Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per lo screening di una libreria sgRNA heptamer-tipo per farmaci terapeutici potenziali contro i tumori del sangue.
Abstract
TRUE silenziamento genico (chiamato dopo tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silenziamento genico) è uno dei geni RNA-regia tacere tecnologie, che utilizza un artificiale piccola guida RNA (sgRNA) per guidare tRNA 3 'endoribonuclease elaborazione, tRNase Z L , di riconoscere un RNA bersaglio. sgRNAs possono essere presi dalle cellule senza reagenti di trasfezione e possono downregulate i loro livelli di RNA di riferimento e / o indurre l'apoptosi nelle cellule tumorali umane. Abbiamo verificato una libreria sgRNA contenente 156 heptamer tipo sgRNAs per l'effetto sulla vitalità delle cellule di mieloma e leucemia umana, e trovato che 20 di essi può efficientemente indurre apoptosi in almeno una delle linee di cellule di cancro. Qui vi presentiamo un protocollo per lo screening di una libreria sgRNA heptamer-tipo per farmaci terapeutici potenziali contro i tumori del sangue. Il protocollo comprende come costruire la libreria sgRNA, come valutare l'effetto di ogni sgRNA sulla vitalità delle cellule, e come further valutare le sgRNAs efficaci mediante citometria di flusso. Circa 2.000 colpi ci si aspetterebbe da versare lo screening della libreria sgRNA su vasta scala composta da 16.384 heptamers.
Introduction
TRUE silenziamento genico (denominato dopo tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silenziamento genico) è una delle tecnologie silenziamento genico RNA-diretto 1. Questa tecnologia è stata sviluppata sulla base di proprietà di tRNase Z L (o 3 'tRNase), tRNA 3' endoribonuclease lavorazione: può fendere qualsiasi RNA bersaglio in qualsiasi luogo previsto sotto la direzione di una guida piccoli RNA artificiale (sgRNA) riconoscendo un pre-tRNA-like o micro-pre-tRNA-come struttura formata tra l'RNA bersaglio e la sgRNA 2-9. sgRNA, che di solito è 7-31 nt di lunghezza, è classificato in quattro gruppi, 5'-mezzo-tRNA, RNA heptamer, 14-nt RNA lineare e RNA gancio.
Abbiamo dimostrato l'efficacia di TRUE silenziamento genico con l'introduzione di vari sgRNAs artificialmente progettati in cellule viventi 10-15. Abbiamo anche dimostrato che sgRNAs possono essere presi dalle cellule without eventuali reagenti di trasfezione e può downregulate i loro livelli di RNA di riferimento e / o indurre l'apoptosi nelle cellule tumorali umane 16 - 18. TRUE silenziamento genico sembra funzionare sul intracellulare e sistema di rete di regolazione genica intercellulare tramite tRNase Z L e sgRNAs naturali 19 - 21.
Abbiamo costruito una libreria sgRNA contenente 156 heptamer tipo sgRNAs per la ricerca di potenziali sgRNAs heptamer tipo terapeutici per i tumori del sangue 22. Abbiamo proiettato per l'effetto sulla vitalità delle cellule di mieloma e leucemia umana, e trovato che 20 di essi può efficientemente indurre apoptosi in almeno una delle linee di cellule di cancro. E 4 di loro hanno dimostrato di ridurre i tassi di crescita del tumore negli esperimenti di xenotrapianto del mouse.
Qui vi presentiamo un protocollo per lo screening di una libreria sgRNA heptamer-tipo per farmaci terapeutici potenziali contro i tumori del sangue. Il protocollo comprende comeper costruire la biblioteca sgRNA, come valutare l'effetto di ogni sgRNA sulla vitalità delle cellule, e come valutare ulteriormente le sgRNAs efficaci mediante citometria di flusso. Analisi per l'RNA bersaglio cellulare di sgRNA e la valutazione delle sgRNAs efficaci in modelli di xenotrapianto mouse possono essere eseguite secondo metodi convenzionali 17,22, anche se questi non sono inclusi in questo protocollo.
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Protocol
1. Costruzione di un Heptamer tipo sgRNA libreria
- Selezionare un sottoinsieme di 16.384 (4) 7 sequenze 7-NT a meno che la libreria di fondo scala deve essere costruito.
NOTA: Le sequenze possono essere casuale e / o progettati per indirizzare RNA cellulari specifici. Per questi ultimi, per strutture forcella simile al T-braccio tRNA in un RNA bersaglio con l'ausilio di un idoneo programma di computer e / o visivo, e selezionare le sequenze complementari a sequenze 7-nt immediatamente a valle delle strutture forcella 4,10, 17,18. - Sintetizzare ciascuno dei heptamers selezionati come completamente 2'- O -methylated, 5'- e 3'-RNA fosforilata con un sintetizzatore di DNA / RNA. Utilizzare il metodo fosforammidito sul vetro a pori controllati (CPG) di supporto, e lasciare la 5'-terminale 4,4'-dimethoxytrityl (DMT) gruppo protettore sulla nell'ultimo ciclo (l'aggiunta di fosfato al 5 ') della sintesi 23.
NOTA: sy personalizzatonthetic RNA può essere ottenuto anche da fornitori di oligonucleotidi. - Dopo il completamento dell'ultimo ciclo di sintesi, trasferire il CPG con l'oligonucleotide sintetizzato dalla colonna ad una fiala di vetro con tappo a vite di teflon-liner, aggiungere 1 ml di 29% di idrossido di ammonio, e incubare a 55 ° C per 8 ore per fendere l'oligonucleotide dalla CPG e rimuovere i gruppi protettivi dalle basi e fosfati.
- Evaporare idrossido di ammonio con un evaporatore centrifugo a 40 ° C e ri-sciogliere il oligonucleotide in 0,2 ml di 0,1 M n-hexylammonium acetato.
- Purificare il oligonucleotide sintetico attraverso fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione usando una colonna di polistirene-divinilbenzene con un tampone contenente 10-50% acetonitrile / 0,1 M n-hexylammonium acetato. Eseguire la colonna a 2,0 ml / min per 25 min a 80 ° C.
- Aggiungere 0,25-0,5 ml di acido acetico concentrato al campione frazionata (1-2 ml) per ottenere una soluzione al 20% di acido acetico, e incubate questa soluzione per 1 ora a temperatura ambiente per rimuovere il gruppo DMT.
- Essiccare il campione con un evaporatore centrifugo a 40 ° C, ri-sciogliere in idrossido di ammonio 1 ml di 29%, e incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere la catena laterale di fosfato al 5 '.
- Ridurre il volume (1 ml) del campione a circa 0,3 ml con un evaporatore centrifugo a 40 ° C.
- Dializzare campione intero concentrato contro acqua distillata (500 ml) utilizzando un tubo di dialisi di peso molecolare cut-off 1.000 a 4 ° C durante la notte.
- Trasferire il campione dializzato dal tubo di dialisi ad una provetta da 1,5 ml con una pipetta, asciugare con un evaporatore centrifugo a 40 ° C, e successivamente ri-sciogliere in acqua acqua per iniezione-grade, il cui volume dovrebbe essere abbastanza piccolo per ottenere una soluzione superiore a 100 mM.
- Misurare una densità ottica del campione di RNA a 260 nm con uno spettrofotometro e regolarne la concentrazione 100micron con l'aggiunta di acqua acqua-per-iniezione-grade. Conservare la soluzione di RNA al di sotto dei -20 ° C prima dell'uso.
2. Proiezione della Biblioteca sgRNA per vitalità cellulare
- Preparare 10 3 cellule / 99 ul / pozzetto (ad esempio, HL60 e RPMI-8226) su un piatto a 96 pozzetti in mezzi RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% e la soluzione di penicillina-streptomicina 1%. Preparare pozzetti contenenti i media solo per sottrazione del fondo. Per eliminare gli effetti di bordo, aggiungere acqua sterile per svuotare i pozzi che circondano i pozzetti dei campioni.
- Aggiungere 1 ml di heptamer-tipo sgRNA (100 micron) disciolto in acqua acqua-per-iniezione-grade in ciascun pozzetto. Analizzare ogni sgRNA in triplice copia. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore umidificato per 3 giorni.
- Aggiungere un volume appropriato di soluzione commercialmente disponibile WST-8 in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C nella stessa incubatore per 1 a 4 ore.
- Misurare l'assorbanza di unT 450 nm con un lettore di micropiastre.
NOTA: Nella maggior parte dei casi, la linearità tra assorbanza e il numero di cellule vitali sembra essere mantenuto a meno che il valore di assorbanza supera 1,0.
3. Valutazione di effettiva sgRNAs mediante citometria di flusso
- Preparare 10 3 cellule / 99 ul / pozzetto (ad esempio, HL60) su un piatto a 96 pozzetti in mezzi RPMI-1640 integrato con siero fetale bovino al 10% e la soluzione di penicillina-streptomicina 1%. Preparare almeno 10 pozzetti per una sgRNA da testare. Per eliminare gli effetti di bordo, aggiungere acqua sterile per svuotare i pozzi che circondano i pozzetti dei campioni.
- Aggiungere 1 ml di heptamer-tipo sgRNA (100 micron) disciolto in acqua acqua-per-iniezione-grade in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore umidificato per 3 giorni.
- Raccogliere le cellule trattate con la stessa sgRNA da almeno 10 pozzetti in una provetta a 5 ml con una pipetta. Spin la provetta per 5 minuti in una centrifuga a 300 xg, e scartare i media.
- Aggiungere 2 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS) per il tubo, e risospendere le cellule. Spin la provetta per 5 minuti in una centrifuga a 300 xg, e scartare PBS. Aggiungere 150 ml di 1x annessina V tampone di legame al tubo, e risospendere le cellule.
- Aggiungere 2 ml di ficoeritrina (PE) coniugata soluzione annessina V e 1 ml di soluzione di 7-aminoactinomycin D (7AAD) al tubo, mescolarle bene e incubare la provetta per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Analizzare il campione utilizzando un citofluorimetro 24.
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Representative Results
I sei heptamer tipo sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), e 5'-CACCAGC-3' (H13260) sono stati sintetizzati chimicamente come 2'- O metil RNA contenente 5'- e 3'-fosfati.
Questi sgRNAs sono stati esaminati per gli effetti sulla vitalità di una linea cellulare di leucemia umana, HL60, e una linea cellulare di mieloma umano, RPMI-8226. Risultati rappresentativi dei saggi di vitalità cellulare sono mostrati in Figura 1. I quattro sgRNAs H1885, H3277, H10927 e H13260 erano molto efficaci e riducono la vitalità delle cellule HL60 e RPMI-8226 da> 80% e> 70%, rispettivamente. I heptamers H3277 e H10927 sono stati testati anche per gli effetti sulla non-cancerosa vitalità delle cellule HEK293, e hanno dimostrato di poco affect della vitalità cellulare 22.
La citometria a flusso con annessina V e 7AAD doppia colorazione è stata effettuata per HL60 cellule trattate con il heptamer H1885, H3277, H10927, H13260 o. In ogni sgRNA, un numero di cellule totale (56-95%) di inizio e fine fase di apoptosi era molto più alto di quello (4-6%) nel finto (Figura 2). Queste osservazioni suggeriscono che la riduzione della vitalità cellulare HL60 è dovuta ad apoptosi.
Figura 1. analisi della vitalità cellulare. La vitalità cellulare è stata misurata 72 ore dopo HL60 cellule (A) o cellule RPMI-8226 (B) sono state coltivate in assenza o in presenza di 1 micron di nudo heptamer-tipo sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287, H13260 o. I numeri relativi cellula vivente, in assenza di sgRNAs vengono regolati a 100. Errorebarre indicano SD (n = 3). *, P <0,002. Ristampato da leucemia Research, vol. 38, Takahashi M. et al., Proiezione di una biblioteca sgRNA heptamer-tipo per potenziali agenti terapeutici contro neoplasie ematologiche, pp 808-815, fig. 1, Copyright (2014), con il permesso di Elsevier. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. citometria a flusso. Per quanto riguarda le cellule HL60, citometria a flusso è stata eseguita con annessina V e 7AAD doppia colorazione. Le cellule sono state analizzate 72 ore dopo coltivate in assenza o presenza di 1 mM di nudo heptamer tipo sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A), o H10927 (B). Ristampato da leucemia Research, vol. 38, Takahashi M. et al., Proiezione di una biblioteca sgRNA heptamer-tipo per potenziali agenti terapeutici contro neoplasie ematologiche, pp 808-815, fig. 2, Copyright (2014), con il permesso di Elsevier. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da adattabile e senza soluzione di continuità la tecnologia dei programmi di trasferimento attraverso la R & S, il Giappone Scienza e tecnologia Agenzia, il Fondo di promozione di ricerca di scienza dalla Promozione e l'aiuto reciproco Corporation per Private Schools of Japan target-driven, e il numero JSPS KAKENHI sovvenzione 24.300.342 e 15H04313 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
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