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बरकरार धमनियों की endothelial परत में नाइट्रिक ऑक्साइड और Superoxide के एन चेहरा पहचान

Published: February 25, 2016 doi: 10.3791/53718
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2
1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

Summary

इस लेख में हम एक अनुकूलित अपेक्षाकृत आसान विधि प्रतिदीप्ति डाई एन चेहरे एक साथ पता लगाने और intracellular नाइट्रिक ऑक्साइड के दृश्य (सं) और सुपरऑक्साइड आयनों (ओ 2 के लिए diaminofluorescein -2 diacetate (DAF-2DA) और dihydroethidium (DHE) का उपयोग का वर्णन .- ) क्रमश: हौसले में एक मोटापा माउस मॉडल की बरकरार aortas अलग।

Abstract

अन्तःस्तर व्युत्पन्न नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) endothelial NO-synthase (एनोस) से उत्पादित हृदय शरीर क्रिया विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण vasoprotective अणुओं में से एक है। बेकार एनोस ऐसे एनोस की uncoupling सं जैव उपलब्धता और सुपरऑक्साइड आयनों में वृद्धि में कमी की ओर जाता है के रूप में (ओ 2 .-) उत्पादन, और बदले में हृदय रोगों को बढ़ावा देता है। इसलिए, कोई और ओ 2 .- endothelial कोशिकाओं में स्तरों के उचित माप हृदय रोगों और जटिलताओं पर अनुसंधान के लिए निर्णायक हैं। कोई और ओ 2 .- की बेहद अस्थिर प्रकृति के कारण, यह कोई उपाय और ओ 2 .- सीधे एक रक्त वाहिका में करना मुश्किल है। कई तरीकों कोई उपाय और ओ 2 .- उत्पादन के लिए विकसित किया गया है। यह, हालांकि, तो असंवेदनशील, या गैर विशिष्ट, या तकनीकी रूप से मांग की है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है। यहाँ हम एक adaption का वर्णनएन चेहरे एक साथ पता लगाने और intracellular कोई और ओ 2 के दृश्य .-, सेल पारगम्य diaminofluorescein -2 diacetate (DAF-2DA) और dihydroethidium (DHE) का उपयोग कर क्रमश: एक मोटापा माउस मॉडल की बरकरार aortas प्रेरित में लिए प्रतिदीप्ति डाई विधि की उच्च वसा वाले आहार खिलाने से। हम intracellular सं मोटापा माउस के हौसले पृथक बरकरार aortas में कमी आई सका प्रदर्शन और बढ़ाया हे 2 .- के स्तर को नियंत्रित दुबला माउस की तुलना में। हम जानते हैं कि इस विधि प्रत्यक्ष पता लगाने और सं के दृश्य और ओ 2 के लिए एक आसान तकनीक .- बरकरार रक्त वाहिकाओं में है और व्यापक रूप से (फिजियो) रोग की स्थिति के तहत endothelial (dys) समारोह की जांच के लिए लागू किया जा सकता प्रदर्शित करता है।

Introduction

संवहनी endothelial कोशिकाओं vasoactive कारकों 1 रिहा द्वारा नाड़ी कार्यात्मक और संरचनात्मक अखंडता रखने के लिए। इन कारकों के अलावा, endothelium व्युत्पन्न नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) endothelial NO-synthase (एनोस) के माध्यम से एल arginine से उत्पादित हृदय शरीर क्रिया विज्ञान 2 में सबसे महत्वपूर्ण और सबसे अच्छा विशेषता कारक है। कोई चिकनी मांसपेशी छूट का कारण बनता है और सेल प्रसार को रोकता है, subendothelial अंतरिक्ष में प्लेटलेट एकत्रीकरण और भड़काऊ कोशिका आसंजन और घुसपैठ को रोकता है, इसलिए रोग विकास 3 के खिलाफ की रक्षा। उम्र बढ़ने, उच्च रक्तचाप, मधुमेह, कोलेस्ट्रॉल, आदि सहित कई शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत, endothelial रोग की विशेषता सं जैव उपलब्धता में कमी आई है और वृद्धि की हे 2 .- उत्पादन मौजूद है और atherosclerosis 2 के रोगजनन को बढ़ावा देता है। हाल के वर्षों से अध्ययन दर्शाते हैं कि एनोस की uncoupling एक हैendothelial रोग है, जिसमें एनोस एंजाइम हे 2 उत्पन्न करता है .- NO के बजाय के लिए महत्वपूर्ण तंत्र, विभिन्न ऊपर उल्लिखित शर्तों 1,4 के तहत। इसलिए, endothelial समारोह का विश्लेषण, विशेष रूप से, कोई उत्पादन endothelial और हे 2 .- पीढ़ी हृदय रोगों और जटिलताओं पर प्रायोगिक अनुसंधान के लिए निर्णायक है।

वहाँ कई methodological दृष्टिकोण है कि विश्लेषण और जैविक नमूने में कोई उत्पादन मापने के लिए विकसित किया गया है। और सं 3 - - नहीं की बेहद अस्थिर स्वभाव जो आसानी से सं 2 ऑक्सीकरण हो जाता है के कारण 3 से 6 सेकंड के एक आधा जीवन के साथ, यह सीधे मापने के लिए मुश्किल है। / नहीं 3 - - की सं 2 इसलिए दृढ़ संकल्प तरल पदार्थ के नमूने में कोशिकाओं या ऊतकों 5 से रिहा सं के एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हालांकि प्रक्रिया अपेक्षाकृत आसान है, विधि है, तथापि, ईए/ नहीं 3 - - समाधान में निहित sily स्थिर सं 2 की उच्च पृष्ठभूमि से प्रभावित। क्योंकि कोई घुलनशील guanylate साइक्लेज चक्रीय ग्वानोसिन मोनोफास्फेट (cGMP) 6 का उत्पादन करने के लिए उत्तेजित करता है, सेलुलर cGMP स्तर पर भी कोई रिलीज 7 अनुमान लगाने के लिए निर्धारित किया गया है। फिर, यह एक अप्रत्यक्ष अनुमान है और विशिष्ट नहीं हो सकता है, क्योंकि इस तरह के सी प्रकार नैट्रियूरेटिक पेप्टाइड (सीएनपी) के रूप में कुछ endothelium व्युत्पन्न कारकों को भी कण guanylate साइक्लेज 8 के सक्रियण के माध्यम cGMP का स्तर बढ़ाने के लिए कर सकता है। सं के रूप में एक उप-उत्पाद के 9, एल citrulline उत्पादन की माप इसलिए भी कोई उत्पादन अनुमान लगाने के लिए एक अप्रत्यक्ष विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है एल citrulline की पीढ़ी के साथ एल arginine से निर्मित है। इस विधि का प्रमुख कमियां हैं कि यह रेडियोधर्मी है और यह बायोएक्टिव कोई स्तर उपाय नहीं है, के बाद से जारी हे 2 द्वारा सं तेजी से निष्क्रिय किया जा सकता है .-; इसके अलावा, एल citrulline एल को साफ किया जा सकता10 arginine। ऐसे chemiluminescence का पता लगाने के 11, इलेक्ट्रॉन स्पिन गूंज 12, या विद्युत porphyrinic कोई सेंसर के रूप में 13 अन्य रासायनिक विधियों कई जांचकर्ताओं द्वारा किया जाता है। इन विधियों आमतौर पर नहीं परिचालन में आसान है, का पता लगाने के प्रक्रियाएं हैं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। ऐसा नहीं है कि कई अध्ययनों के साथ या endothelium endothelial समारोह का आकलन करने और परोक्ष रूप से endothelium व्युत्पन्न कोई मध्यस्थता संवहनी छूट को मापने के लिए बिना पृथक रक्त वाहिकाओं के साथ अंग स्नान प्रयोगों लागू करने का उल्लेख भी है। हालांकि, इस पद्धति है, हालांकि यह ज्यादातर शारीरिक स्थिति के करीब है, लेकिन सख्ती से कहने के लिए, कोई समारोह उपाय नहीं है, बल्कि यह सामान्य में endothelium की मध्यस्थता vasomotor प्रतिक्रियाएं कि एनोस समारोह का शुद्ध प्रभाव प्रतिबिंबित करती हैं, के उत्पादन का आकलन अन्य endothelium व्युत्पन्न आराम कारकों और endothelium व्युत्पन्न करार कारकों, हे 2 .- के उत्पादन, और भी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएंइन कारकों के लिए। एनोस समारोह या सं उत्पादन का एक विशिष्ट विश्लेषण आमतौर पर 3 आवश्यक है।

हमारा सहित कई अनुसंधान समूहों प्रतिदीप्ति डाई विधि का इस्तेमाल सं 14-19 के intracellular उत्पादन पता लगाने के लिए हाल के वर्षों में किया है। इस विधि में सेल पारगम्य प्रतिदीप्ति सूचक diaminofluorescein -2 diacetate (DAF-2DA) इन विट्रो या पूर्व vivo में कोशिकाओं और ऊतकों में रहने वाले रिक्त कोई और ओपन स्कूल समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। सिद्धांत है जीवित कोशिकाओं में, DAF-2DA intracellular esterase द्वारा गैर फ्लोरोसेंट 4,5-diaminofluorescein को deacetylated है कि (DAF-2) जो तब कोई साथ प्रतिक्रिया द्वारा फ्लोरोसेंट DAF-2 triazole (DAF-2T) परिवर्तित कर दिया गया । DAF-2T से प्रतिदीप्ति एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी या एक प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन 14 के तहत देखा जा सकता है। intracellular प्रतिदीप्ति तीव्रता इसलिए कोशिकाओं में intracellular कोई उत्पादन या बरकरार रक्त vesse में एक की endothelium को दर्शाता हैएल। ऐसे dihydroethidium (DHE) के रूप में एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति डाई के साथ संयुक्त, एक साथ कोशिकाओं में या रक्त वाहिकाओं 14 में intracellular कोई और ओ 2 .- पीढ़ी का आकलन कर सकते हैं। इसी तरह, DHE भी एक सेल पारगम्य यौगिक है कि हे 2 से ऑक्सीकरण हो जाता है .- कोशिकाओं के अंदर और ऑक्सीडेटिव उत्पाद तो न्यूक्लिक एसिड के साथ intercalates एक चमकदार लाल रंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन से मात्रात्मक detectable फेंकना है। के रूप में यह अनिवार्य रूप से सुपरऑक्साइड कण का पता लगाता है, कोशिकाओं द्वारा अच्छी तरह से बनाए रखा है, और यहां तक कि हल्के निर्धारण 20 को बर्दाश्त कर सकते हैं DHE हे 2 .- जैविक नमूनों से पता लगाने के लिए एक बहुत ही विशेष डाई है। इस प्रतिदीप्ति डाई विधि के लाभ में से एक यह है कि यह पता लगाता है और सीधे एक जीवित रक्त वाहिनियों की अक्षुण्ण endothelial परत पर कोई और / या ओ 2 .- visualizes एन चेहरा है।

इस कागज़ पे,हम इस प्रतिदीप्ति डाई और कोई पता लगाने के लिए विधि हे 2 .- जो हम एन सं के चेहरे का पता लगाने और ओ 2 के लिए अनुकूलित है वर्णन .- एक मोटापा माउस मॉडल उच्च वसा आहार (HFD) दूध पिलाने से प्रेरित बरकरार aortas में। हम जानते हैं कि इस पद्धति का सफलतापूर्वक और मज़बूती से कोई और ओ 2 .- के स्तर को मापने और मोटापे में हौसले से पृथक बरकरार माउस aortas के endothelial परत में एनोस का मूल्यांकन (dys) समारोह सका प्रदर्शित करता है।

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Protocol

पशु काम फ़्राइबर्ग, स्विट्जरलैंड के पशु चिकित्सा कार्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रोटोकॉल हमारी संस्था में जानवरों की देखभाल और प्रयोग पर दिशा निर्देशों के बाद।

1. पृथक धमनियों की ऊष्मायन के लिए एक सेट अप की तैयारी

  1. एक अंग स्नान प्रणाली है जो 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सकता है और एक कार्बन गैस टंकी से 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ वातित का निर्माण।
  2. के रूप में निम्नलिखित रचना की एकाग्रता के साथ की जरूरत के रूप में ज्यादा क्रेब्स-घंटी बिकारबोनिट बफर तैयार: (118 मिमी NaCl, 4.7 मिमी KCl, 2.5 मिमी 2 CaCl, 1.2 मिमी MgSO 4, 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 25 मिमी 3 NaHCO, 0.026 मिमी EDTA, और 11.1 मिमी डी ग्लूकोज)।
  3. बर्फ पर शेयर बफर रखें और 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ बफर aerate।
  4. अंग स्नान प्रणाली पर स्विच, 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर सेट प्रत्येक कक्ष के लिए तैयार करने के लिए उपयोग बफर के 5 मिलीलीटर जोड़नेऔर 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ बफर aerating रहते हैं।
  5. 30 मिनट के लिए क्रेब्स-घंटी बफर के साथ एक बार कक्षों धो लें।
  6. प्रत्येक कक्ष के लिए 5 मिलीलीटर क्रेब्स-घंटी बफर जोड़ें और चैम्बर कवर वाष्पीकरण से बचने के लिए।

2. माउस Aortas का अलगाव

  1. pentobarbital जो 150 मिलीग्राम / किग्रा की एकाग्रता पर intraperitoneally 0.9% NaCl में भंग कर रहा है चूहों बलिदान करने के लिए इंजेक्षन।
  2. एक शल्य चिकित्सा बोर्ड पर आलस्य के साथ माउस निर्धारित करना।
  3. स्वच्छता और नमी के प्रयोजनों के लिए 70% इथेनॉल के साथ छाती क्षेत्र के फर स्प्रे।
  4. पसली के आसपास काटने से खुली छाती गुहा हृदय और फेफड़ों का पर्दाफाश, और फेफड़ों को दूर करने के लिए।
  5. एक कागज ऊतक के साथ धीरे छाती गुहा में रक्त निकालें।
  6. एक संदंश के साथ धीरे दिल समझ और महाधमनी और शल्य कैंची के साथ रीढ़ की हड्डी के बीच परिवाहकीय वसा ऊतक काटने से वक्ष महाधमनी अलग।
  7. इसके तत्काल बाद Whol विसर्जितबर्फ के ठंडे (4 डिग्री सेल्सियस) क्रेब्स-घंटी बफर में ई ऊतकों।
  8. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे दिल और महाधमनी चाप निकालें और बफर में वक्ष महाधमनी खंड रहते हैं।
  9. महाधमनी शल्य कैंची और संदंश के साथ एक खुर्दबीन के नीचे परिवाहकीय ऊतक पालन से मुक्त काटना।
  10. एक संदंश के साथ महाधमनी के अंत में बढ़त समझ, और धीरे से एक 26 जी × 1 / 2" सिरिंज के साथ क्रेब्स-घंटी बफर निस्तब्धता द्वारा नाड़ी लुमेन में रक्त दूर फ्लश।
  11. 3 मिमी लंबे खंडों में साफ महाधमनी के छल्ले में कटौती।
    नोट: इस कदम पर ध्यान देना endothelial परत को नुकसान नहीं है।

3. DHE और DAF-2DA धुंधला

  1. अंग स्नान 37 डिग्री सेल्सियस पर क्रेब्स-घंटी बफर के साथ भरा कक्षों के लिए एक संदंश के साथ साफ महाधमनी खंडों स्थानांतरण 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ वातित।
    नोट: टच केवल संदंश के साथ महाधमनी के छल्ले के adventitial पक्ष और बी दबाना नहीं हैlood वाहिकाओं।
  2. 30 मिनट के लिए अंग स्नान कक्ष में धमनियों संतुलित करना।
  3. acetylcholine (आक) अंतिम एकाग्रता 1 माइक्रोन करने के लिए अंग स्नान के लिए जोड़ें, और 10 मिनट के लिए धमनियों सेते हैं।
  4. 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पूर्व गर्म क्रेब्स-घंटी बफर के साथ DHE / DAF-2DA समाधान (प्रत्येक डाई की 5 सुक्ष्ममापी, 1000 × स्टॉक से पतला) के 1 मिलीलीटर तैयार करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ microcentrifuge ट्यूब लपेटें प्रकाश जोखिम से बचने के लिए।
  5. उत्तेजना के बाद, महाधमनी के छल्ले अंग स्नान से DHE / DAF-2DA समाधान के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर हस्तांतरण 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ वातित और 30 मिनट के लिए महाधमनी के छल्ले सेते हैं।
    नोट: इस कदम से, अंधेरे में हमेशा aortas रहते हैं।
  6. धोने के लिए क्रेब्स-घंटी बफर के साथ एक नया microcentrifuge ट्यूब महाधमनी के छल्ले स्थानांतरण और 1 मिनट के भीतर धोने तीन बार दोहराएँ।
  7. 30 के लिए निर्धारण के लिए 4% paraformaldehyde समाधान करने के लिए महाधमनी के छल्ले स्थानांतरणमि।
  8. तैयार 1 मिलीलीटर 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) समाधान (300 एनएम, 1000 × स्टॉक से पतला) फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बफर के साथ। 3 मिनट के लिए aortas Counterstain।
  9. aortas 1 मिनट के लिए धोने के लिए पीबीएस बफर के साथ नए microcentrifuge ट्यूब पर स्थानांतरण। कपड़े धोने तीन बार दोहराएँ।
    नोट: ध्यान का भुगतान नहीं महाधमनी के छल्ले दबाना या endothelial परत को नुकसान पहुंचा है।

4. एन चेहरा बढ़ते

  1. स्लाइड के लिए बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ें।
  2. खुर्दबीन के नीचे microsurgical कैंची से longitudinally महाधमनी के छल्ले में कटौती, लुढ़का हुआ aortas फ्लैट बनाने के लिए और endothelium गिलास स्लाइड पर नीचे का सामना करना पड़ के साथ बढ़ते मध्यम पर एन चेहरे माउंट। aortas आगे और पीछे कदम नहीं है।
  3. कवर पर्ची के साथ स्लाइड कवर और नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सील।
  4. प्रकाश संरक्षण के तहत हवा सुखाने के बाद, सख्त इमेजिंग के लिए स्लाइड का उपयोगctly घंटे के भीतर या उन्हें अगले कुछ दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

5. Confocal सूक्ष्म इमेजिंग

  1. प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने के लिए एक confocal खुर्दबीन का प्रयोग करें। मशीन पर स्विच और इस तरह बढ़ाई, स्कैनिंग गति, संकल्प, जेड ढेर के रूप में इमेजिंग सेटिंग्स का अनुकूलन।
    1. इस प्रोटोकॉल के लिए, एक 200 हर्ट्ज स्कैनिंग गति, 1024 × 1024 पिक्सल के संकल्प और 0.25 माइक्रोन के Z-कदम आकार का उपयोग करें। 488 एनएम आर्गन लेजर के साथ DAF-2DA से प्रतिदीप्ति उत्तेजित और 515 एनएम का पता लगाने, जबकि 514 एनएम पर DHE से प्रतिदीप्ति उत्तेजित और 605 एनएम उत्सर्जन पर पता लगा।
  2. 10X आवर्धन का प्रयोग नमूना पर ध्यान केंद्रित करने के लिए जब तक DAPI संकेत पराबैंगनी किरणों के साथ स्पष्ट है, और फिर 40X आवर्धन करने के उद्देश्य को समायोजित।
  3. नियंत्रण कक्ष पर जेड स्थिति का समायोजन करके endothelial परत की सीमा को परिभाषित करें। DAPI से सना हुआ नाभिक के संकेतों endothelial परत में अंडाकार या गोल बिंदु हैं।
  4. ऊपर से स्कैनendothelial संकेत और रिकॉर्ड छवियों से भरा मोटाई के माध्यम से नमूने की (endothelial लुमेन सीमा पर परत)। प्रत्येक नमूना स्कैनिंग के लिए कम से कम 3 अलग अलग क्षेत्रों का चयन करें।

6. छवियों के विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें डेटा confocal खुर्दबीन द्वारा स्कैन खोलने के लिए। विश्लेषण के लिए क्षेत्र के अनुसार लगातार तीन छवियों चुनें और नमूना प्रति कम से कम 3 अलग अलग क्षेत्रों का मूल्यांकन। चुने छवियों को निर्यात और उन्हें जेपीईजी फाइल के रूप में बचाने के लिए।
  2. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ धुंधला हो DAF-2DA, DHE और DAPI से छवियों को यों। DAPI धुंधला से छवि के लिए, चयन 'प्लगइन्स' → 'विश्लेषण' → 'सेल काउंटर' DAPI सकारात्मक नाभिक की संख्या गिनने के लिए।
    1. DAF-2DA और DHE धुंधला से छवियों के लिए, 'विश्लेषण' → 'उपाय' संकेतों की तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए चुनते हैं, और रिश्तेदार संकेत तीव्रता के रूप में 'मतलब' मान ले। वर्तमान तो DAF-2DA के अनुपात के रूप में परिणामDAPI सकारात्मक नाभिक या DAPI को DHE का अनुपात। प्रत्येक नमूना के लिए, हर छवि और क्षेत्र की औसत मान ले।
  3. नियंत्रण समूह की औसत से हर नमूने के परिणाम विभाजित गुना परिवर्तन पाने के लिए। सांख्यिकीय विश्लेषण unpaired छात्र टी परीक्षण या एनोवा Dunnett या Bonferroni के बाद परीक्षण के साथ साथ प्रदर्शन किया गया था। ± SEM के मतलब के रूप में डेटा दीजिए। पी <0.05 14 में महत्वपूर्ण के रूप में मतलब मूल्यों में मतभेद पर विचार करें।

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Representative Results

मोटापे की वजह से इस्कीमिक कोरोनरी हृदय रोग का एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है और साथ जुड़ा हुआ है कोई bioavailability, atherosclerotic रोग 21 वर्ष की एक बानगी endothelial कमी आई है। एनोस-uncoupling उम्र बढ़ने के 22, atherosclerosis, और मोटापे के 14 सहित कई शारीरिक और रोग की शर्तों के तहत endothelial रोग का एक महत्वपूर्ण तंत्र होना दिखाया गया है। इसलिए, हम यहाँ और सं के प्रतिनिधि परिणाम हे 2 .- aortas में स्तरों को दिखाने के लिए दुबला और मोटे चूहों की तुलना करें।

10.6% वसा, 27.6% प्रोटीन, और 57% कार्बोहाइड्रेट, फाइबर 4.8%: ऊर्जा सामग्री, 7 सप्ताह की उम्र में शुरू, नर चूहों (C57BL / 6J) या तो एक सामान्य चाउ (नेकां को 14 सप्ताह के दौरान मुक्त पहुँच दी गई ) या एक उच्च वसा वाले आहार (HFD, ऊर्जा सामग्री: 55% वसा, 21% प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट और 24%)। बाद HFD चूहों के 14 सप्ताह के थेबलिदान और वक्ष aortas विच्छेदित कर रहे थे, और पालन करने के ऊतकों की साफ कर दिया। इससे पहले DAF-2DA और DHE कदम धुंधला हो जाना, एनोस अवरोध करनेवाला एल.एन. जी -Nitroarginine मिथाइल एस्टर (एल नाम) (1 मिमी) एनोस गतिविधि 14 ब्लॉक करने के लिए 1 घंटे के लिए स्नान चैम्बर के लिए जोड़ा गया है। प्रतिनिधि confocal प्रतिदीप्ति परिणाम चित्र 1 में दिखाया गया। ऊपरी पैनल में नीले रंग DAPI से सना हुआ endothelial कोशिकाओं के नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है। मध्यम पैनल में, हरे रंग DAF-2T गैर फ्लोरोसेंट DAF-2 कोई द्वारा, जिसका मतलब है कि अगर हरी झंडी की तीव्रता अधिक है से परिवर्तित से प्रतिदीप्ति संकेत है, वहाँ अधिक कोशिकाओं में नहीं हैं। इसी प्रकार, कम पैनल में लाल रंग DHE से प्रतिदीप्ति संकेत हे 2 .- द्वारा ऑक्सीकरण है, इसलिए अधिक लाल रंग दिखा नमूना अधिक o 2 .- कोशिकाओं में है।

Confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कमी का पता चलाD नहीं उत्पादन (DAF-2DA धुंधला) और बढ़ एल NAME-संवेदनशील हे 2 .- पीढ़ी (DHE धुंधला) चूहों के महाधमनी endothelial परत में, के रूप में करने के लिए चूहों की कि नेकां (चित्रा 1) 14 से तंग आ तुलना HFD तंग आ गया सुझाव एनोस-uncoupling मोटापे में। संकेतों मात्रा निर्धारित और बार रेखांकन 14 में प्रस्तुत किए गए।

आकृति 1
चित्रा मोटापे में 1. एनोस-uncoupling। एन सं के चेहरे का पता लगाने और ओ 2 Confocal सूक्ष्म .- DAF-2DA और DHE धुंधला क्रमश। एन = 5; *** पी <0.005 बनाम नेकां, ††† पी <0.005 बनाम HFD समूह। स्केल बार = 0.1 मिमी। (डाटा संदर्भ 14 से थे) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सं या ओ 2 की जांच .- फ्लोरोसेंट रंगों के साथ अक्सर ऊतक cryosections 23 में सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं में कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था और यह भी। यहाँ हम बरकरार रहने वाले रक्त वाहिकाओं, यानी करने के लिए इस विधि बढ़ाया, एन सं के चेहरे का पता लगाने और ओ 2 .- DAF-2DA और DHE, क्रमशः, जो प्रभावी है, अपेक्षाकृत सरल है, और सहल ज्ञान के साथ endothelial परत में स्तरों। संवहनी cryosections में विधि के साथ तुलना में, इस विधि में कम पृष्ठभूमि पता चलता है और अधिक मात्रात्मक है, के बाद से एक धमनी के मीडिया में लोचदार फाइबर विशेष रूप से cryosections में महाधमनी बहुत मजबूत autofluorescence संकेत हैं, जो विशिष्ट सं या 2 हे के साथ हस्तक्षेप कर सकता है दे। - संकेतों endothelial कोशिकाओं में उत्पन्न। इसके अलावा, विशिष्ट हे 2 .- पीढ़ी NADPH oxidase या अन्य एंजाइमों से औसत दर्जे का चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में भी हस्तक्षेप कर सकता हैसंवहनी खंड है, जो नाड़ी cryosections के साथ विधि के नुकसान का प्रतिनिधित्व करता है में endothelial कोशिकाओं में संकेतों के साथ। इसके विपरीत, एन चेहरे धुंधला विधि एक अक्षुण्ण रक्त वाहिका खंड के endothelial परत से विशेष रूप से संकेतों का पता लगाता है और इसलिए अधिक सटीक विश्लेषण देता है। cryosection तैयारी के लिए एक cryostat मशीन भी एक महंगी निवेश है। अन्य जैव रासायनिक तरीकों के मुकाबले, इस विधि की मुख्य सीमा कम मात्रात्मक है, लेकिन यह नमूने के बीच सापेक्ष तुलना के लिए एक अच्छा विकल्प है। इसके अलावा, एक confocal खुर्दबीन की आवश्यकता है जो महंगा है भी इस पद्धति की एक सीमा हो सकती है। बहु-अंग चैम्बर प्रणाली सुविधाजनक है और अगर इस प्रयोगशाला में उपलब्ध नहीं है, एक बड़ी आसानी से, पानी से स्नान और ट्यूबों जो नियामक प्रणाली के साथ एक कार्बन गैस की टंकी से जुड़े रहे हैं के साथ एक प्रणाली स्थापित कर सकते हैं तो नलियों में रक्त वाहिकाओं हैं कि 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा और 95% 2 हे और 5% सीओ के साथ पदार्थो

वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम एक ध्यान देने की है कि कर रहे हैं। सुनिश्चित करें कि परिवाहकीय ऊतक आसान बढ़ते के लिए साफ किया जाता है हो सकता है। संवहनी लुमेन में रक्त के थक्के, दूर प्लावित किया जाना चाहिए, क्योंकि वे कृत्रिम संकेतों के कारण और प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। रक्त वाहिनियों की तैयारी, ऊष्मायन, कपड़े धोने, काटने और बढ़ते की पूरी प्रक्रिया के दौरान, एक रक्त वाहिकाओं के endothelial परत को नुकसान नहीं बेहद सतर्क हो गया है। तैयारी की पूरी प्रक्रिया के दौरान रक्त वाहिनियों की सूखी मत देना। DHE और DAF-2DA इसलिए धुंधला कदम aortas हमेशा प्रकाश जोखिम से संरक्षित किया जाना चाहिए से शुरू दोनों फ्लोरोसेंट जांच कर रहे हैं। निर्धारण से पहले कदम aortas के endothelial कोशिकाओं को जिंदा होना चाहिए, ताकि aortas हमेशा क्रेब्स-घंटी बफर 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ वातित में रखा जाना चाहिए। नमूनों की छवियाँ तैयारी के बाद जितनी जल्दी हो सके लिया जाना चाहिए। प्रतिदीप्तिnce संकेत भी बढ़ते मध्यम के संरक्षण, जो परिणामों की सटीकता को प्रभावित कर सकता से कुछ ही दिनों में कमजोर हो जाएगा। विधि भी मोटी दीवार के साथ संवहनी रक्त वाहिकाओं के लिए लागू नहीं हो सकता।

इस विधि को बरकरार रक्त वाहिकाओं के endothelial परत में कोई कल्पना के एक साथ और ओ 2 .- उत्पादन में सक्षम बनाता है, तो दो रंगों को एक साथ रक्त वाहिकाओं के लिए जोड़ा गया था। एक भी पृथक रक्त वाहिकाओं में इन विट्रो में कोई और ओ 2 .- उत्पादन पर दवाओं के औषधीय प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस विधि का उपयोग कर सकते हैं। इस प्रयोजन के लिए, साफ महाधमनी आमतौर पर दो भागों में काट रहा है एक नियंत्रण के लिए है और एक और दवा के इलाज के लिए है, और DAF-2DA और DHE कदम धुंधला करने से पहले दवा संतुलन के बाद ऊष्मायन बफर करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। यह विशेष रूप से उपयोगी है अगर इस विधि से अलग-थलग रक्त वी के vasomotor प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के साथ, एक अन्य विधि के साथ एक साथ इस्तेमाल किया जाता है जैसे,essels, endothelial कोशिकाओं की एक शारीरिक समारोह की पुष्टि की जा सकती है। इस विधि के किसी भी endothelial (dys) रोग मॉडल की बरकरार रक्त वाहिकाओं और अंतर्निहित तंत्र में समारोह के विश्लेषण के लिए भी उपयुक्त हो जाएगा।

सारांश में, हम एक साथ एक प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन के साथ बरकरार रक्त वाहिकाओं के endothelial परत में कोई और ओ 2 .- उत्पादन का पता लगाने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया। हम बताएंगे कि कैसे इस विधि सफलतापूर्वक मोटापा माउस मॉडल में काम किया। इस विधि में कई रोग की शर्तों के तहत endothelial सं की जांच और ओ 2 .- उत्पादन में एक उपयोगी तकनीक है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 108 धमनियों confocal माइक्रोस्कोपी DHE DAF-2DA endothelium नाइट्रिक ऑक्साइड Superoxide आयनों नाड़ी जीवविज्ञान
बरकरार धमनियों की endothelial परत में नाइट्रिक ऑक्साइड और Superoxide के <em>एन चेहरा</em> पहचान
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Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

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