Summary
I den här artikeln beskriver vi en anpassad relativt enkel metod med hjälp av fluorescens färgämne diaminofluorescein-2-acetat (DAF-2DA) och dihydroethidium (DHE) för en face samtidig detektion och visualisering av intracellulär kväveoxid (NO) och superoxidanjon (O2 .- ) respektive i nyisolerade intakta aorta av en fetma musmodell.
Abstract
Endotelhärledd kväveoxid (NO) producerad från endotelial NO-syntas (eNOS) är en av de viktigaste vasoprotective molekyler i kardiovaskulär fysiologi. Dysfunktionell eNOS såsom frikoppling av eNOS leder till en minskning i NO biotillgänglighet och ökad superoxidanjon (O2 .-) produktion, och i sin tur främjar hjärt- och kärlsjukdomar. Därför bör mätning av NO och O 2 .- nivåer i endotelceller är avgörande för forskning om hjärt- och kärlsjukdomar och komplikationer. På grund av den extremt labila naturen av NO och O 2 .-, är det svårt att mäta NO och O 2 .- direkt i ett blodkärl. Ett stort antal metoder har utvecklats för att mäta NO och O 2 .- produktion. Det är dock antingen okänslig eller ospecifik, eller tekniskt krävande och kräver speciell utrustning. Här beskriver vi en anpassningav fluorescensfärgämnesmetoden för en face samtidig detektion och visualisering av intracellulär NO och O 2 .- använda cellpermeabla diaminofluorescein-2 diacetat (DAF-2DA) och dihydroethidium (DHE), respektive, i intakta aortas av en fetma musmodell inducerade av fettrik-kost utfodring. Vi kunde visa minskad intracellulär NO och förbättrad O 2 .- nivåer i nyisolerade intakta artärer av fetma mus jämfört med kontroll mager musen. Vi visar att denna metod är en enkel teknik för direkt detektering och visualisering av NO och O 2 .- i de intakta blodkärlen och kan tillämpas i stor utsträckning för undersökning av endotelial (dys) funktion under (fysio) patologiska tillstånd.
Introduction
De vaskulära endotelcellerna hålla vaskulär funktionell och strukturell integritet genom att släppa vasoaktiva faktorer 1. Bland dessa faktorer är endotelhärledd kväveoxid (NO) produceras från L-arginin via endotel NO-syntas (eNOS) den viktigaste och bäst karakteriseras faktor i kardiovaskulär fysiologi 2. NO orsakar glatt muskulatur och hämmar celltillväxt, hämmar trombocytaggregationen och inflammatorisk celladhesion och infiltration i subendoteliala utrymme, därför skydda mot utveckling kärlsjukdom 3. Under många fysiologiska och patologiska tillstånd, inklusive åldrande, högt blodtryck, diabetes, hyperlipidemi, etc., endoteldysfunktion kännetecknas av minskade NO biotillgänglighet och ökad O2 .- produktion är närvarande och främjar patogenes av ateroskleros 2. Studier från de senaste åren visar att frikoppling av eNOS är enviktig mekanism för endoteldysfunktion, där eNOS enzymet genererar O 2 .- stället för NO, i enlighet med de olika ovannämnda villkor 1,4. Därför analys av endotelfunktion, särskilt endotel NO-produktion och O 2 .- generation är avgörande för experimentell forskning om hjärt- och kärlsjukdomar och komplikationer.
Det finns många metodologiska ansatser som har utvecklats för att analysera och mäta NO-produktion i biologiska prover. På grund av den extremt labila naturen av NO, som lätt oxideras till NO2 - och NO 3 - med en halveringstid på 3 till 6 sek, är det svårt att mäta NO direkt. Därför bestämning av NO 2 - / NO 3 - i vätskeprover användes som ett index på NO frisätts från celler eller vävnader 5. Även om förfarandet är relativt enkelt, vilket förfarande är emellertid easily påverkas av hög bakgrund av den stabila NO 2 - / NO 3 - som finns i lösningen. Eftersom NO stimulerar lösligt guanylatcyklas att producera cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP) 6, har den cellulära cGMP-nivå även bestämts för att uppskatta NO-frisättning 7. Återigen, detta en indirekt uppskattning och får inte vara specifik, eftersom vissa endotelhärledd faktorer såsom C-typ natriuretisk peptid (CNP) också skulle kunna öka cGMP-nivåer genom aktivering av partikelformigt guanylatcyklas 8. NO bildas från L-arginin med genereringen av L-citrullin som en biprodukt 9, mätning av L-citrullin produktion används därför också som en indirekt metod för att uppskatta NO-produktion. De största nackdelarna med denna metod är att det är radioaktivt och det mäter inte bioaktiva NO-nivåer, sedan dess släppt NO kan snabbt inaktiveras genom O 2 .-; Dessutom kan L-citrullin återvinnas till L-arginin 10. Andra kemiska metoder såsom kemiluminescens upptäckt 11, elektronspinnresonans 12 eller elektro porfyrinförening NO sensorn 13 används av flera forskare. Dessa metoder är oftast inte lätt i drift, detekteringsförfaranden och kräver specialutrustning. Det är också att nämna att många studier gäller organbad experiment med isolerade blodkärl med eller utan endotel att bedöma endotelfunktion och indirekt mäta endotelhärledd NO medierad kärlrelaxationer. Men denna metod, även om det oftast är nära fysiologisk situation, men absolut säga, inte mäta NO funktion, bedömer det ganska endotel-medierad vasomotoriska svar i allmänhet återspeglar nettoeffekterna av eNOS-funktion, produktion av andra endotelhärledd avkopplande faktorer och endotelhärledd avtalsfaktorer, produktion av O 2 .-, och även svaren av glatta muskelcellertill dessa faktorer. En särskild analys av eNOS-funktion eller NO-produktion är vanligtvis krävs 3.
Många forskargrupper inklusive vårt har under de senaste åren använt fluorescens färgämne metod för att detektera intracellulär produktion av NO 14-19. I denna metod cellpermeabla flouresceinsindikator diaminofluorescein-2-acetat (DAF-2DA) användes för att mäta fri NO och NOS funktion i levande celler och vävnader in vitro eller ex vivo. Principen är att i levande celler, DAF-2DA deacetyleras genom intracellulär esteras till icke-fluorescerande 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) som sedan omvandlades till fluorescerande DAF-2 triazol (DAF-2T) genom att reagera med NO . Fluorescensen från DAF-2T kan observeras under ett fluorescensmikroskop eller en fluorescens konfokalmikroskop 14. Den intracellulära fluorescensintensiteten återspeglar därför den intracellulära NO-produktion i cellerna eller endotel en i intakt blod Vessel. I kombination med en specifik fluorescens färgämne såsom dihydroethidium (DHE), kan man samtidigt bedöma intracellulära NO och O 2 .- generation i cellerna eller i blodkärlen 14. På samma sätt är DHE också ett cell permeabel förening som oxideras av O2 .- inuti cellerna, och den oxidativa produkten sedan interkalerar med nukleinsyror att avge en klarröd färg detekterbar kvantitativt genom fluorescerande mikroskop eller fluorescens konfokalmikroskop. DHE är en mycket specifik färg för detektering av O2 .- från biologiska prover, eftersom den upptäcker huvudsak superoxidradikaler, bibehålls väl av celler, och kan även tolerera mild fixering 20. En av fördelarna med denna fluorescens färgämne metod är att den detekterar och visualiserar NO och / eller O 2 .- en face direkt på det intakta endotelskiktet hos en levande blodkärl.
I det här pappret,vi beskriva denna fluorescens färgämne metod för att upptäcka NO och O 2 .- som vi har anpassat för en ansiktsdetektering av NO och O 2 .- i intakta aorta av en fetma musmodell induceras av fettrik-diet (HFD) utfodring. Vi visar att denna metod framgångsrikt och tillförlitligt kan mäta NO och O 2 .- nivåer och utvärdera eNOS (dys) funktion i endotelskiktet av nyisolerade intakta mus artärer i fetma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur arbete godkändes av den etiska kommittén för veterinärfrågor i Fribourg, Schweiz. Protokollet följer riktlinjerna för djuromsorg och experiment på vår institution.
1. Framställning av en Set-up för inkubation av isolerade artärer
- Konstruera ett organbad system som kan värmas till 37 ° C och luftades med 95% O2 och 5% CO2 från ett kol gastank.
- Förbereda så mycket Krebs-Ringer bikarbonat-buffert efter behov med koncentrationen av följande sammansättning: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCOs 3, 0,026 mM EDTA och 11,1 mM D-glukos).
- Hålla beståndet buffert på is och lufta bufferten med 95% O2 och 5% CO2.
- Slå på organbadet systemet, ställa in temperaturen vid 37 ° C, tillsätt 5 ml av den färdiga att använda buffert till varje kammareoch hålla luftning bufferten med 95% O2 och 5% CO2.
- Tvätta kamrarna en gång med Krebs-Ringer-buffert under 30 min.
- Tillsätt 5 ml Krebs-Ringer-buffert till varje kammare och täcka kammaren för att undvika avdunstning.
2. Isolering av mus artärer
- Injicera pentobarbital som löses i 0,9% NaCl intraperitonealt vid koncentrationen av 150 mg / kg att offra mössen.
- Låg musen supinely på en kirurgisk ombord.
- Spraya pälsen på bröstet regionen med 70% etanol i syfte att sanering och fukt.
- Öppna brösthålan genom att skära runt ribban för att exponera hjärtat och lungorna, och ta bort lungorna.
- Ta bort blodet i brösthålan försiktigt med en pappersnäsduk.
- Ta tag i hjärtat försiktigt med en pincett och ta bort bröst aorta genom att skära perivaskulära fettvävnad mellan aorta och ryggraden med kirurgisk sax.
- Omedelbart doppa groe vävnader i iskall (4 ° C) Krebs-Ringer-buffert.
- Ta bort hjärtat och aortabågen under ett dissektionsmikroskop och hålla bröstaortasegmentet i bufferten.
- Dissekera aorta fri från vidhäftande perivaskulär vävnad under ett mikroskop med kirurgiska sax och pincett.
- Tag i ändkanten av aorta med en pincett och spola bort blod i kärllumen genom att försiktigt spola Krebs-Ringer-buffert med en 26 G x 1/2 '' spruta.
- Skär de rengjorda aortaringar i 3 mm långa segment.
Notera: Var uppmärksam på detta steg för att inte skada endotelskiktet.
3. DHE och DAF-2DA färgning
- Överföra de rengjorda aortasegmenten med en pincett till organbadet kamrarna fyllda med Krebs-Ringer-buffert vid 37 ° C luftad med 95% O2 och 5% CO2.
Obs: Tryck bara den adventitiala sidan av aortaringar med pincett och inte klämma bdärvarande fartyg. - Jämvikta artärerna i organbadet kammaren under 30 min.
- Lägg acetylkolin (ACh) till organbadet för att den slutliga koncentrationen 1 pM, och inkubera artärerna under 10 min.
- Förbereda 1 ml av DHE / DAF-2DA-lösning (5 ^ M av varje färgämne, späddes från 1000 x stock) med förvärmda Krebs-Ringer-buffert i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Linda mikrocentrifugrör med aluminiumfolie för att undvika ljusexponering.
- Efter stimulering, för över aortaringar från organbadet till DHE / DAF-2DA lösning i ett mikrocentrifugrör vid 37 ° C luftad med 95% O2 och 5% CO2 och inkubera aortaringar under 30 minuter.
Obs: Från detta steg, hålla aorta alltid i mörker. - Överför aortaringar till ett nytt mikrocentrifugrör med Krebs-Ringer-buffert för att tvätta och tvätta tre gånger inom en minut.
- Överför aortaringar till 4% paraformaldehydlösning för fixering under 30min.
- Förbereda en ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) lösning (300 nM, utspäddes från 1000 x stock) med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Motfärg aorta under 3 min.
- Överföra aorta till nya mikrocentrifugrör med PBS-buffert för tvättning under 1 min. Upprepa tvätt tre gånger.
Notera: Var uppmärksam inte att klämma aortaringar eller skada endotelskiktet.
4. En Face Montering
- Tillsätt en droppe monteringsmedium vid sliden.
- Skär aortaringar i längdriktningen med mikro sax under mikroskop, gör hoprullade artärer platt och montera den en face på monteringsmedium med endotel nedåt på glasskivan. Flytta inte artärer och tillbaka.
- Täck bilden med täckglas och försegla bilden med nagellack.
- Efter lufttorkning under lätt skydd, använder bilderna för avbildning directly inom timmar eller förvara dem vid -20 ° C under närmaste dagarna.
5. Confocal Mikroskopisk Imaging
- Använda ett konfokalt mikroskop för att detektera fluorescenssignaler. Slå på maskinen och optimera bildinställningar såsom förstoring, scanningshastighet, upplösning, Z-stack.
- För detta protokoll använder en 200 Hz scanningshastighet, upplösning av 1024 × 1024 pixlar och Z-stegstorlek på 0,25 um. Excite fluorescens från DAF-2DA med 488 nm argonlaser och upptäcka vid 515 nm, medan excitera fluorescens från DHE vid 514 nm och upptäcka vid 605 nm emission.
- Använd 10X förstoringar att fokusera på provet tills DAPI signalen är tydlig med ultravioletta strålar, och sedan justera målet att 40X förstoringar.
- Definiera området av endotelskiktet genom att justera Z-position på kontrollpanelen. De signaler av DAPI-färgade kärnor är ovala eller runda prickar i endotelskiktet.
- Skanna från toppen(Endotelskikt på lumen gränsen) av provet genom hela tjockleken av endotelceller signal- och spela in bilder. Välj åtminstone 3 olika fält för att skanna varje prov.
6. Analys av bilder
- Använd programvara för att öppna data skannas av konfokalmikroskop. Välj tre på varandra följande bilder per fält för analys och utvärdering av åtminstone 3 olika fält per prov. Exportera valda bilder och spara dem som JPEG-filer.
- Kvantifiera bilderna från DAF-2DA, DHE och DAPI färgning med bildbehandlingsprogram. För bilden från DAPI färgning, välj "Plugins" → "Analysera" → "Cell Counter" för att räkna antalet DAPI positiva kärnan.
- För bilder från DAF-2DA och DHE färgning, välj "Analyze" → "Mät" att analysera intensiteten hos signalerna, och ta "Mean" värde som den relativa signalstyrkan. Presentera sedan resultaten som förhållandet mellan DAF-2DA tillDAPI positiva kärnor eller förhållandet mellan DHE till DAPI. För varje prov, ta medelvärdet för varje bild och fält.
- Dividera resultatet av varje prov med medeltalet för kontrollgruppen för att få den faldig förändring. Statistisk analys utfördes med oparat Student t-test eller ANOVA med Dunnetts eller Bonferroni post-test. Ge data som medelvärde ± SEM. Överväga skillnader i medelvärden som signifikant vid p <0,05 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fetma är en viktig riskfaktor för ischemisk kranskärlssjukdom och är förknippad med minskad endotel NO biotillgänglighet, ett kännetecken för aterosklerotisk kärlsjukdom 21. eNOS-koppling har visat sig vara en viktig mekanism för endoteldysfunktion i många fysiologiska och patologiska tillstånd innefattande åldrande 22, åderförkalkning och fetma 14. Därför Jämför vi de magra och feta möss för att visa representativt resultat av NO och O 2 .- nivåer i aorta.
Börjar vid en ålder av 7 veckor, var hanmöss (C57BL / 6J) fick fri tillgång under 14 veckor till antingen en normal chow (NC, energiinnehållet: 10,6% fett, 27,6% protein, och 57% kolhydrater, fiber 4,8% ) eller en diet med hög fetthalt (HFD, energiinnehåll: 55% fett, 21% protein och 24% kolhydrater). Efter 14 veckors HFD mössoffras och bröstkorg aorta dissekerades och rengöras från vidhäftande vävnad. Före DAF-2DA och DHE färgning steg bör de eNOS inhibitor LN -nitroarginin metylester (L-NAME) (1 mM) tillsattes till badet kammaren under 1 timme för att blockera eNOS-aktivitet 14. De representativa konfokal fluorescens Resultaten visas i Figur 1. Den blå färgen i den övre panelen representerar kärnan av endotelceller färgade med DAPI. I mitten panelen, är den gröna färgen fluorescenssignalen från DAF-2T omvandlas från icke-fluorescerande DAF-2 genom NO, vilket innebär att om intensiteten av grön signal är högre, det finns fler NO i cellerna. På samma sätt, den röda färgen i den undre panelen är fluorescenssignalen från DHE oxideras av O2 .-, så provet visar mer röd färg har mer O2 .- i cellerna.
Konfokal fluorescensmikroskopi avslöjade minskningd NO-produktion (DAF-2DA färgning) och ökad L-NAME känsliga O 2 .- generationen (DHE färgning) i aorta endotelskiktet av mössen matades HFD i jämförelse med den hos möss som matats NC (Figur 1) 14, vilket tyder på eNOS-koppling i fetma. Signalerna kvantifieras och presenteras i stapeldiagram 14.
Figur 1. eNOS-koppling i fetma. Confocal mikroskopisk en ansiktsdetektering av NO och O 2 .- av DAF-2DA och DHE färgning, respektive. n = 5; *** p <0,005 vs NC, ††† p <0,005 vs HFD grupp. Skalstreck = 0,1 mm. (Data var från 14 referens) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detektering av NO eller O 2 .- med fluorescerande färgämnen användes ofta i många studier i odlade endotelceller och även i vävnads kryosnitt 23. Här vi utökat denna metod för att intakt levande blodkärl, det vill säga, en ansiktsdetektering av NO och O 2 .- nivåer i endotelskiktet med DAF-2DA och DHE, respektive, som är effektiv, relativt enkel och intuitiv. I jämförelse med metoden i vaskulära kryosnitt, visar denna metod lägre bakgrund och är mer kvantitativ, eftersom elastiska fibrerna i medierna av en artär särskilt aorta i kryosnitt ger mycket starka autofluorescens signaler som skulle kunna störa den specifika NO eller O2. - signaler som genereras i endotelceller. Dessutom skulle specifika O 2 .- generering genom NADPH-oxidas eller andra enzymer i de mediala glatta muskelceller också störamed signalerna i endotelceller i kärlsektionen, som representerar nackdel med metoden med vaskulära kryosnitt. Däremot upptäcker en face färgningsmetoden signaler specifikt från endotelskiktet av en intakt blodkärl segmentet och ger därför mer exakt analys. Kryostat maskin för kryosektion beredning är också en dyr investering. Jämfört med andra biokemiska metoder, är den främsta begränsningen av denna metod mindre kvantitativa, men det är ett bra val för relativ jämförelse mellan prover. Vidare kan kravet på ett konfokalt mikroskop som är dyrt också vara en begränsning av denna metod. Multiorgankammarsystem är bekvämt och om detta inte är tillgänglig i labbet, kan ett enkelt upprätta ett system med vattenbad och slangar som är anslutna till en kol gastank med reglerande system, så att blodkärlen i rören är hölls vid 37 ° C och luftades med 95% O2 och 5% CO Det finns flera viktiga steg som man måste uppmärksamma. Vara säker på att perivaskulära vävnaden städas för enkel montering. De blodproppar i kärl lumen måste spolas bort, eftersom de kan orsaka artificiella signaler och störa fluorescenssignaler. Under hela förfarandet för framställning blodkärl, inkubation, tvättning, skärning och montering, måste man vara ytterst försiktig med att inte skada endotelskiktet i blodkärlen. Låt inte blodkärls torr under hela förfarandet för framställning. DHE och DAF-2DA båda fluorescerande prober, så från och med färgningssteget artärer bör alltid skyddas från ljusexponering. Innan fixeringssteget endotelcellerna av aorta skall vara levande, så aorta bör alltid hållas i Krebs-Ringer-buffert luftad med 95% O2 och 5% CO2. Bilder av proven bör tas så snart som möjligt efter beredning. den fluorescerarNCE signal blir svagare i några dagar även med skydd av monteringsmedium, som kan påverka noggrannheten av resultaten. Metoden kan inte ansöka om blodkärl med alltför tjock kärlväggen. Denna metod möjliggör samtidig fantasi av NO och O 2 .- produktion i endotelskiktet av intakta blodkärl, om de två färgämnena tillsattes till blodkärlen tillsammans. Man kan också använda denna metod för att utvärdera farmakologiska effekter av läkemedel på NO och O 2 .- produktion in vitro i isolerade blodkärl. För detta ändamål är den rengjorda aorta vanligtvis skuren i två delar, en är för styrning och en annan är för läkemedelsbehandling och läkemedlet bör läggas till inkubationsbufferten efter jämvikts före DAF-2DA och DHE färgning steg. Det är särskilt användbart, om denna metod används tillsammans med en annan metod, t ex med analys av vasomotoriska svar isolerade blod vessels kan en fysiologisk funktion av endotelceller bekräftas. Denna metod ska också vara lämplig för analys av någon endotel (dys) funktion i intakta blodkärl sjukdomsmodeller och de underliggande mekanismerna. Sammanfattningsvis, presenterade vi ett enkelt protokoll för att samtidigt upptäcka NO och O 2 .- produktion i endotelskikt intakta blodkärl med fluorescens konfokalmikroskop. Vi visar hur denna metod framgångsrikt arbetat i fetma musmodell. Denna metod är en användbar teknik i utredningen av endotel NO och O 2 .- produktion under många vaskulära sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) | Sigma-aldrich | N5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health (NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| Coverslip round diameter 15 mm | VWR | 631-1579 | |
| Tips 1 ml | VWR | RFL-1200c | |
| Tips 200 μl | VWR | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
References
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
- Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
- Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
- Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
- Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
- Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
- Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
- Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
- Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
- Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
- Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
- Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
- Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
- Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
- Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
- Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
- Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
- Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
- Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
- Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).
