Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En Face Detection av nitrogenoksid og Superoxide i endothelial lag av intakte Arterier

Published: February 25, 2016 doi: 10.3791/53718
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2
1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

Summary

I denne artikkelen beskriver vi en tilpasset relativt enkel metode å bruke fluorescens fargestoff diaminofluorescein-2 diacetat (DAF-2DA) og dihydroethidium (DHE) for en face samtidig påvisning og visualisering av intracellulær nitrogenoksid (NO) og superoksid anion (O 2 .- ) henholdsvis i ferske isolerte intakte Aorta av en fedme musemodell.

Abstract

Endotel-avledet nitrogenoksid (NO) fremstilt av endotelial NO-syntase (eNOS) er en av de viktigste vasoprotective molekyler i sirkulasjonsfysiologi. Dysfunksjonell eNOS som frakobling av eNOS fører til reduksjon i NO biotilgjengelighet og økning i superoksid anion (O 2 .-) produksjon, og i sin tur fremmer hjerte- og karsykdommer. Derfor passende måling av NO og O 2 .- nivåer i endotelceller er avgjørende for forskning på hjerte- og karsykdommer og komplikasjoner. På grunn av den ekstremt labile naturen til NO og O 2 .-, er det vanskelig å måle NO og O 2 .- direkte i et blodkar. Tallrike metoder har blitt utviklet for å måle NO og O 2 .- produksjon. Det er imidlertid enten ufølsom, eller ikke-spesifikke, eller teknisk krevende og krever spesialutstyr. Her beskriver vi en tilpasningav fluorescens fargestoff metode for en face samtidig deteksjon og visualisering av intracellulær NO og O 2 .- ved hjelp av cellepermeable diaminofluorescein-2-diacetat (DAF-2DA) og dihydroethidium (DHE), respektivt, i intakte Aorta av en fedme musemodell som induseres av høy-fett-diett fôring. Vi kunne demonstrere redusert intracellulært NO og forbedret O 2 .- nivåer i de nylig isolerte intakte Aorta av fedme mus sammenlignet med kontrollgruppen mager musen. Vi viser at denne metoden er en enkel teknikk for direkte påvisning og visualisering av NO og O 2 .- i intakte blodårene og kan bli mye brukt for undersøkelse av endothelial (dys) -funksjonen under (physio) patologiske tilstander.

Introduction

De vaskulære endotelceller holde vaskulær funksjonell og strukturell integritet ved å slippe vasoaktive faktorer 1. Blant disse faktorene, endotel-avledede nitrogenoksid (NO) produksjon fra L-arginin via endotelial NO-syntase (eNOS) er den viktigste og best karakteriserte faktor i sirkulasjonsfysiologi 2. NO forårsaker avslapning av glatt muskulatur og inhiberer celleproliferasjon, hemmer blodplateaggregasjon og inflammatorisk celle adhesjon og infiltrasjon i subendotel plass, derfor beskyttelse mot vaskulær sykdom utvikling tre. Under mange fysiologiske og patologiske tilstander, inkludert aldring, høyt blodtrykk, diabetes, hyperlipidemi, etc., endotelial dysfunksjon kjennetegnet ved redusert NO biotilgjengelighet og øket O 2 .- produksjon er til stede og fremmer patogenesen av aterosklerose 2. Studier fra de siste årene viser at frakopling av eNOS er enviktig mekanisme for endotelial dysfunksjon, karakterisert ved at eNOS enzym genererer O 2 .- istedenfor NO, under de forskjellige nevnte forhold 1,4. Derfor analyse av endotelial funksjon, særlig endotelial NO-produksjon og O 2 .- generasjon er dreibar for eksperimentell forskning på kardiovaskulære sykdommer og komplikasjoner.

Det er mange arbeidsmåter som er utviklet for å analysere og måle NO-produksjon i biologiske prøver. På grunn av den ekstremt labile naturen av NO som lett oksyderes til NO2 - og NO 3 - med en halveringstid på 3 til 6 sek, er det vanskelig å måle NO direkte. Derfor bestemmelse av NO 2 - / NEI 3 - i fluidprøvene ble brukt som en indeks av NO frigitt fra celler eller vev 5. Selv om fremgangsmåten er forholdsvis enkel, idet fremgangsmåten er imidlertid eaSily påvirket av høy bakgrunn av det stabile NO2 - / NEI 3 - som inneholdes i oppløsningen. Fordi NO stimulerer løselig guanylatsyklase for å produsere syklisk guanosinmonofosfat (cGMP) 6, har den cellulært cGMP-nivået også blitt bestemt til å estimere NO frigivelse 7. Igjen, dette er en indirekte estimering og kan ikke være spesifikk, siden noen endotel-avledede faktorer slik som C-type natriuretisk peptid (CNP) kan også øke cGMP-nivåer gjennom aktivering av partikkelformig guanylatsyklase 8. NO er fremstilt fra L-arginin med generering av L-citrullin som et biprodukt 9, måling av L-citrullin produksjon er derfor også brukt som en indirekte metode for å estimere NO produksjon. De største ulempene med denne metoden er at det er radioaktivt og det ikke måle bioaktive INGEN nivåer, siden utgitt NO kunne raskt inaktivert av O 2 .-; Videre kan L-citrullin resirkuleres til L-arginin 10. Andre kjemiske metoder slik som kjemiluminescens deteksjon 11, elektronspinn-resonans 12, eller elektrokjemisk porphyrinic NO-sensor 13 blir brukt av flere forskere. Disse metodene er vanligvis ikke lett i drift, oppdager prosedyrer og krever spesialutstyr. Det er også å nevne at mange studier gjelder organbade eksperimenter med isolerte blodårer med eller uten endotelet å vurdere endotelfunksjon og indirekte måle endotel-avledet INGEN mediert vaskulære relaxations. Men denne fremgangsmåte, selv om det er mest i nærheten av fysiologisk situasjon, men strengt å si ikke måle noen funksjon, det heller vurderer endotel-mediert vasomotoriske responser generelt som reflekterer netto effekt av eNOS funksjon, produksjon av andre endotel-avledede avslappende faktorer og endotel-avledet kontrahering faktorer, produksjon av O 2 .-, og også responser av glatte muskelcellertil disse faktorene. En analyse av eNOS funksjon eller NO produksjonen er vanligvis nødvendig tre.

Mange forskningsgrupper inkludert vår har de siste årene brukt fluorescens fargestoff metoden for å oppdage intracellulær produksjon av NO 14-19. I denne fremgangsmåten cellepermeable fluorescens-indikator diaminofluorescein-2-diacetat (DAF-2DA) ble anvendt for å måle fri NO og NOS funksjon i levende celler og vev in vitro eller ex vivo. Prinsippet er at i levende celler, DAF-2DA deacetyleres av intracellulære esterase til ikke-fluorescerende 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) som deretter ble omdannet til fluorescerende DAF-2 triazol (DAF-2T) ved å reagere med NO . Fluorescensen fra DAF-2T kan iakttas under et fluorescens mikroskop eller et fluorescens konfokalt mikroskop 14. Den intracellulære fluorescens-intensitet gjenspeiler derfor den intracellulære NO-produksjon i cellene eller endotelet i en i intakt blod vessel. Kombinert med en spesifikk fluorescens fargestoff som dihydroethidium (DHE), kan man samtidig vurdere intracellulær NO og O 2 .- generasjon i cellene eller i blodårer 14. Tilsvarende er DHE også en celle-permeabel forbindelse som oksyderes ved O 2 .- inne i cellene, og den oksidative produkt deretter skytes inn med nukleinsyrer for å sende ut en lys rød farge påvises kvantitativt ved fluorescerende mikroskop eller fluorescens konfokalt mikroskop. DHE er en meget spesifikk fargestoff for påvisning av O 2 .- fra biologiske prøver, som den oppdager det vesentlige superoksidradikaler, fastholdes også av celler, og kan også tolerere mild fiksering 20. En av fordelene med denne fluorescens fargestoff metoden er at den detekterer og visualiserer NO og / eller O 2 .- en face direkte på intakt endotel-lag av et levende blodkar.

I denne utredningen,vi beskrive denne fluorescens fargestoff metoden for å oppdage NO og O 2 .- som vi har tilrettelagt for en ansiktsgjenkjenning av NO og O 2 .- i intakte Aorta av en fedme musemodell indusert av høy-fett-diett (HFD) fôring. Vi viser at denne metoden kan med hell og sikker måling av NO og O 2 .- nivåer og evaluere eNOS (dys) -funksjonen i endothelial laget av ferskt isolerte intakte muse Aorta i fedme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal arbeidet ble godkjent av etisk komité Veterinary Office of Fribourg, Sveits. Protokollen følger retningslinjer for dyr omsorg og eksperimentering ved vår institusjon.

1. Utarbeidelse av en Set-up for Inkubasjon av Isolated Arterier

  1. Konstruere et organbad system som kan varmes opp til 37 ° C og gjennomluftet med 95% O2 og 5% CO2 fra en gasstank karbon.
  2. Fremstille så mye Krebs-Ringer bikarbonat-buffer etter behov med konsentrasjonen av følgende sammensetning: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2PO 4, 25 mM NaHCO3, 0,026 mM EDTA og 11,1 mM D-glukose).
  3. Hold lager buffer på is og lufte buffer med 95% O 2 og 5% CO 2.
  4. Slå på organbadet system, stille inn temperaturen ved 37 ° C, tilsett 5 ml klar til bruk buffer til hvert kammerog holde lufte buffer med 95% O2 og 5% CO2.
  5. Vask kamrene gang med Krebs-Ringer-buffer i 30 min.
  6. Tilsett 5 ml Krebs-Ringer-buffer til hvert kammer og å dekke kammeret for å forhindre fordampning.

2. Isolering av Mouse Aorta

  1. Injiser pentobarbital som oppløses i 0,9% NaCl intraperitonealt ved en konsentrasjon på 150 mg / kg for å ofre musene.
  2. Lå musen supinely på et operasjonsbord.
  3. Spray pelsen av brystet regionen med 70% etanol i forbindelse med sanitering og fuktighet.
  4. Åpne brysthulen ved å kutte rundt ribben å avsløre hjertet og lungene, og fjerne lungene.
  5. Ta ut blod i brysthulen forsiktig av med et silkepapir.
  6. Ta tak i hjertet forsiktig med en pinsett og ta av thorakalaorta ved å kutte perivaskulær fettvev mellom aorta og ryggrad med kirurgisk saks.
  7. Umiddelbart fordype whole vev i iskald (4 ° C) Krebs-Ringer-buffer.
  8. Fjern hjertet og aortabuen under et mikroskop disseksjon og holde den torakale aorta-segmentet i bufferen.
  9. Dissekere aorta fri for å følge perivaskulær vevet under et mikroskop med kirurgiske saks og pinsett.
  10. Ta tak i enden kanten av aorta med en pinsett, og spyle bort blodet i vaskulære lumen ved forsiktig skylle Krebs-Ringer buffer med en 26 G × 1 / 2" sprøyte.
  11. Skjær de rensede Aortaringene til 3 mm lange segmenter.
    Merk: Vær oppmerksom på dette trinnet for å ikke skade endothelial lag.

3. DHE og DAF-2DA Farging

  1. Overfør de rensede aorta segmentene med en tang til organbadet kamre fylt med Krebs-Ringer-buffer ved 37 ° C gjennomluftet med 95% O2 og 5% CO2.
    Merk: Trykk bare adventitia siden av aorta ringer med pinsett og ikke klemme bLood fartøy.
  2. Stabilisere arteriene i organbadet kammer i 30 min.
  3. Legg acetylkolin (ACh) til organbadet for å sluttkonsentrasjonen 1 uM, og inkuber arteriene i 10 min.
  4. Forbered 1 ml DHE / DAF-2DA løsning (5 mM av hver farge, utvannet fra 1000 × lager) med forvarmet Krebs-Ringer buffer i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Pakk mikrosentrifugerør med aluminiumsfolie for å unngå lyseksponering.
  5. Etter stimulering, overføre aortaringer fra organbadet til DHE / DAF-2DA oppløsning i et mikro-sentrifugerør ved 37 ° C gjennomluftet med 95% O2 og 5% CO2 og inkuber aortaringer i 30 minutter.
    Merk: Fra dette trinnet, holde Aorta alltid i mørket.
  6. Overfør aortaringer i et nytt mikrosentrifugerør med Krebs-Ringer-buffer for vasking og gjenta vaske tre ganger i løpet av 1 min.
  7. Overfør Aortaringene til 4% paraformaldehyde løsning for fiksering for 30min.
  8. Fremstille en ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) oppløsning (300 nM, fortynnet fra 1000 x lager) med fosfatbufret saltvann (PBS) buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Counterstain de Aorta i 3 min.
  9. Overfør Aorta til nye mikrosentrifugerør med PBS-buffer for vasking i 1 min. Gjenta vaske tre ganger.
    Merk: Vær oppmerksom ikke å klemme Aortaringene eller skade endothelial lag.

4. En Face Monterings

  1. Tilsett en dråpe monteringsmedium til raset.
  2. Skjær Aortaringene lengderetningen med mikrokirurgiske saks henhold mikroskop, gjør de opprullede Aorta flat og montere den en face på montering medium med endotelet vendt ned på glasset lysbildet. Ikke flytt Aorta frem og tilbake.
  3. Dekk lysbilde med dekkglass og forsegle lysbilde med neglelakk.
  4. Etter lufttørking under lett beskyttelse, bruke lysbildene for avbildning directly i løpet av timer eller lagre dem ved -20 ° C i neste dagene.

5. Confocal Mikroskopisk Imaging

  1. Bruk en konfokal mikroskop for å oppdage fluorescens signaler. Slå på maskinen og optimalisere bildeinnstillinger som forstørrelse, skanning hastighet, oppløsning, Z-stack.
    1. For denne protokollen, bruker en 200 Hz skannehastighet, oppløsning på 1024 × 1024 piksler, og Z-trinnstørrelse på 0,25 mikrometer. Excite fluorescens fra DAF-2DA med 488 nm argon laser og oppdage på 515 nm, mens opphisse fluorescens fra DHE på 514 nm og oppdage på 605 nm emisjon.
  2. Bruk 10X forstørrelse til å fokusere på prøven før DAPI signalet er klar med ultrafiolette stråler, og deretter justere målet 40x forstørrelse.
  3. Definer utvalget av endothelial lag ved å justere Z posisjon på kontrollpanelet. Signalene av DAPI-farget kjerner er ovale eller runde prikker i endothelial lag.
  4. Skann fra toppen(Endoteliale lag på lumen kant) av prøven gjennom den fulle tykkelse av endoteliale signal og ta bilder. Velge minst 3 forskjellige felter for skanning av hver prøve.

6. Analyse av bilder

  1. Bruke programvare for å åpne data skannet av konfokal mikroskop. Velg tre etterfølgende bilder per felt for analyse og vurdere minst 3 ulike felt per prøve. Eksportere de valgte bildene og lagre dem som JPEG-filer.
  2. Kvantifisere bildene fra DAF-2DA, DHE og DAPI farging med bildebehandling. For bildet fra DAPI farging, velg 'Plugins' → 'Analyser' → 'celleteller "for å telle antall DAPI positive kjerne.
    1. For bildene fra DAF-2DA og DHE flekker, velg 'Analyser' → 'Mål' å analysere intensiteten av signalene, og ta "Mean 'verdi som den relative signalintensiteten. Presentere da resultatene som forholdet mellom DAF-2DA tilDAPI positive kjerner eller forholdet mellom DHE til DAPI. For hver prøve, kan den gjennomsnittlige verdien av hvert bilde og felt.
  3. Dele resultatet av hver prøve ved gjennomsnittet av kontrollgruppen for å få ganger endring. Statistisk analyse ble utført med uparede Student t-test eller ANOVA med Dunnett eller Bonferroni post-test. Gi data som middelverdi ± SEM. Vurdere forskjeller i gjennomsnittsverdiene som signifikant på p <0,05 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fedme er en viktig risikofaktor for iskemisk hjertesykdom og er assosiert med redusert endotelial NO biotilgjengelighet, et kjennetegn på aterosklerotisk karsykdom 21. eNOS-frakopling er blitt vist å være en viktig mekanisme for endotelial dysfunksjon i henhold til en rekke fysiologiske og patologiske tilstander, inkludert aldring 22, aterosklerose, fedme og 14. Derfor, her sammenligner vi mager og overvektige mus for å vise representativt resultat av NO og O 2 .- nivåer i Aorta.

Starter i en alder av 7 uker, ble den mannlige mus (C57BL / 6J) gitt fri adgang under 14 uker til enten en normal chow (NC, energiinnhold: 10,6% fett, 27,6% protein, og 57% karbohydrater, fiber 4,8% ) eller et fettrikt kosthold (HFD, energiinnhold: 55% fett, 21% protein og 24% karbohydrater). Etter 14 uker med HFD mus varofret og thorax Aorta ble dissekert, og renset for man følger vev. Før DAF-2DA og DHE flekker trinnet, eNOS-inhibitor LN G -Nitroarginine-metylester (L-NAME) (1 mM) ble tilsatt til badet kammeret i 1 time for å blokkere eNOS-aktivitet 14. De representative konfokalt fluorescens Resultatene er vist i figur 1. Den blå fargen i det øvre felt representerer kjernen av endoteliale celler farget med DAPI. I det midtre panelet er fargen grønn fluorescens signalet fra DAF-2T konvertert fra det ikke-fluorescerende DAF-2 av NO, som betyr at dersom intensiteten av grønt signal er høyere, er det mer NEI i cellene. Likeledes, den røde fargen i det nedre panel er fluorescens-signalet fra DHE oksyderes ved O 2 .-, slik at prøven som viser mer rød farge har flere O 2 .- i cellene.

Confocal fluorescens mikroskopi viste nedgangd NO-produksjon (DAF-2DA farging) og øket L-NAME-sensitive O 2 .- generasjon (DHE farging) i den aortiske endoteliale lag av musene tilført HFD i forhold til den av mus foret NC (figur 1) 14, tyder eNOS-frakobling i fedme. Signalene ble kvantifisert og presentert i søylediagrammer 14.

Figur 1
Figur 1. eNOS-frakobling i fedme. Confocal mikroskopisk no ansiktsgjenkjenning av NO og O 2 .- med henholdsvis DAF-2DA og DHE flekker,. n = 5; *** p <0,005 vs NC; ††† p <0,005 vs HFD gruppe. Scale bar = 0,1 mm. (Data var fra referanse 14) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Påvisning av NO eller O 2 .- med fluorescerende fargestoffer ble hyppig brukt i mange studier i dyrkede endotelceller og også i vev frysesnitt 23. Her utvidet vi denne metoden for å intakt levende blodkar, dvs. en face deteksjon av NO og O 2 .- nivåer i det endoteliale lag med DAF-2DA og DHE, henholdsvis, som er effektiv, relativt enkel og intuitiv. Sammenlignet med fremgangsmåten i vaskulære frysesnitt, viser denne metoden lavere bakgrunn, og er mer kvantitativ, ettersom elastiske fibre i mediene av en arterie særlig aorta i frysesnitt gir meget sterke autofluorescens signaler som kan redusere det spesifikke NO eller O 2. - signaler som frembringes i endotelceller. Videre kan spesifikke O 2 .- generering av NADPH oksidase eller andre enzymer i de mediale glatte muskelceller også forstyrremed signalene i endotelceller i det vaskulære seksjon, som representerer den ulempe at fremgangsmåten med vaskulære frysesnitt. I motsetning til dette, detekterer en face fargemetoden signaler spesifikt fra det endoteliale lag av et intakt blodkar segment og derfor gir mer presis analyse. En kryostat maskin for cryosection fremstilling er også en kostbar investering. Sammenligning med andre biokjemiske fremgangsmåter, er den viktigste begrensning av denne metoden er mindre kvantitativ, men det er et godt valg for relativ sammenligning mellom prøvene. Videre kan kravet om et konfokalt mikroskop som er dyrt også være en begrensning av metoden. Den multi-organ kammersystem er praktisk, og hvis dette ikke er tilgjengelig i laboratoriet, kan man lett etablere et system med vannbad og rør som er forbundet til et karbongasstank med reguleringssystemet, slik at blodårene i rørene holdt ved 37 ° C og gjennomluftet med 95% O2 og 5% CO

Det er flere viktige skritt som man må ta hensyn. Vær sikker på at perivaskulær vevet er renset for enkel montering. De blodpropper i vaskulære lumen må skylles vekk, fordi de kan forårsake kunstige signaler og forstyrrer fluorescens signaler. Under hele prosedyren av blodkar forberedelse, inkubasjon, vasking, skjæring og montering, må man være svært forsiktig for ikke å skade endothelial lag av blodkar. Ikke la blodåre tørr under hele prosedyren forberedelse. DHE og DAF-2DA er begge fluorescerende prober, så start fra farging trinnet de Aorta bør alltid beskyttes mot lys. Før fiksering trinn endotelcellene i Aorta må være levende, slik at Aorta bør alltid holdes i Krebs-Ringer-buffer gjennomluftet med 95% O2 og 5% CO2. Bilder av prøvene bør tas så snart som mulig etter tilberedning. den fluorescence signal vil bli svakere i løpet av få dager selv med beskyttelse av monteringsmedium, som kan påvirke nøyaktigheten av resultatene. Metoden kan ikke søke om blodårer med for tykk vaskulær vegg.

Denne fremgangsmåte muliggjør samtidig fantasi av NO og O 2 .- produksjon i det endoteliale lag av intakte blodkar, hvis de to fargestoffer ble tilsatt til blodkar sammen. Man kan også bruke denne metoden for å evaluere farmakologiske effekter av legemidler på NO og O 2 .- produksjon in vitro i isolerte blodkar. For dette formål blir den rensede aorta vanligvis skåret i to deler, en er for kontroll, og en annen er for behandling, og stoffet bør legges til inkuberingsbufferen etter likevektsinnstilling før DAF-2DA og DHE flekker trinn. Det er spesielt nyttig dersom denne metoden er brukt sammen med en annen metode, for eksempel, med analyse av vasomotoriske responser hos isolerte blod vessels, kan en fysiologisk funksjon av endotelceller bekreftes. Denne metoden skal også være egnet for analyse av eventuelle endothelial (dys) -funksjonen i intakte blodårene i sykdomsmodeller og de underliggende mekanismene.

I sammendraget, presenterte vi en enkel protokoll å samtidig oppdage NO og O 2 .- produksjon i endothelial lag med intakte blodkar med en fluorescens konfokal mikroskop. Vi viser hvordan denne metoden med hell jobbet i fedme musemodell. Denne metoden er en nyttig teknikk i etterforskningen av endotelial NO og O 2 .- produksjon under mange vaskulære sykdomstilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
  2. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  3. Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
  4. Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
  5. Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
  6. Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
  7. Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
  8. Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
  9. Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
  10. Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
  11. Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
  12. Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
  13. Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
  14. Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
  15. Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
  16. Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
  17. Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
  18. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
  19. Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
  20. Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
  21. Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
  22. Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
  23. Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).

Tags

Molecular Biology arterier konfokalmikroskopi DHE DAF-2DA endotelet nitrogenoksid superoksydanion Vascular Biology
<em>En Face</em> Detection av nitrogenoksid og Superoxide i endothelial lag av intakte Arterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P.,… More

Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter