Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En Face Detection af nitrogenoxid og Superoxide i Endotel Layer af intakte arterier

Published: February 25, 2016 doi: 10.3791/53718
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2
1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

Summary

I denne artikel beskriver vi en tilpasset relativt let metode under anvendelse af fluorescens farvestof diaminofluorescein-2 diacetat (DAF-2DA) og dihydroethidium (DHE) for en face samtidig detektion og visualisering af intracellulær nitrogenoxid (NO) og superoxid anion (O 2 .- ) henholdsvis i frisk isoleret intakte aorta hos en fedme musemodel.

Abstract

Endotelafledt nitrogenoxid (NO) er fremstillet af endotel NO-syntase (eNOS) er en af ​​de vigtigste vasoprotective molekyler i kardiovaskulær fysiologi. Dysfunktionel eNOS såsom frakobling af eNOS fører til fald i NO biotilgængelighed og øgede superoxid anion (O 2 .-) produktion, og fremmer i sig hjertekarsygdomme. Derfor passende måling af NO og O 2 .- niveauer i endotelceller er afgørende for forskning i hjerte-kar-sygdomme og komplikationer. På grund af den ekstremt labile karakter af NO og O2 .-, er det vanskeligt at måle NO og O 2 .- direkte i et blodkar. Talrige fremgangsmåder er blevet udviklet til at måle NO og O2 .- produktion. Det er dog enten ufølsom, eller ikke-specifik eller teknisk krævende og kræver specialudstyr. Her beskriver vi en tilpasningaf fluorescensen farvestof fremgangsmåde til en face samtidig detektion og visualisering af intracellulær NO og O 2 .- hjælp cellen permeable diaminofluorescein-2 diacetat (DAF-2DA) og dihydroethidium (DHE), henholdsvis i intakte aorta hos en fedme musemodel inducerede af højt fedtindhold-kost fodring. Vi kunne påvise formindsket intracellulær NO og forbedret O 2 .- niveauer i frisk isolerede intakte aorta hos fedme mus sammenlignet med kontrollen lean mus. Vi viser, at denne metode er en nem teknik til direkte påvisning og visualisering af NO og O 2 .- i de intakte blodkar og kan i vid udstrækning anvendes til undersøgelse af endotel (dys) funktion under (fysio) patologiske tilstande.

Introduction

De vaskulære endotelceller holde vaskulær funktionelle og strukturelle integritet ved at frigive vasoaktive faktorer 1. Blandt disse faktorer, endotelafledt nitrogenoxid (NO) produceret ud fra L-arginin via endotel NO-syntase (eNOS) er den vigtigste og bedst karakteriseres faktor i kardiovaskulær fysiologi 2. NO forårsager afslapning af glat muskulatur og hæmmer celleproliferation, inhiberer blodpladeaggregering og inflammatorisk celleadhæsion og infiltration i subendotelrummet derfor beskytte mod vaskulær sygdom udvikling 3. Under mange fysiologiske og patologiske tilstande, herunder ældning, hypertension, diabetes, hyperlipidæmi, etc., endothelial dysfunktion karakteriseret ved nedsat NO biotilgængelighed og forøget O 2 .- produktion er til stede og fremmer patogenese af atherosklerose 2. Undersøgelser fra de senere år viser, at afkobling af eNOS er envigtig mekanisme til endotel dysfunktion, hvori eNOS enzym genererer O 2 .- stedet for NO, under de forskellige ovenfor nævnte betingelser 1,4. Derfor analyse af endothelfunktion navnlig endotel NO-produktion og O 2 .- generation er afgørende for eksperimentel forskning på kardiovaskulære sygdomme og komplikationer.

Der er talrige metodiske tilgange, der er udviklet til at analysere og måle NO-produktion i biologiske prøver. På grund af den ekstremt labile karakter af NO, som let oxideres til NO 2 - og NO 3 - med en halveringstid på 3 til 6 sek, er det vanskeligt at måle NO direkte. Derfor bestemmelse af NO 2 - / NO 3 - i væskeprøver blev anvendt som et indeks for NO frigivet fra celler eller væv 5. Selv om proceduren er forholdsvis let, er fremgangsmåden imidlertid easily påvirket af høj baggrund af det stabile NO 2 - / NO 3 - indeholdt i opløsningen. Fordi NO stimulerer opløselig guanylatcyclase at producere cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP) 6, har det cellulære cGMP niveau også blevet bestemt til at estimere NO release 7. Igen, dette er en indirekte vurdering og er ikke specifik, da nogle endotelafledte faktorer, såsom C-type natriuretisk peptid (CNP) kunne også forbedre cGMP-niveauer gennem aktivering af partikelformet guanylatcyclase 8. NO produceres ud fra L-arginin med generering af L-citrullin som et biprodukt 9, måling af L-citrullin produktion derfor også anvendes som en indirekte metode til at estimere NO-produktion. De største ulemper ved denne metode er, at det er radioaktivt og det ikke måle bioaktive NO-niveauer, da frigivet NO kunne inaktiveres hurtigt ved O 2 .-; Desuden kan L-citrullin recirkuleres til L-arginin 10. Andre kemiske metoder såsom kemiluminescensdetektion 11, elektron spin resonans 12, eller elektrokemisk porphyrinisk NO sensor 13 anvendes af flere forskere. Disse metoder er normalt ikke let i drift, afsløre procedurer og kræver specialudstyr. Det er også at nævne, at mange undersøgelser anvender organbad eksperimenter med isolerede blodkar med eller uden endotel at vurdere endotelfunktion og indirekte måle endotelafledt NO medieret vaskulære lempelserne. Men denne metode, selv om det er mest tæt på fysiologisk situation, men strengt at sige, ikke måler NO funktion, det snarere vurderer endotel-medieret vasomotoriske reaktioner i almindelighed, der afspejler nettoeffekten af ​​eNOS funktion, produktion af andre endotelafledt afslappende faktorer og endotelafledt ordregivende faktorer, produktion af O 2 .-, og også svarene fra glatte muskelcellertil disse faktorer. En specifik analyse af eNOS funktion eller NO produktion kræves normalt tre.

Mange forskningsgrupper herunder vores har i de seneste år brugt fluorescensen farvestof metode til at påvise intracellulær produktion af NO 14-19. I denne fremgangsmåde cellen permeable fluorescensindikator diaminofluorescein-2 diacetat (DAF-2DA) blev anvendt til måling af frit NO og NOS-funktion i levende celler og væv in vitro eller ex vivo. Princippet er, at i de levende celler, DAF-2DA deacetyleres af intracellulær esterase til ikke-fluorescerende 4,5-diaminofluorescein (DAF-2), som derefter blev omdannet til fluorescerende DAF-2 triazol (DAF-2T) ved reaktion med NO . Fluorescensen fra DAF-2T kan observeres under et fluorescensmikroskop eller et fluorescens konfokalt mikroskop 14. Den intracellulære fluorescensintensitet afspejler derfor den intracellulære NO-produktion i cellerne eller endotelet i en i intakt blod vessel. Kombineret med en specifik fluorescens farvestof såsom dihydroethidium (DHE), kan man samtidig vurdere intracellulær NO og O 2 .- generation i cellerne eller i blodkar 14. Tilsvarende DHE er også en celle-permeabel forbindelse, oxideres af O 2 .- inde i cellerne, og den oxidative produkt derefter interkalerer med nukleinsyrer til at udsende en klar rød farve påviseligt kvantitativt ved fluorescensmikroskop eller fluorescens konfokal mikroskop. DHE er en meget specifik farve til påvisning af O 2 .- fra biologiske prøver, da den opdager væsentlige superoxidradikaler, tilbageholdes godt af celler, og kan endda tåle mild fiksering 20. En af fordelene ved denne fluorescens farvestof metode er, at den registrerer og visualiserer NO og / eller O 2 .- en face direkte på intakt endotel lag af en levende blodkar.

I dette papir,vi beskrive denne fluorescens farvestof metode til at påvise NO og O 2 .- som vi har tilpasset til en face påvisning af NO og O 2 .- i intakte aorta hos en fedme musemodel fremkaldt af fedtrig-kost (HFD) fodring. Vi viser, at denne metode med succes og pålideligt kunne måle NO og O 2 .- niveauer og vurdere eNOS (dys) funktionen i endotel lag af frisk isolerede intakte mus aorta i fedme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal arbejde blev godkendt af Etisk Komité Veterinærkontor Fribourg, Schweiz. Protokollen følger retningslinjerne for Dyrepleje og eksperimenter på vores institution.

1. Udarbejdelse af en Set-up for Inkubation af Isoleret arterier

  1. Konstruere et organbad, som kan opvarmes til 37 ° C og beluftet med 95% O2 og 5% CO2 fra et carbon gas tank.
  2. Tilberede den mængde Krebs-Ringer bicarbonatpuffer efter behov med koncentrationen af følgende sammensætning: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCI, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO3, 0,026 mM EDTA og 11,1 mM D-glucose).
  3. Hold stampuffer på is og lufte buffer med 95% O2 og 5% CO2.
  4. Tænd for orgel bad systemet, indstille temperaturen ved 37 ° C, tilsættes 5 ml klar til brug buffer til hvert kammerog holde beluftning af buffer med 95% O2 og 5% CO2.
  5. Vask kamrene gang med Krebs-Ringer-puffer i 30 min.
  6. Tilsæt 5 ml Krebs-Ringer-buffer til hvert kammer og dækker kammeret for at undgå fordampning.

2. Isolering af Mouse Aortas

  1. Injicer pentobarbital som opløses i 0,9% NaCl intraperitonealt i en koncentration på 150 mg / kg til at ofre musene.
  2. Lægge musen dvask på en kirurgisk bord.
  3. Spray pelsen af ​​brystregionen med 70% ethanol med henblik på desinficering og fugt.
  4. Åben bryst hulrum ved at skære rundt om ribben at blotlægge hjertet og lungerne, og fjern lungerne.
  5. Fjern blodet i brysthulen forsigtigt med en papirserviet.
  6. Tag fat i hjertet forsigtigt med en pincet og tag thorax aorta ved at skære perivaskulær fedtvæv mellem aorta og ryg med kirurgiske sakse.
  7. fordybe straks engroe væv i iskold (4 ° C) Krebs-Ringer-buffer.
  8. Fjern hjertet og aortabuen under et dissektionsmikroskop og holde den torakale aorta segment i bufferen.
  9. Dissekere aorta fri for vedhængende perivaskulær væv under et mikroskop med kirurgiske sakse og tænger.
  10. Tag fat i enden kant af aorta med en pincet, og skyl væk blodet i de vaskulære lumen ved forsigtigt at skylle Krebs-Ringer buffer med en 26 G × 1 / 2" sprøjte.
  11. Skær de rensede aortaringe i 3 mm lange segmenter.
    Bemærk: Vær opmærksom på dette trin for at ikke skade endotel lag.

3. DHE og DAF-2DA Farvning

  1. Overfør de rensede aorta segmenter med en pincet til organbadet kamre fyldt med Krebs-Ringer-buffer ved 37 ° C beluftet med 95% O2 og 5% CO2.
    Bemærk: Tryk kun adventitiale side af aorta ringe med pincet og ikke klemme bLood fartøjer.
  2. Ækvilibrer arterierne i organbadet kammer i 30 minutter.
  3. Tilføj acetylcholin (ACh) til organbadet til en slutkoncentration 1 uM, og inkuber arterierne i 10 min.
  4. Forbered 1 ml DHE / DAF-2DA opløsning (5 pM af hver farve, fortyndet fra 1000 × lager) med forvarmet Krebs-Ringer buffer i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pak mikrocentrifugerør med aluminiumsfolie for at undgå udsættelse for lys.
  5. Efter stimulering, overføre aortaringene fra organbad til DHE / DAF-2DA opløsning i et mikrocentrifugerør ved 37 ° C beluftet med 95% O2 og 5% CO2 og inkuberes aortaringene i 30 minutter.
    Bemærk: Fra dette trin, holde aorta altid i mørke.
  6. Overfør aortaringene til et nyt mikrocentrifugerør med Krebs-Ringer-buffer til vask og gentag vask tre gange inden for 1 min.
  7. Overfør aorta ringe til 4% paraformaldehyd løsning til fiksering i 30min.
  8. Forbered 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) opløsning (300 nM, fortyndet fra 1000 × lager) med phosphatbufret saltvand (PBS) buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kontrastfarve aorta i 3 min.
  9. Overfør aorta til ny mikrocentrifugerør med PBS-buffer til vask i 1 min. Bundfaldet vaskes tre gange.
    Bemærk: Vær opmærksom på ikke at klemme aorta ringe eller beskadige endotel lag.

4. En Face Montering

  1. Tilføj en dråbe montering medium til dias.
  2. Skær aorta ringe på langs med mikrokirurgiske saks under mikroskop, foretage de oprullede aorta fladt og montere den en face på montering medium med endotel nedad på objektglasset. Flyt ikke aorta frem og tilbage.
  3. Dæk slide med dækglas og forsegle dias med neglelak.
  4. Efter lufttørring under lys beskyttelse, bruge dias til billeddannelse directly inden for timer eller opbevare dem ved -20 ° C i næste par dage.

5. Konfokal Mikroskopisk Imaging

  1. Brug et konfokalt mikroskop til at detektere fluorescenssignaler. Tænd for maskinen og optimere indstillingerne billedbehandling såsom forstørrelse, scanning hastighed, opløsning, Z-stack.
    1. Til denne protokol, bruger en 200 Hz scanning hastighed, opløsning på 1.024 × 1.024 pixels og Z-trins størrelse på 0,25 um. Excite fluorescens fra DAF-2DA med 488 nm argon laser og opdage ved 515 nm, mens ophidse fluorescens fra DHE ved 514 nm og opdage ved 605 nm emission.
  2. Brug 10X forstørrelser til at fokusere på prøven, indtil DAPI signalet er klart med ultraviolette stråler, og derefter justere målsætningen til 40X forstørrelse.
  3. Definer vifte af endotel lag ved at justere Z position på kontrolpanelet. Signalerne af DAPI-farvede kerner er ovale eller runde prikker i endothellaget.
  4. Scan fra toppen(Endotel lag på lumen grænse) af prøven gennem den fulde tykkelse af endotele signal- og optage billeder. Vælg mindst 3 forskellige områder til scanning hver prøve.

6. Analyse af billeder

  1. Brug software til at åbne de data, der er scannet ved konfokal mikroskop. Vælg tre på hinanden følgende billeder pr felt til analyse og evaluere mindst 3 forskellige felter pr prøve. Eksporter de valgte billeder og gemme dem som JPEG-filer.
  2. Kvantificer billederne fra DAF-2DA, DHE og DAPI farvning med billedbehandling software. For billedet fra DAPI farvning, vælg 'Plugins' → 'Analyser' → 'Cell Counter "for at tælle antallet af DAPI positive kerne.
    1. For billederne fra DAF-2DA og DHE farvning, vælg 'Analyser' → '', der skal analysere intensiteten af ​​signalerne, og tage den "Mean" værdi som den relative signal intensitet. Stede så resultaterne som forholdet mellem DAF-2DA tilDAPI positive kerner eller forholdet mellem DHE til DAPI. For hver prøve, tage den gennemsnitlige værdi af hver billede og område.
  3. Divider resultatet af hver prøve med gennemsnittet af kontrolgruppen for at få den fold-change. Statistisk analyse blev udført med uparret Student t-test eller ANOVA med Dunnett eller Bonferroni post-test. Giv data som middel ± SEM. Overvej forskelle i middelværdier som signifikant på p <0,05 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fedme er en vigtig risikofaktor for iskæmisk hjertesygdom og er forbundet med nedsat endotel NO biotilgængelighed, et kendetegn for aterosklerotisk vaskulær sygdom 21. eNOS-frakobling har vist sig at være en vigtig mekanisme af endothelial dysfunktion under mange fysiologiske og patologiske tilstande, herunder ældning 22, aterosklerose og fedme 14. Derfor her sammenligner vi de magre og fede mus for at vise repræsentativt resultat af NO og O 2 .- niveauer i aorta.

Fra en alder af 7 uger, blev den mandlige mus (C57BL / 6J) givet fri adgang under 14 uger til enten en normal chow (NC; energiindhold: 10,6% fedt, 27,6% protein, og 57% kulhydrat, fiber 4,8% ) eller en kost med højt fedtindhold (HFD, energiindhold: 55% fedt, 21% protein og 24% kulhydrat). Efter 14 ugers HFD musaflivet, og thorax aorta blev dissekeret, og renses for vedhængende væv. Før DAF-2DA og DHE farvning trin, de eNOS inhibitor LN G -Nitroarginine Methyl Ester (L-NAME) (1 mM) blev tilsat til badet kammer i 1 time for at blokere eNOS aktivitet 14. De repræsentative konfokal fluorescens Resultaterne er vist i figur 1. Den blå farve i det øverste panel repræsenterer kernen af endotelceller farvet med DAPI. I midten panel, den grønne farve er fluorescenssignalet fra DAF-2T konverteret fra den ikke-fluorescerende DAF-2 ved NO, hvilket betyder, hvis intensiteten af ​​grønne signal er højere, er der mere NO i cellerne. Ligeledes den røde farve i det nederste panel er fluorescenssignalet fra DHE oxideret af O2 .-, så prøven viser mere rød farve har mere O 2 .- i cellerne.

Konfokal fluorescensmikroskopi viste faldd NO-produktion (DAF-2DA farvning) og øget L-NAME-sensitive O 2 .- generation (DHE-farvning) i aorta endotheliale lag af mus fodret HFD sammenlignet med den for mus fodret NC (figur 1) 14, tyder eNOS-afkobling i fedme. Signalerne blev kvantificeret og præsenteres i søjlediagrammer 14.

Figur 1
Figur 1. eNOS-afkobling i fedme. Konfokal mikroskopisk en face påvisning af NO og O 2 .- af DAF-2DA og DHE farvning hhv. n = 5; *** p <0,005 vs NC; ††† p <0,005 vs HFD gruppe. Scale bar = 0.1 mm. (Data var fra henvisning 14) Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Påvisning af NO eller O 2 .- med fluorescerende farvestoffer blev ofte anvendt i mange undersøgelser i dyrkede endotelceller og også i vaevskryosnit 23. Her udvides vi denne metode til intakt levende blodkar, dvs, en face påvisning af NO og O 2 .- niveauer i endothellaget med DAF-2DA og DHE henholdsvis som er effektiv, forholdsvis enkel og intuitive. I sammenligning med fremgangsmåden i vaskulære kryosektioner, denne metode viser lavere baggrund og er mere kvantitative, idet elastiske fibre i medierne af en arterie især aorta i kryosektionerne giver meget stærke autofluorescens signaler, som kan forstyrre det specifikke NO eller O 2. - signaler genereret i endotelceller. Desuden kunne specifik O 2 .- generation af NADPH-oxidase eller andre enzymer i de mediale glatte muskelceller også forstyrremed signalerne i endotelceller i den vaskulære sektion, som repræsenterer den ulempe ved fremgangsmåden med vaskulære kryosektioner. I modsætning hertil en face farvning metode detekterer signaler specifikt fra endothellaget af et intakt blodkar segment og giver derfor mere præcis analyse. En kryostat maskine til kryosektion fremstilling er også en dyr investering. Sammenligne til andre biokemiske metoder, den største begrænsning ved denne metode er mindre kvantitativ, men det er et godt valg for relativ sammenligning mellem prøver. Endvidere kan kravet om et konfokalt mikroskop, som er dyre også være en begrænsning af denne fremgangsmåde. Den multi-organ kammer system er praktisk og hvis dette ikke er tilgængelig i laboratoriet, kan man nemt etablere et system med vandbad og rør, som er forbundet til et carbonatom gas tank med reguleringssystem, således at blodkarrene i rørene er holdt ved 37 ° C og beluftet med 95% O2 og 5% CO

Der er flere kritiske trin, man har til at være opmærksom. Vær sikker på, at perivaskulær væv renses for nem montering. De blodpropper i vaskulære lumen skal skylles væk, fordi de kan forårsage kunstige signaler og forstyrre fluorescens signaler. Under hele proceduren fra Præparat blodkar, inkubation, vask, skæring og montage, man skal være yderst forsigtig med ikke at beskadige endothellaget af blodkarrene. Lad ikke blodkar tør under hele proceduren med forberedelse. DHE og DAF-2DA er begge fluorescerende prober, så starter fra farvningstrin aorta bør altid beskyttes mod lyseksponering. Før fikseringstrinnet endotelcellerne af aorta skal være levende, så aorta bør altid holdes i Krebs-Ringer puffer beluftet med 95% O2 og 5% CO2. Billeder af prøverne skal tages så hurtigt som muligt efter fremstilling. Den fluorescerernce signal bliver svagere i et par dage, selv med beskyttelsen af ​​montering medium, som kan påvirke nøjagtigheden af ​​resultaterne. Metoden kan ikke begære blodkar med for tyk karvæggen.

Denne metode muliggør simultan fantasi af NO og O 2 .- produktion i endothellaget af intakte blodkar, hvis de to farvestoffer blev tilsat til blodkarrene sammen. Man kan også bruge denne metode til at vurdere farmakologiske virkninger af lægemidler på NO og O 2 .- produktion in vitro i isolerede blodkar. Til dette formål er den rensede aorta normalt skåret i to dele, den ene er til kontrol og en anden er, at medicinsk behandling, og stoffet bør føjes til inkubationsbufferen efter ligevægt før DAF-2DA og DHE farvning trin. Det er især nyttigt, hvis denne metode anvendes sammen med en anden metode, f.eks med analyse af vasomotoriske reaktioner af isolerede blod vessels, kan en fysiologisk funktion af endotelceller bekræftes. Denne metode skal også være egnet til at analysere ethvert endotel (dys) funktion i intakte blodkar i sygdomsmodeller og de underliggende mekanismer.

Sammenfattende præsenterede vi en simpel protokol til samtidig opdage NO og O 2 .- produktion i endotel lag af intakte blodkar med en fluorescens konfokal mikroskop. Vi viser, hvordan denne metode med succes arbejdet i fedme musemodel. Denne metode er en nyttig teknik i undersøgelse af endotel NO og O 2 .- produktion under mange vaskulære sygdomstilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
  2. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  3. Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
  4. Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
  5. Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
  6. Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
  7. Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
  8. Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
  9. Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
  10. Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
  11. Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
  12. Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
  13. Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
  14. Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
  15. Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
  16. Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
  17. Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
  18. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
  19. Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
  20. Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
  21. Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
  22. Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
  23. Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).

Tags

Molekylærbiologi Arterier Konfokal mikroskopi DHE DAF-2DA endotel nitrogenoxid superoxidanion Vascular Biology
<em>En Face</em> Detection af nitrogenoxid og Superoxide i Endotel Layer af intakte arterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P.,… More

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter