Summary
Aquí se presenta un protocolo para la detección de una biblioteca de tipo sgRNA heptámero para posibles fármacos terapéuticos contra cánceres de la sangre.
Abstract
Silenciamiento génico TRUE (denominado después tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silenciamiento génico) es uno del gen dirigida por ARN silenciar tecnologías, que utiliza una guía de pequeño artificial ARN (sgRNA) para guiar endoribonuclease procesamiento de tRNA 3 ', tRNase Z L , para reconocer un ARN diana. sgRNAs pueden ser absorbidos por las células sin reactivos de transfección y se pueden regular a la baja los niveles de ARN diana y / o inducir la apoptosis en células de cáncer humano. Hemos proyectado una biblioteca sgRNA que contiene 156 sgRNAs de tipo heptámero para el efecto sobre la viabilidad de células de mieloma y leucemia humana, y se encontró que 20 de ellos puede inducir eficazmente la apoptosis en al menos una de las líneas celulares de cáncer. Aquí se presenta un protocolo para la detección de una biblioteca de tipo sgRNA heptámero para posibles fármacos terapéuticos contra cánceres de la sangre. El protocolo incluye la forma de construir la biblioteca sgRNA, la forma de evaluar el efecto de cada sgRNA sobre la viabilidad celular, y cómo further evaluar los sgRNAs eficaces por citometría de flujo. Se esperaría que alrededor de 2.000 accesos a ser obtenido mediante el cribado de la biblioteca sgRNA a gran escala compuesta de 16.384 heptamers.
Introduction
Silenciamiento génico TRUE (denominado después tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silenciamiento génico) es una de las tecnologías de silenciamiento génico dirigidas por ARN 1. Esta tecnología ha sido desarrollada en base a las propiedades de tRNase Z L (o 3 'tRNase), tRNA 3' endorribonucleasa procesamiento: se puede escindir cualquier ARN diana en cualquier sitio de espera bajo la dirección de un guía pequeña artificial ARN (sgRNA) mediante el reconocimiento de una pre-tRNA-como o micro-pre-tRNA-como estructura formada entre el ARN diana y la sgRNA 2-9. sgRNA, que es por lo general 7-31 nt de longitud, se clasifica en cuatro grupos, 5'-media-tRNA, ARN heptámero, ARN lineal 14-nt, y ARN gancho.
Hemos demostrado la eficacia del silenciamiento génico TRUE mediante la introducción de diversos sgRNAs diseñados artificialmente en las células vivas 10-15. También hemos demostrado que sgRNAs pueden ser absorbidos por las células wiThout cualquier reactivo de transfección y se puede regular a la baja los niveles de ARN diana y / o inducir la apoptosis en células de cáncer humano 16 - 18. TRUE silenciamiento génico parece funcionar en el intracelular y el sistema de red de regulación de genes intercelular a través de tRNase Z L y sgRNAs naturales 19 - 21.
Hemos construido una biblioteca que contiene 156 sgRNA sgRNAs de tipo heptámero para buscar potenciales sgRNAs de tipo heptámero terapéuticas para el cáncer de la sangre 22. Hemos proyectado que para el efecto sobre la viabilidad de células de mieloma y leucemia humana, y se encontró que 20 de ellos puede inducir eficazmente la apoptosis en al menos una de las líneas celulares de cáncer. Y 4 de ellos se han demostrado reducir las tasas de crecimiento de tumores en experimentos de xenoinjertos de ratón.
Aquí se presenta un protocolo para la detección de una biblioteca de tipo sgRNA heptámero para posibles fármacos terapéuticos contra cánceres de la sangre. El protocolo incluye la formapara construir la biblioteca sgRNA, la forma de evaluar el efecto de cada sgRNA sobre la viabilidad celular, y la forma de evaluar más a fondo las sgRNAs eficaces mediante citometría de flujo. Análisis de los ARN diana celular de sgRNA y evaluación de sgRNAs eficaces en modelos de xenoinjertos de ratón se pueden realizar de acuerdo con métodos convencionales 17,22, aunque éstos no están incluidos en este protocolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Construcción de un tipo heptámero sgRNA Biblioteca
- Seleccionar un subconjunto de los 16.384 (4) 7 7-nt secuencias a menos que la biblioteca a gran escala se va a construir.
NOTA: Las secuencias pueden ser al azar y / o diseñado para atacar los ARN celulares específicos. Para este último, encontrar estructuras de horquilla se asemeja a la T-brazo de tRNA en un ARN diana con la ayuda de un programa apropiado de ordenador y / o visualmente, y seleccionar las secuencias complementarias a las secuencias 7-nt inmediatamente aguas abajo de las estructuras de horquilla 4,10, 17,18. - Sintetizar cada uno de los heptamers seleccionados como totalmente 2'- O -methylated, 5 'y 3' de ARN-fosforilado con un sintetizador de ADN / ARN. Utilice el método de la fosforamidita en el cristal de poro controlado (CPG) de apoyo, y dejar el terminal 5 'de 4,4'-dimetoxitritilo (DMT) grupo protector en en el último ciclo (la adición de fosfato de la 5') de la síntesis 23.
NOTA: sy personalizadanthetic ARN también puede obtenerse de los proveedores de oligonucleótidos. - Después de la finalización del último ciclo de síntesis, la transferencia de la GPC con el oligonucleótido sintetizado a partir de la columna a un vial de vidrio con un tapón de rosca de teflón-liner, añadir hidróxido de amonio 1 ml de 29%, y se incuba que a 55 ° C durante 8 horas a escindir el oligonucleótido de la GPC y eliminar los grupos protectores de las bases y fosfatos.
- Evaporar hidróxido de amonio con un evaporador centrífugo a 40 ° C y re-disolver el oligonucleótido en 0,2 ml de 0,1 M n-hexilamónica de etilo.
- Se purifica el oligonucleótido sintético a través de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa usando una columna de poliestireno-divinilbenceno con un tampón que contiene 10 a 50% de acetonitrilo / M de acetato de 0,1 n-hexilamónica. Ejecutar la columna a 2,0 ml / min durante 25 min a 80 ° C.
- Añadir 0,25-0,5 ml de ácido acético concentrado a la muestra fraccionada (1-2 ml) para hacer una solución de ácido acético al 20%, y INCUBAte esta solución durante 1 hora a temperatura ambiente para eliminar el grupo DMT.
- Secar la muestra con un evaporador centrífugo a 40 ° C, re-disuelve en hidróxido de amonio 1 ml de 29%, e incubar la solución durante 15 min a temperatura ambiente para eliminar la cadena lateral de fosfato 5 '.
- Reducir el volumen (1 ml) de la muestra a aproximadamente 0,3 ml con un evaporador centrífugo a 40 ° C.
- Se dializa la muestra entera se concentró frente a agua destilada (500 ml) usando un tubo de diálisis de corte de peso molecular de 1000 a 4 ° C durante la noche.
- Transferir la muestra dializada a partir del tubo de diálisis a un tubo de 1,5 ml con una pipeta, secarla con un evaporador centrífugo a 40 ° C y, posteriormente, volver a disolver en agua el agua para inyección de calidad, el volumen de los cuales debe ser lo suficientemente pequeño para hacer una solución mayor que 100 mM.
- Medir una densidad óptica de la muestra de ARN a 260 nm con un espectrofotómetro y ajustar su concentración a 100M mediante la adición de agua de agua para inyección de grado. Almacenar la solución de ARN por debajo de -20 ° C antes de su uso.
2. Proyección de la Biblioteca sgRNA para la viabilidad celular
- Preparar 10 3 células / 99 l / pocillo (por ejemplo, HL60 y RPMI-8226) en una placa de 96 pocillos en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y solución de penicilina-estreptomicina al 1%. Preparar los pocillos que contienen los medios de comunicación sólo para la sustracción de fondo. Para eliminar los efectos de borde, añadir agua estéril para vaciar pozos que rodean a los pocillos de muestra.
- Añadir 1 l de tipo heptámero sgRNA (100 mM) disuelto en agua de agua para inyección de calidad a cada pocillo. Cada ensayo sgRNA por triplicado. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora humidificada 5% de CO 2 durante 3 días.
- Añadir un volumen apropiado de una solución disponible en el mercado WST-8 a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en la misma incubadora durante 1-4 hr.
- Medir la absorbancia de unaT 450 nm con un lector de microplacas.
NOTA: En la mayoría de los casos, la linealidad entre la absorbancia y el número de células viables parece mantenerse a menos que el valor de absorbancia superior a 1,0.
3. Evaluación de sgRNAs eficaz por Citometría de Flujo
- Preparar 10 3 células / 99 l / pocillo (por ejemplo, HL60) en un plato de 96 pocillos en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y solución de penicilina-estreptomicina al 1%. Preparar al menos 10 pozos para una sgRNA a ensayar. Para eliminar los efectos de borde, añadir agua estéril para vaciar pozos que rodean a los pocillos de muestra.
- Añadir 1 l de tipo heptámero sgRNA (100 mM) disuelto en agua de agua para inyección de calidad a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora humidificada 5% de CO 2 durante 3 días.
- Recoger las células tratadas con el mismo sgRNA de al menos 10 pozos en un tubo de 5 ml con una pipeta. Girar el tubo durante 5 minutos en una centrífuga a 300 x g, y desechar los medios de comunicación.
- Añadir 2 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) al tubo, y volver a suspender las células. Girar el tubo durante 5 minutos en una centrífuga a 300 x g, y desechar PBS. Añadir 150 ml de tampón de unión 1x anexina V al tubo, y volver a suspender las células.
- Añadir 2 l de ficoeritrina (PE) conjugado con solución de anexina V y 1 l de 7-aminoactinomicina D (7AAD) solución al tubo, mezclar bien, y se incuba el tubo durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Analizar la muestra utilizando un citómetro de flujo 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los seis sgRNAs de tipo heptámero 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287), y 5'-CACCAGC-3' (H13260) se sintetizaron químicamente como 2'- O -metil ARN que contiene 5'-y 3'-fosfatos.
Estos sgRNAs se examinaron para determinar los efectos sobre la viabilidad de una línea celular de leucemia humana, HL60, y una línea celular de mieloma humano, RPMI-8226. Los resultados representativos de los ensayos de viabilidad celular se muestran en la Figura 1. Los cuatro sgRNAs H1885, H3277, H10927, H13260 y eran muy eficaces y la reducción de la viabilidad de las células HL60 y RPMI-8226 por> 80% y> 70%, respectivamente. Los heptamers H3277 y H10927 también se ensayaron para los efectos sobre la no canceroso viabilidad de las células HEK293, y se ha demostrado que apenas affect la viabilidad celular 22.
La citometría de flujo con anexina V y 7AAD doble tinción se realizó para las células HL60 tratadas con el heptámero H1885, H3277, H10927, H13260 o. En cada sgRNA, un número total de células (56-95%) en las etapas apoptóticas tempranas y tardías era mucho más alto que el (4-6%) en la maqueta (Figura 2). Estas observaciones sugieren que la reducción de la viabilidad celular HL60 es debido a la apoptosis.
Figura 1. Ensayos de viabilidad celular. La viabilidad celular se midió 72 horas después de las células HL60 (A) o células RPMI-8226 (B) se cultivaron en ausencia o presencia de 1 M de al desnudo heptámero de tipo sgRNA H1885, H3277, H10927, H10944, H12287, H13260 o. El número de células de vida relativo en la ausencia de sgRNAs se ajustan a 100. Errorbarras indican SD (n = 3). *, P <0,002. Reimpresión de la Leukemia Research, vol. 38, Takahashi M. et al., Selección de una biblioteca de tipo sgRNA heptámero para potenciales agentes terapéuticos contra tumores malignos hematológicos, pp 808-815, Fig. 1, Derechos de Autor (2014), con permiso de Elsevier. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. citometría de flujo. Con respecto a las células HL60, la citometría de flujo se realizó con anexina V y 7AAD doble tinción. Las células se analizaron 72 horas después de cultivadas en ausencia o presencia de 1 M de al desnudo heptámero de tipo sgRNA H1885 (A), H3277 (A), H13260 (A), o H10927 (B). Reimpresión de la Leukemia Research, vol. 38, Takahashi M. et al., Selección de una biblioteca de tipo sgRNA heptámero para potenciales agentes terapéuticos contra tumores malignos hematológicos, pp 808-815, Fig. 2, Derechos de Autor (2014), con permiso de Elsevier. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Transferencia Adaptable y Tecnología sin fisuras a través de la I + D, la Agencia de Tecnología Japonesa de Ciencia y el Fondo de Promoción de la Investigación en Ciencias de la Corporación de Promoción y Ayuda Mutua para las escuelas privadas de Japón, impulsado por el destino, y los números JSP KAKENHI Grant 24300342 y 15H04313 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
References
- Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).
- Nashimoto, M. Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters. Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).
- Nashimoto, M. Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. RNA. 2, 523-534 (1996).
- Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).
- Nashimoto, M. Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease. FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity. Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).
- Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).
- Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).
- Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers. Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).
- Habu, Y., et al. Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).
- Nakashima, A., et al. Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Ther. 14, 78-85 (2007).
- Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).
- Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).
- Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One. 9 (114121), (2014).
- Takahashi, M., et al. Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs. PLoS One. 7 (38496), (2012).
- Takahashi, M., et al. A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).
- Watanabe, N., et al. Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).
- Elbarbary, R. A., et al. Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS One. 4, 5908 (2009).
- Elbarbary, R. A., et al. Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).
- Ninomiya, S., et al. Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines. PLoS One. 10, 0118631 (2015).
- Takahashi, M., et al. Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies. Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).
- Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis (2015).
- FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf (2007).
- Shivarov, V. TRUE gene silencing for hematologic malignancies. Leukemia Res. 38, 729 (2014).
