phase transition in a nonionic gel. J. Chem. Phys. 81, 6379-6380 (1984).
  24. Freitas, R., Cussler, E. L. Temperature sensitive gels as extraction solvents. Chem. Eng. Sci. 42, 97-103 (1987).
  25. Schild, H., Tirrel, D. A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J. Chem. Phys. 94, 4352-4356 (1990).
  26. Yagi, Y., Inomata, H., Saito, S. Solubility parameter of an N-isopropylacrylamide gel. Macromol. 25, 2997-2998 (1992).
  27. Illmain, F., Tanaka, T., Kokufuta, E. Volume transition in a gel driven by hydrogen bonding. Nature. 349, 400-401 (1990).
  28. Vernengo, J., Fussell, G. W., Smith, N. G., Lowman, A. M. Evaluation of novel injectable hydrogels for nucleus pulposus replacement. J. Biomed. Mater. Res. B. 84, 64-69 (2008).
  29. Wiltsey, C., et al. Characterization of injectable hydrogels based on poly(N-isopropylacrylamide)-g-chondroitin sulfate with adhesive properties for nucleus pulposus tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 24, 837-847 (2013).
  30. Ronca, F., Palmieri, L., Panicucci, P., Ronca, G. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthr. Cart. 6, 14-21 (1998).
  31. Pipitone, V. Chondroprotection with chondroitin sulfate. Drug. Exp. Clin. Res. 17, 3-7 (1991).
  32. Moss, M., Kruger, G. O., Reynolds, D. C. The effect of chondroitin sulfate on bone healing. Oral Surg. Oral Med. O. 20, 795-801 (1965).
  33. Nerurkar, N., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria fo intervertebral disc tissue engineering. J. Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
  34. Wiltsey, C., et al. Thermogelling bioadhesive scaffolds for intervertebral disk tissue engineering: Preliminary in vitro of aldehyde-based versus alginate microparticle-mediated adhesion. Acta Biomater. 16, 71-80 (2015).
  35. Xia, Y., Yin, X., Burke, N., Stover, H. Thermal response of narrow-disperse poly(N-isopropylacrylamide) prepared by atom transfer radical polymerization. Macromol. 38, 5937-5943 (2005).
  36. Liu, Q., Zhang, P., Qing, A., Lan, Y., Lu, M. Poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with improved shrinking kinetics by RAFT polymerization. Polymer. 47, 2330-2336 (2006).
  37. Lemoine, D., Wauters, F., Bouchend'homme, S., Preat, V. Preparation and characterization of alginate microspheres containing a model antigen. Int. J. Pharm. 176, 9-19 (1998).
  38. Dang, T. D., Joo, S. W. Preparation of tadpole-shaped calcium alginate microparticles with sphericity control. Colloid. Surface. B. 102, 766-771 (2013).
  39. Moebus, K., Siepmann, J., Bodmeier, R. Novel preparation techniques for alginate-polaxamer microparticles controlling protein release on mucosal surfaces. Eur. J. Pharm. Sci. 45, 358-366 (2012).
  40. Lih, E., Lee, J. S., Park, K. M., Park,, D, K. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue adhesives for hemostasis and wound healing. Acta Biomater. 8, 3261-3269 (2012).
  41. Urban, J., Maroudas, A. Swelling of the intervertebral disc in vitro. Connect. Tissue Res. 9, 1-10 (1981).
  42. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64, 273-281 (2003).
  43. Leslie, S. K., et al. Controlled release of rat adipose-derived stem cells from alginate microbeads. Biomaterials. 34, 8172-8184 (2013).
  44. Peroglio, M., Eglin, D., Benneker, L. M., Alini, M., Grad, S. Thermoreversible hyaluronan-based hydrogel supports in vitro. and ex vivo. disc-like differentiation of human mesenchymal stem cells. Spine J. 13, 1627-1639 (2013).
  45. Chen, J. P., Cheng, T. H. Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells. Macromol. Biosci. 6, 1026-1039 (2006).
  46. Schoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: an in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol. Bioeng. 50, 374-381 (1996).
  47. Dai, J., Wang, H., Liu, G., Xu, Z., Li, F., Fang, H. Dynamic compression and co-culture with nucleus pulposus cells promotes proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. J. Biomech. 47, 966-972 (2014).
  48. Feng, G., et al. Effects of hypoxias and scaffold architecture on rabbit mesenchymal stem cell differentiation towards a nucleus pulposus-like phenotype. Biomaterials. 32, 8182-8189 (2011).
  49. Feng, G., et al. Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarth. Cartilage. 21, 582-588 (2013).

Tags

Bioengineering hydrogel bioadhæsiv tissue engineering biomedicinsk teknik stillads termogelerende injicerbar
Syntese af termogelerende Poly (N-isopropylacrylamid) X-graft-chondroitinsulfat Composites med alginatmikropartikler for Tissue Engineering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christiani, T. R., Toomer, K.,… More

Christiani, T. R., Toomer, K., Sheehan, J., Nitzl, A., Branda, A., England, E., Graney, P., Iftode, C., Vernengo, A. J. Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (116), e53704, doi:10.3791/53704 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter