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Medicine

TRUE Gene Silencing: Projection d'un heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer

doi: 10.3791/53879 Published: June 2, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole de criblage d'une banque d'ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang.

Abstract

Silençage génique TRUE (appelé après tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silençage génique) est un gène d'ARN dirigée silencing technologies, qui utilise un petit ARN guide artificiel (ARN sg) pour guider ARNt 3 «traitement endoribonucléase, tRNase ZL de reconnaître un ARN cible. sgRNAs peuvent être absorbés par les cellules sans réactifs de transfection et peuvent réguler négativement les taux d'ARN cible et / ou induire l'apoptose dans les cellules cancéreuses humaines. Nous avons criblé une bibliothèque contenant ARNsg 156 sgRNAs type heptamère de l'effet sur la viabilité des cellules de myélome et de leucémie humaine, et ont découvert que 20 d'entre eux peuvent efficacement induire une apoptose dans au moins une des lignées cellulaires du cancer. Nous présentons ici un protocole de criblage d'une banque d'ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Le protocole comprend comment construire la bibliothèque ARNsg, comment évaluer l'effet de chaque ARN sg sur la viabilité cellulaire, et comment fucomplémen évaluer les sgRNAs efficaces par cytométrie de flux. Environ 2.000 résultats seraient censés être obtenus par criblage de la banque d'ARN sg pleine échelle composée de 16.384 heptamères.

Introduction

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Silençage génique TRUE (appelé après tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silençage génique) est l' une des technologies de silençage génique ARN-1. Cette technologie a été développée en fonction des propriétés de tRNase Z L (ou 3 'tRNase), ARNt 3' traitement endoribonucléase: il peut cliver tout ARN cible sur un site prévu sous la direction d'un petit ARN guide artificiel (ARNsg) en reconnaissant un structure pré-ARNt ou un micro-pré-ARNt formé entre l'ARN cible et l'ARN sg 2-9. ARNsg, qui est habituellement 7-31 nt de long, sont classées en quatre groupes, 5'-demi-ARNt, l'ARN heptamère, un ARN linéaire 14-nt, et de l'ARN du crochet.

Nous avons démontré l'efficacité de silençage génique TRUE en introduisant divers sgRNAs artificiellement conçus dans des cellules vivantes 10 - 15. Nous avons également montré que sgRNAs peuvent être absorbés par les cellules wiThoout tous les réactifs de transfection et peuvent réguler négativement les taux d'ARN cible et / ou induire l' apoptose dans les cellules cancéreuses humaines 16 - 18. Silençage génique TRUE semble fonctionner sur le intracellulaire et le gène intercellulaire système de réseau de régulation via tRNase Z L et sgRNAs naturelles 19 - 21.

Nous avons construit une bibliothèque ARNsg contenant 156 sgRNAs de type heptamère pour rechercher thérapeutiques sgRNAs potentiels de type heptamère pour les cancers du sang 22. Nous avons criblé pour l'effet sur la viabilité des cellules de myélome et de leucémie humaine, et ont découvert que 20 d'entre eux peuvent efficacement induire une apoptose dans au moins une des lignées cellulaires du cancer. Et 4 d'entre eux ont été montré pour réduire les taux de croissance de la tumeur dans les expériences de xénogreffe de souris.

Nous présentons ici un protocole de criblage d'une banque d'ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Le protocole comprend commentpour construire la bibliothèque ARNsg, comment évaluer l'effet de chaque ARN sg sur la viabilité cellulaire, et la façon d'évaluer davantage les sgRNAs efficaces par cytométrie en flux. Analyse pour ARN cibles cellulaires de ARNsg et l' évaluation des sgRNAs efficaces dans des modèles de xénogreffes de souris peuvent être effectuées selon des méthodes classiques 17,22, bien que ceux - ci ne sont pas inclus dans ce protocole.

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Protocol

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1. Construction d'un type heptamère ARNsg Library

  1. Sélectionnez un sous - ensemble des 16.384 (4) 7 séquences 7 nt moins que la bibliothèque à grande échelle doit être construite.
    NOTE: Les séquences peuvent être aléatoires et / ou conçu pour cibler des ARN cellulaires spécifiques. Pour ce dernier, trouver des structures en épingle à cheveux ressemblant à la T-bras de l' ARNt dans un ARN cible à l'aide d'un programme approprié d'ordinateur et / ou visuellement, et sélectionnez des séquences complémentaires de séquences 7 nt immédiatement en aval des structures en épingle à cheveux 4,10, 17,18.
  2. Synthétiser chacun des heptamères sélectionnés comme entièrement 2'O -methylated, 5 'et 3' de l' ARN-phosphorylée avec un synthétiseur d' ADN / ARN. En utilisant la méthode au phosphoramidite sur le verre à pores contrôlés (CPG) de soutien, et de laisser de l'extrémité 5 4,4'-diméthoxytrityle (DMT), le groupe protecteur dans le dernier cycle (l'ajout de phosphate 5 ') de la synthèse, 23.
    REMARQUE: sy personnaliséenthetic ARN peut également être obtenu auprès de fournisseurs d'oligonucléotides.
  3. Après l'achèvement du dernier cycle de synthèse, transférer la CPG avec l'oligonucléotide synthétisé à partir de la colonne dans un flacon en verre avec un capuchon vissé en téflon-liner, ajouter 1 ml de 29% d'hydroxyde d'ammonium et incuber à 55 ° C pendant 8 h à cliver l'oligonucléotide de la CPG et éliminer les groupes protecteurs des bases et des phosphates.
  4. Evaporer l'hydroxyde d'ammonium avec un évaporateur centrifuge à 40 ° C et re-dissoudre l'oligonucléotide dans 0,2 ml de 0,1 M de n-hexylammonium acétate d'éthyle.
  5. On purifie l'oligonucléotide synthétique par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse en utilisant une colonne de polystyrène-divinylbenzène avec un tampon contenant 10-50% d'acétonitrile / 0,1 M d'acétate de n-hexylammonium. Exécutez la colonne à 2,0 ml / min pendant 25 min à 80 ° C.
  6. Ajouter 0,25-0,5 ml d'acide acétique concentré à l'échantillon fractionné (1-2 ml) pour préparer une solution d'acide acétique à 20% et incubate cette solution pendant 1 h à température ambiante pour éliminer le groupe DMT.
  7. Sécher l'échantillon dans un évaporateur centrifuge à 40 ° C, re-dissoudre dans 1 ml de 29% d'hydroxyde d'ammonium, et incuber la solution pendant 15 min à température ambiante pour éliminer la chaîne latérale du phosphate 5 '.
  8. Réduire le volume (1 ml) de l'échantillon à environ 0,3 ml avec un évaporateur centrifuge à 40 ° C.
  9. Dialyser l'ensemble de l'échantillon concentré à l'eau distillée (500 ml) en utilisant un tube de dialyse ayant une masse moléculaire de coupure de 1 000 à 4 ° C pendant une nuit.
  10. Transférer l'échantillon dialysé à partir du tube de dialyse dans un tube de 1,5 ml avec une pipette, sécher avec un évaporateur centrifuge à 40 ° C, puis re-dissoudre dans l'eau de l'eau pour injection de qualité, dont le volume devrait être suffisamment petit pour obtenir une solution supérieure à 100 uM.
  11. Mesurer une densité optique de l'échantillon d'ARN à 260 nm avec un spectrophotomètre et d'ajuster sa concentration à 100iM par addition d'eau de l'eau pour injection de qualité. Conserver la solution d'ARN au-dessous de -20 ° C avant utilisation.

2. Projection de la Bibliothèque ARNsg pour la viabilité cellulaire

  1. Préparer 10 3 cellules / 99 ul / puits (par exemple, HL60 et le milieu RPMI-8226) sur un plat de 96 puits dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum de fœtus bovin et une solution de pénicilline-streptomycine 1%. Préparer les puits contenant les médias que pour la soustraction de fond. Pour éliminer les effets de bord, ajouter de l'eau stérile pour vider les puits entourant les puits d'échantillon.
  2. Ajouter 1 pl de type heptamère ARNsg (100 uM) dissous dans l'eau de l'eau pour injection de qualité à chaque puits. Doser chaque ARNsg en triple. Incuber la plaque à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 humidifiée pendant 3 jours.
  3. Ajouter un volume approprié d'un WST-8 solution disponible dans le commerce dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans le même incubateur pendant 1 à 4, h.
  4. Mesurer l'absorbance d'unt 450 nm avec un lecteur de microplaque.
    NOTE: Dans la plupart des cas, la linéarité entre l'absorbance et le nombre de cellules viables semble être maintenu à moins que la valeur d'absorbance dépasse 1,0.

3. Évaluation des sgRNAs efficace par cytométrie de flux

  1. Préparer 10 3 cellules / 99 ul / puits (par exemple, HL60) sur un plat de 96 puits dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum de fœtus bovin et une solution de pénicilline-streptomycine 1%. Préparer au moins 10 puits pour une ARN sg à tester. Pour éliminer les effets de bord, ajouter de l'eau stérile pour vider les puits entourant les puits d'échantillon.
  2. Ajouter 1 pl de type heptamère ARNsg (100 uM) dissous dans l'eau de l'eau pour injection de qualité à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 humidifiée pendant 3 jours.
  3. Recueillir les cellules traitées avec le même ARN sg d'au moins 10 puits dans un tube de 5 ml avec une pipette. Spin le tube pendant 5 min dans une centrifugeuse à 300 xg, et jeter les médias.
  4. Ajouter 2 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS) pour le tube et remettre en suspension les cellules. Spin le tube pendant 5 min dans une centrifugeuse à 300 xg et jeter PBS. Ajouter 150 pi de tampon de liaison 1x annexine V dans le tube, et remettre en suspension les cellules.
  5. Ajouter 2 pl de phycoérythrine (PE) conjugué avec la solution de l'annexine V et 1 pi de 7-aminoactinomycine D (7AAD) solution au tube, mélangez-les bien, et incuber le tube pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité. Analyser l'échantillon en utilisant un cytomètre de flux 24.

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Representative Results

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Les six sgRNAs type heptamère 5 'AUCUUCA-3' (H1885), 5'-ACACACA-3 '(H3277), 5'-GGGGGCG-3' (H10927), 5'-GGGGCCC-3 '(H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287) et 5'-CACCAGC-3' (H13260) ont été synthétisés chimiquement comme 2'- O -méthyl contenant de l' ARN 5 'et 3' des phosphates.

Ces sgRNAs ont été examinés pour leurs effets sur la viabilité d'une lignée cellulaire humaine de leucémie, HL60, et une lignée cellulaire de myélome humain RPMI-8226. Les résultats représentatifs des essais de viabilité cellulaire sont représentés sur la figure 1. Les quatre sgRNAs H1885, H3277, H10927 et H13260 ont été très efficaces et ont réduit la viabilité des cellules HL60 et des cellules RPMI-8226 par> 80% et> 70%, respectivement. Les heptamères H3277 et H10927 ont également été testés pour les effets sur les cellules non-cancéreuses viabilité des cellules HEK293, et se sont révélés peu affect la 22 viabilité des cellules.

La cytométrie en flux avec de l'annexine V et 7AAD double coloration a été réalisée pour les cellules HL60 traitées avec l'heptamère H1885, H3277, H10927 ou H13260. Dans chaque ARNsg, un nombre total de cellules (56-95%) dans les stades apoptotiques précoces et tardives était beaucoup plus élevé que celui (4-6%) dans la maquette (Figure 2). Ces observations suggèrent que la réduction de la viabilité des cellules HL60 est due à l'apoptose.

Figure 1
Figure 1. Les dosages de la viabilité cellulaire. La viabilité des cellules a été mesurée 72 heures après les cellules HL60 (A) ou de cellules RPMI-8226 (B) ont été cultivées en l'absence ou en présence de 1 pM de l'heptamère de type nu ARNsg H1885, H3277, H10927, H10944, H12287, H13260 ou. Les nombres relatifs de cellules de vie en l'absence de sgRNAs sont ajustés à 100. Erreurles barres indiquent l'écart type (n = 3). *, P <0,002. Reproduit de recherche sur la leucémie, Vol. 38 Takahashi M. et al., Le criblage d'une banque d'ARN sg de type heptamère d'agents thérapeutiques potentiels contre les tumeurs malignes hématologiques, pp 808-815, Fig. 1, le droit d' auteur (2014), avec la permission de Elsevier. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. cytométrie de flux. En ce qui concerne les cellules HL60, par cytométrie de flux a été réalisée avec l' annexine V et 7AAD double coloration. Les cellules ont été analysées 72 heures après la culture en l'absence ou en présence de 1 pM de l'heptamère de type nu ARNsg H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A) ou H10927 (B). Reproduit de recherche sur la leucémie, Vol. 38, Takahashi , M. et al., Le criblage d'une banque d'ARN sg de type heptamère d'agents thérapeutiques potentiels contre les tumeurs malignes hématologiques, pp 808-815, Fig. 2, le droit d' auteur (2014), avec la permission de Elsevier. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Programme de transfert Adaptable et de la technologie Seamless par la R & D, la technologie Agence japonaise pour la science et le Fonds de promotion de la recherche en sciences de la Société de promotion et d'aide mutuelle pour les écoles privées du Japon Target-driven, et les numéros JSPS KAKENHI Grant 24300342 et 15H04313 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom heptamer RNA Nippon Bioservice
OligoSep Prep HC Cartridge Transgenomic 99-3860
Water-for-injection-grade Water Otsuka Pharmaceutical  7131400A2129
RPMI-1640 medium Wako 189-02025
Fetal Bovine Serum SIGMA-ALDRICH 172012-500ML
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai Tesque 26253-84
96 Well Plate Greiner Bio-one 655 180
Cell Counting Kit-8 DOJINDO 343-07623 WST-8 solution
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R TEKAN 510-82851
FACS Round-Bottom Tube BD Falcon 60819-820
Phosphate Buffered Saline SIGMA-ALDRICH P7059-1L
PE Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 51-66121E
PE Annexin V BD Biosciences 51-65875X
7AAD SIGMA-ALDRICH A9400-1MG
Flow Cytometer, FACSCalibur BD Biosciences 342973

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References

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TRUE Gene Silencing: Projection d&#39;un heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer
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Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).More

Haino, A., Ishikawa, T., Seki, M., Nashimoto, M. TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (112), e53879, doi:10.3791/53879 (2016).

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