Murina Modell av Intestinal ischemi-reperfusionsskada

Summary

Här beskriver vi den detaljerade proceduren av intestinal ischemi-reperfusion hos möss som resulterar i reproducerbara skada utan dödsfall för att uppmuntra standardisering av denna teknik över fältet. Denna modell av intestinal ischemi-reperfusionsskada kan utnyttjas för att studera de cellulära och molekylära mekanismer för skada och regenerering.

Abstract

Intestinal ischemi är ett livshotande tillstånd associerat med ett brett område av kliniska tillstånd innefattande ateroskleros, trombos, hypotension, nekrotiserande enterokolit, tarm transplantation, trauma och kronisk inflammation. Intestinal ischemi-reperfusion (IR) skada är en följd av akut mesenterialkärlsocklusion, som orsakas av otillräckligt blodflöde genom de mesenteriska kärlen, vilket resulterar i intestinal skada. Reperfusion efter ischemi kan ytterligare förvärra skador på tarmen. Mekanismerna för IR skada är komplexa och dåligt förstådda. Därför experimentella små djurmodeller är kritiska för att förstå patofysiologin för IR skada och utvecklingen av nya terapier.

Här beskriver vi en musmodell för akut tarm IR skada som ger reproducerbar skada på tunntarmen utan dödsfall. Detta uppnås genom att inducera ischemi i området för den distala ileum genom tidsmässigt occluding de perifera och terminala säkerheter grenar av mesenterica superior för 60 min med hjälp av mikrovaskulära klämmor. Reperfusion under 1 timme, eller två timmar efter skada resulterar i reproducerbara skada undersökas av histologisk analys tarmen. Korrekt position mikrovaskulära klipp är kritisk för förfarandet. Därför videoklippet ger en detaljerad visuell steg-för-steg beskrivning av denna teknik. Denna modell av intestinal IR skada kan användas för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av skada och förnyelse.

Introduction

Tarmen är mycket känslig för avbrott i blodflöde vilket orsakar ischemi och epitelskada. Reperfusion efter ischemi ger re-syresättning av vävnaden, och kan ytterligare främja patologi. Därför är intestinal ischemi och reperfusionsskada associerad med ett brett spektrum av patologier, inklusive nekrotiserande enterokolit, allograftavstötning i tunntarmstransplantation, komplikationer av bukaortaaneurysm kirurgi, kardiopulmonal bypass, och inflammatorisk tarmsjukdom ^1,2. Intestinal IR skada, särskilt akut mesenterialkärlsocklusion, är ett livshotande tillstånd som resulterar i sjuklighet och dödlighet ^3.

Även om dåligt kända, är intestinal ischemi-reperfusion (IR) skada tros vara associerade med förändringar i tarmfloran samt produktion av reaktiva syreradikaler och inflammatoriska cytokiner och kemokiner ^1,4-6. Detta leder till aktivering av både inate och adaptiva immunmekanismer som främjar inflammation och vävnadsskada ^1,7,8.

Djurmodeller är avgörande för att förstå de mekanismer för IR skada, eftersom de möjliggör enkel GAIN- och förlust av funktions genetiska experiment. Flera djurmodeller av IR har utvecklats, vilka innefattar fullständig vaskulär ocklusion, låg flödesischemi, och segmenterade vaskulär ocklusion (sammanfattade i en nyligen omfattande översyn ^9). Intestinal ischemi orsakad av fullständig vaskulär ocklusion av mesenterica superior (SMA) är ett enkelt och vanligt förekommande modell av IR i stora djur och gnagare ^9-11. Men olika områden av tarmen har olika känslighet för skada. Dessutom varierat utbud av bedövningsmedel, smärtstillande medel, artärocklusion tekniker, liksom inkonsekvens i varaktigheten av ischemisk skada och återhämtning resulterar i varierande grad av skador confounding vår förståelse av biologi IR över flera studies. Tabell 1 visar dessa inkonsekvenser i murina IR studier. Den största nackdelen att använda kortare ischemiska gånger (30-45 min) riktar fönstret återhämtning på som kan observeras urskiljbara skillnader mellan fall och kontroller. Mild skada epitelet kan lösas en timme efter reperfusion, specialiserade patologiska mätvärden kan krävas för att hitta skillnader i epitelial restitution därför. I kontrast, överdriven skada, som sett av 100 min av ischemisk skada kan resultera i den kompletta denudement av epitelet, när restitution inte längre är möjlig, vilket ökar graden av dödlighet, och återhämtningstiden. Därför, här beskriver vi detaljerade förfarandet av tarm IR hos möss, vilket resulterar i reproducerbara skada utan dödsfall för att främja standardisering av denna teknik över vårt område. Denna modell av intestinal IR skada kan användas för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av skada och förnyelse.

Protocol

Djurstudier har utförts i enlighet med National Institute of Health riktlinjer och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommitté Trudeau Institute. 8-12 veckor gamla C57BL / 6-möss användes för studien. 1. Förberedelse för kirurgi Förbered och sterilisera kirurgiska instrument. Förbered isofluran baserade anestesisystemet med noskonen och uppvärmd pad. Se till att uppvärmd pad inte överhettas (<39 ° C). Se till att isofluran g…

Representative Results

Vi optimerat experimentella protokollet IR operation för att erhålla reproducerbara IR-inducerad skada av ileum hos möss. Representativa resultat demonstreras i detta avsnitt. Figur 1 visar exempel på mikrovaskulära klämmor position för att inducera ischemi i ileum. Svarta pilar visar läget på klipp täppa första ordningens grenar av mesenterica superior. Gröna pilarna visar positionen ytterligare k…

Discussion

Utvecklingen av musmodeller av intestinal IR skada har förbättrat förståelsen av mekanismerna för vävnadsskada och hjälp i utvecklingen av potentiella terapeutiska strategier för att minimera vävnadsskador ^7,9,11,34. De kritiska stegen i protokollet är korrekt placering av mikrovaskulära klipp korrekt tidpunkten för ischemi och korrekt histologisk utvärdering av IR-skada.

Varaktigheten av ischemi är kritisk för efterföljande epitelskada. Den typiska tid som krävs …

Materials

Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
Sterile cotton gauze pad	Fisher Healthcare	22-415-468
Non-adherent pad prepack	Telfa	1238
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3×4, sterile	Coviden	1050