Selektiv Høsting av Marginating-lunge Leukocytter

Summary

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Abstract

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Introduction

Leukocytter fester seg til kapillærene i lungene (dvs. marginating-lunge (MP) leukocytter) ¹ ble vises til å vise tydelig leukocytt sammensetning og unike aktivitet sammenlignet med leukocytter fra andre immun avdelinger (f.eks sirkulasjon, milt, benmarg) ^{2- 4.} For eksempel, MP-leukocytter oppviser høyere naturlige killer (NK) celler cytotoksisitet mot forskjellige tumorceller, sammenlignet med sirkulerende og milt NK-celler, så vel som differensiert budbringer RNA (mRNA) nivåer og økt utskillelse av pro- og anti-inflammatoriske cytokiner. Sammensetningen av celler er også differensieres fra sirkulerende leukocytter som MP-leukocytter har et høyere forhold av medfødt / adaptiv immunitet i forhold til sirkulerende leukocytter (50% vs 30%, respektivt). Målet med fremgangsmåten presentert heri er å muliggjøre selektiv høsting av MP-leukocytter, for å studere dette viktig og unikt immun kammer (cellepopulasjon), og for å elucIDATE effekten av ulike manipulasjoner (f.eks immunaktiverings) på disse spesifikke celler.

For å forstå betydningen av dette unike befolkning, er det viktig å være oppmerksom på at immunsystemet kan kontrollere sirkulerende tumorceller, mikrometastaser, og restsykdom ved in vivo funksjoner av cellemediert immunitet (CMI). Denne evnen er klart til tross for den presedens svikt i immunsystemet til å kontrollere den primære tumor, og støttet av god in vivo bevis i kreftpasienter og dyremodeller ^5. Viktigere, disse funnene er ofte uforenlig med in vitro og ex vivo studier som rapporterer at de fleste autologe tumorceller er motstandsdyktig mot cytotoksisitet av sirkulerende leukocytter i blodprøver fra mennesker og dyr (målt ved cytotoksisitetsassayer) ^6,7. Dette avviket kan tilskrives in vivo eksistensen av distinkte leukocyttpopulasjonene, slik som den tidligerenevnte MP leukocytter befolkningen, og spesielt dens undergruppe av aktiverte NK-celler ^3. Faktisk, syngeniske tumorceller (MADB106), som ble funnet å være motstandsdyktig mot sirkulerende leukocytter og milt, ble vist å bli lysert av MP-NK-celler ^3,8. Således er angivelig 'NK-resistente "MADB106 celler som metastaserer til lungene av fischer344 (F344) rotter styres av MP-NK-celler, men ikke ved å sirkulere eller milt NK-celler, som vanligvis studerte gitt sitt enkel tilgang.

Rensede og aktive MP-leukocytter ikke er tilgjengelige gjennom standardmetoder høsting av leukocytter fra lungene, som er basert på lungevev sliping eller biologisk nedbrytning ^9. Vår tilnærming har to viktige fordeler sammenlignet med vev prosesserings tilnærminger. Først perfusjon tilnærming selektivt høster MP-leukocytter, skille dem fra andre celler som kommer fra lungene parenkymatøs, interstitiell og bronkoøsofageal alveolar komparativereksjonene. For det andre, perfusjon teknikken bedre bevarer integriteten og den fysiologiske miljøet i MP-leukocytter, i motsetning til sliping og biologisk behandling tilnærminger som kan skade celler, endre deres morfologi, og indusere produksjon og frigjøring av ulike faktorer som modulerer immunaktivitet og spesielt undertrykke NK cytotoksisitet ^10.

Lungene er en viktig målorgan for kreftmetastaser og for forskjellige infeksjonssykdommer. Alle sirkulerende ondartede celler og infiserte celler passerer gjennom lungekapillærene, der de trenger å deformere og samhandle med kapillære endotelceller og bosatt leukocytter. Under disse forholdene, kan sirkulerende celler lett bli målrettet av fastboende MP-leukocytter. Det virker dermed biologisk fordel å ha aktiverte leukocytter i denne immunrommet, og det er viktig å studere dette unike MP-befolkningen i ulike biologiske, eksperimentelle og kliniske settinger. Det er verd å merke seg at systemic aktivering av immunsystemet ved hjelp av forskjellige biologisk-respons-modifiserende midler (for eksempel polyinosinic-polycytidylic syre (poly I: C) eller type-C CpG-oligodeoksynukleotider (CpG-C ODN)) har vist seg å aktivere MP-leukocytter mer enn sirkulerende leukocytter ^{3, 8,11.}

Protocol

Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Tel-Aviv University. 1. Rat Protocol Forberedelser Ordne 2 butterfly 21 G nåler. Eventuelt forberede 2 butte kanter butterfly 21 G kanyler ved å sende den skarpe kanten av nålen. Steril kirurgiske verktøy: 2 par saks, avstumpet kanter tang, pinsetten, tann-vev tang sterilisert av autoklav ved 121 ° C i minst 30 min på gravitasjon (tørr) innstilling. Forber…

Representative Results

MP-kupé utstillingen en annen leukocytt undergruppe sammensetning i forhold til sirkulerende leukocytter. Ved hjelp av flowcytometri analyse, ble leukocytter subpopulasjoner identifisert og kvantifisert å karakterisere sammensetningen av både sirkulerende og MP leukocytter. Granulocytter og lymfocytter ble identifisert basert på termin og side sprer. Innenfor lymfocytter, ble NKRP-1-lyse-celler er identifisert som NK-celler, som CD3 + T-celler, RM1 + …

Discussion

Fremgangsmåten som presenteres her muliggjør den selektive høsting og studere av den unike populasjon av MP-leukocytter. Sammenlignet med sirkulerende eller milt-leukocytter, er MP populasjonen kjennetegnet ved en tydelig sammensetning av leukocytt-subpopulasjoner, høyere aktiveringsnivå, høyere frigivelse av forskjellige cytokiner, og høyere mRNA-nivåer av pro- og anti-inflammatoriske cytokiner ^2,3. Nærmere bestemt har vi vist at MP-NK-celler er mer cytotoksisk enn sirkulasjons NK-celler, mot forskj…

Materials

Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26G
Butterfly needle	OMG		21G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free)	Sigma Aldrich