Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Exosomal تحليل ميرنا في الخلية غير الصغيرة سرطان الرئة (NSCLC) المرضى البلازما من خلال QPCR: والممكنة السائل أداة خزعة

Published: May 27, 2016 doi: 10.3791/53900
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 4, 3, 5,6, 7,3, 8,3, 2,3
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)
* These authors contributed equally

Introduction

ويرجع ذلك أساسا إلى فعالية محدودة من العلاجات في مرحلة متقدمة من المرض وسوء الكشف المبكر عن 1 معدل البقاء على قيد الحياة وانخفاض في NSCLC (خلية صغيرة غير سرطان الرئة) من المرضى. تفعيل الطفرات في الجينات اريسا، التي تم اكتشافها في جزء من السكان من المرضى NSCLC، ومن المعروف أن تمنح حساسية لالتيروزين كيناز مثبطات (TKIs). وللأسف، فإن الغالبية العظمى من المرضى NSCLC EGFR تحور تطوير المقاومة TKI 2. خاصة في هذا السياق، إلى التشخيص الصحيح إلزامي. بصفة عامة، نظرا لتوطين أورام، والحصول على الأنسجة الخزعة في NSCLC ليس دائما ممكنا. لذلك، العديد من الدراسات جارية أن استخدام أساليب غير الغازية للحصول على هذه البيانات البيولوجية. موصوفة Exosomes كمكونات الخزعة السائلة التي يمكن أن يتم التحقيق من أجل الحصول على قيم التشخيصية والنذير مع التقنيات غير الغازية 3.

Exosomes هم nanovesicles (40-100 قطر نانومتر) من البريدأصل ndocytic التي تم إصدارها من قبل أنواع مختلفة من الخلايا في كل الظروف الفسيولوجية والمرضية 4. ويمكن أن تحمل البروتين، والدهون، ومرنا والرنا الميكروية. وعلاوة على ذلك، تشير العديد من الدراسات إلى دور عديد المظاهر من ورم مشتقة exosomes، والتي يمكن أن تؤثر على النمو والبقاء على قيد الحياة من خلايا الورم، والأوعية الدموية، انسجة وخارج الخلية إعادة عرض المصفوفة ومقاومة العقاقير 5.

الرنا الميكروية (miRNAs) هي قصيرة RNA غير الترميز التي تشارك في تنظيم مرحلة ما بعد النسخي، ربط 3'-UTR للمن mRNAs هدف وقيادة مرنا إلى تدهور أو إلى غير الترجمة 6. وقد وصفت الفرز الانتقائي للmiRNAs إلى exosomes. في هذا السياق، في الآونة الأخيرة وقد تجلى، في التجارب المختبرية والحية، والتعبئة والتغليف الانتقائي للمير-21 (ميرنا المعروفة مع آثار أنكجنيك) في exosomes الصادرة عن خطوط الخلايا ابيضاض الدم النقوي المزمن بعد العلاج الكركمين 7.

الالملف الشخصي exosomal ميرنا يشبه الشخصية ميرنا من الورم الرئيسي ويمكن استغلال هذه الميزة في التشخيص المبكر والتشخيص 3. على وجه التحديد، وهناك إمكانية لتميز، من خلال الوقت الحقيقي PCR، miRNAs اختيار المترابطة مع المستوى الجزيئي للأمراض، على سبيل المثال.، والطفرات EGFR من بين أمور أخرى 8.

هنا، يتم وصف تحليل لوحة مختارة من المترابطة NSCLC-miRNAs 8-9 التي تم عزلها من exosomes صدر في الدم لمرضى NSCLC. بعد الحصول على تقرير الموافقة على إبلاغ من المرضى، والبلازما من 12 مريضا NSCLC و 6 الاصحاء، وقد تم تحليل. تم إجراء العزلة exosome مع عدة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قبل العزلة exosome، تم علاج عينات البلازما مع ريبونوكلياز، من أجل أن تتحلل الملوثات المنتشرة miRNAs. قررنا إجراء هذا التحليل مع مجموعة تجارية في نتيجة للتوحيد محدود من TECHNI الآخرينسؤال كان (على سبيل المثال، تنبيذ فائق) وهو أمر مهم خصوصا عند التعامل مع العينات السريرية. وتشمل هذه المجموعة علاج بروتين كاف، والتي سوف تؤدي إلى تدهور ريبونوكلياز، وبالتالي يقلل من خطر أن تتحلل miRNAs exosomal بعد تحلل exosome. أجري تحليل الرنا الميكروي من قبل في الوقت الحقيقي تحليل حساسية وخصوصية PCR. وقد استخدم مير 1228-3p كعنصر تحكم الذاتية وتم تطبيع البيانات وفقا للصيغة 2 - ΔΔct. وتستخدم القيم السيطرة كما الأساس، ويتم عرض النتائج في مقياس لوغاريتمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Exosome عزل

ملاحظة: عزل exosomes من عينات البلازما، وقد أجريت مع مجموعة تجارية، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة والعلاج ريبونوكلياز مضيفا: (يجب أن يتم تنفيذ كل هذه الخطوات مع معدات الوقاية الشخصية والبيئة، وبعد إجراء قانوني محدد للتلاعب من العينات البيولوجية ).

  1. خذ 1 مل من البلازما من كل عينة، وتخزينها في -80 درجة مئوية، ووضعه على الجليد.
  2. الطرد المركزي العينة في 2000 × ز لمدة 20 دقيقة في RT. هذا المقطع هو إلزامي من أجل إزالة الخلايا والحطام.
  3. نقل طاف تحتوي البلازما نظيفة لأنبوب 1.5 مل جديد.
  4. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب جديد في 10000 × ز لمدة 20 دقيقة في RT.
  5. نقل طاف تحتوي البلازما نظيفة لأنبوب 1.5 مل جديد.
  6. إضافة 100 نانوغرام / مل من ريبونوكلياز لطاف واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة فيلكي تتحلل تعميم الرنا.
  7. نقل جميع البلازما المعالجة لأنبوب 2 مل جديد وإضافة 0.5 حجم برنامج تلفزيوني 1X.
  8. دوامة عينة من أجل خلط الحلول.
  9. إضافة 0.05 حجم حل بروتين كاف (أرفق في عدة) للعينة.
  10. دوامة العينة ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  11. إضافة 0.2 حجم المخزن المؤقت exosome هطول الأمطار على عينة وخلط الحلول من خلال انقلاب.
  12. احتضان العينة في 2 درجة مئوية إلى 8 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم الطرد المركزي في العينة 10000 × ز لمدة 5 دقائق على RT.
  13. نضح وتجاهل طاف. بيليه يحتوي على exosomes معزولة.
  14. إضافة العازلة المحدد إلى بيليه exosome من أجل resuspend وexosomes. اختيار المخزن المؤقت يعتمد على تحليل المصب المخطط لها، في هذه الحالة:
    1. إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X من أجل إجراء تحليل تيم.
    2. إضافة 346.5 ميكرولتر من BUF تحلل محددةفر لاستخراج الحمض النووي الريبي (من عدة التجارية) (تنبيه: الأخطار الكيميائية).
    3. إضافة 100 ميكرولتر من تحلل العازلة لاستخراج البروتين (تريس، حمض الهيدروكلوريك 50 ملي درجة الحموضة 7.6 - كلوريد الصوديوم 300 ملي - تريتون X-100 0.5٪ - PMSF 1 ملم - Leupeptin / أبروتينين 10 ميكروغرام / مل) من أجل إجراء تحليل الغربية التنشيف. (تنبيه: الأخطار الكيميائية).
  15. تخزين exosomes معلق في -20 درجة مئوية.

2. Exosome توصيف بواسطة تحليل لطخة غربية

ملاحظة: من أجل تميز nanovesicles معزولة، فمن المستحسن النشاف الغربية مع الأجسام المضادة ضد ALIX وTSG101 (المعروفة علامات exosomal).

  1. بعد إعادة تعليق من بيليه exosome في المخزن تحلل، وضعه على الجليد لمدة 1 ساعة من أجل حل غشاء exosomal.
  2. الطرد المركزي المحللة في 12000 ز لمدة 10 دقيقة، وطاف لنقل أنبوب جديد من دون إزعاج بيليه.
  3. تحديد مجموع conten البروتين exosomalر من قبل برادفورد الفحص أو وسائل أخرى وتحميل 50 ميكروغرام من البروتينات لكل بئر في تريس / جليكاين SDS - 8٪ هلام بولي أكريلاميد. (تنبيه: الأخطار الكيميائية).
  4. فصل البروتينات (والوزن الجزيئي علامة المناسبة) في 8٪ SDS-PAGE هلام الكهربائي مع العازلة تشغيل (25 ملي تريس، 192 ملي الجلايسين، 0.1٪ SDS) لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة في 120 V. (تنبيه: الأخطار الكيميائية ).
  5. نقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز التي كتبها electroblotting مع 4 ° C عازلة نقل الباردة (25 ملي تريس، 192 ملي الجلايسين، 20٪ الميثانول) لمدة 1 ساعة على ثابت 50 V. (تنبيه: الأخطار الكيميائية).
  6. منع الغشاء لمدة 1 ساعة في التحريض بطيئة مع 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم في 1X TBS -Tween 0.1٪.
  7. غسل غشاء 4 مرات لمدة 5 دقائق في التحريض سريع مع 1X TBS - توين 0.1٪.
  8. إضافة الأجسام المضادة الأولية ضد ALIX وTSG101 (واحد لكل غشاء) في المخزن المناسب (وفقا لذلك إلى ورقة البيانات الضد من الشركة المصنعة)، واحتضان الغشاء O / N، في التحريض بطيئة.
  9. غسل غشاء 5 مرات لمدة 5 دقائق في التحريض سريع مع 1X TBS - توين 0.1٪ لإزالة الأجسام المضادة المفرط.
  10. إضافة الضد الثانوية المناسب في المخزن المناسب (وفقا لذلك إلى ورقة البيانات الضد من الشركة المصنعة)، واحتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في التحريض بطيئة.
  11. غسل غشاء 5 مرات لمدة 5 دقائق في التحريض سريع مع 1X TBS - توين 0.1٪ لإزالة الأجسام المضادة المفرط.
  12. اكتشاف بروتين المختارة عن طريق تحليل لمعان كيميائي 11.

3. Exosome توصيف بواسطة تحليل تيم

ملاحظة: من أجل تصور exosomes معزولة، تم إجراء تيم (نقل الميكروسكوب الالكتروني) التحليل.

  1. مكان ~ 10 ميكروغرام (كميا من قبل برادفورد فحص) من عينة من exosomes سليمة معلق في برنامج تلفزيوني 1X على بارافيلم وضعت على عينة إسقاط الكربون formvar المغلفة شبكة النيكل لمدة 1 ساعة.
    2. <لى> غسل الشبكة 3 مرات بوضعها على ثلاثة 40 ميكرولتر 1X قطرات برنامج تلفزيوني.
  2. غسل الشبكة 5 مرات بوضعها على خمسة 30 ميكرولتر قطرات الماء عالى النقاء.
  3. إصلاح العينة بإضافة قطرة من 2.5٪ غلوتارالدهيد (تنبيه: الأخطار الكيميائية) لمدة 10 دقيقة.
  4. غسل الشبكة 3 مرات بوضعها على ثلاثة 40 ميكرولتر 1X قطرات برنامج تلفزيوني.
  5. إضافة قطرة من 2٪ اليورانيل خلات (تنبيه: الأخطار الكيميائية) ووضع الشبكة على أعلى من ذلك لمدة 15 دقيقة وذلك لتباين العينة.
  6. تضمين العينة على انخفاض بنسبة 0.13٪ ميثيل (تنبيه: الأخطار الكيميائية) و 0.4٪ خلات اليورانيل واحتضان الشبكة على أعلى من الانخفاض لمدة 10 دقيقة.
  7. إزالة بلطف فائض السائل مع ورقة امتصاص وتجفيف الشبكة لمدة 5 دقائق مع الجانب حتى المغلفة.
  8. دراسة الشبكة عن طريق مجهر إلكتروني نافذ 12.

4. Exosomal استخراج الحمض النووي الريبي والكمي

ملاحظة: قررنا PERFاسندت استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من عينات exosomal باستخدام طقم التجارية، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة: (تنبيه: الأخطار الكيميائية، واستعراض بروتوكول الشركة المصنعة والمبادئ التوجيهية).

  1. بعد إعادة تعليق من بيليه exosome في 346.5 ميكرولتر من تحلل العازلة، إضافة 3.5 ميكرولتر من β-المركابتويثانول (تنبيه: الأخطار الكيميائية) ودوامة بقوة. هذا المقطع هو إلزامي من أجل تدمير الأغشية الدهنية.
  2. إضافة المحللة إلى العمود الغسيل في أنبوب جمع وأجهزة الطرد المركزي في 11000 × ز لمدة 1 دقيقة. بعد الطرد المركزي، ونبذ العمود ونقل الترشيح إلى 1.5 مل أنبوب جديد ريبونوكلياز خالية.
  3. إضافة 350 ميكرولتر من الايثانول 70٪ (تنبيه: الأخطار الكيميائية)، ومزيج من قبل vortexing لمدة 5 ثوان.
  4. تحميل المحللة في عمود حل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 8000 × ز. بعد الطرد المركزي، وتجاهل flowthrough ونقل عمود إلى أنبوب المجموعة الجديدة.
  5. تحميل 350 ميكرولتر من العازله تحليةص وأجهزة الطرد المركزي في 11000 × ز لمدة 1 دقيقة. بعد الطرد المركزي، وتجاهل flowthrough والعودة العمود في أنبوب نفس المجموعة.
  6. إضافة 95 ميكرولتر من مزيج رد فعل الدناز الأول (10 ميكرولتر من الدناز أعيد أنا + 90 ميكرولتر من العازلة الدناز، لكل عينة) على الغشاء السيليكا العمود واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة في RT. (تنبيه: المخاطر الكيميائية)
  7. إضافة 200 ميكرولتر من غسل العازلة (تنبيه: المخاطر الكيميائية) إلى العمود والطرد المركزي في 11000 × ز لمدة 1 دقيقة. وضع عمود في أنبوب المجموعة الجديدة.
  8. إضافة 600 ميكرولتر من غسل العازلة إلى العمود والطرد المركزي في 11000 × ز لمدة 1 دقيقة. بعد الطرد المركزي، ونبذ flowthrough ووضع عمود في أنبوب جمع نفسه.
  9. إضافة 250 ميكرولتر من غسل العازلة إلى العمود والطرد المركزي في 11000 × ز لمدة 2 دقيقة. وضع عمود في أنبوب خالية من ريبونوكلياز 1.5 مل.
  10. أزل الحمض النووي الريبي في 40 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه وأجهزة الطرد المركزي في 11000 5؛ ز لمدة 1 دقيقة، من أجل أن يكون تركيز عال الحمض النووي الريبي في هذا الحجم الصغير.
  11. المكان على الفور RNA مزال على الجليد لمنع تدهور محتمل أو مخزن في -80 درجة مئوية.
  12. قياس محتوى الحمض النووي الريبي. ملاحظة: وهنا، تم إجراء تكميم RNA باستخدام 1 ميكرولتر من العينة من خلال معمل.

5. Retrotrascription من miRNAs Exosomal

ملاحظة: نظرا لكمية محدودة وصفت من محتوى miRNAs في exosomes، فقد تقرر إجراء النسخ العكسي من miRNAs مختارة من خلال عدة التجارية باستخدام فحص فردي لكل ميرنا، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لكل عينة، تم اختيار 8 miRNAs المترابطة لوضع NSCLC (مير 30B؛ مير 30C، مير-103، مير-122، مير-195، مير-203، مير-221، مير-222، ومير 1228- 3P عن السيطرة الذاتية).

  1. تحضير مزيج الرئيسي النسخ العكسي (RT المزيج). لكل رد فعل إعداد 7 ميكرولتر من مزيج RT، كما هو موضح فيhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (انقر هنا للتحميل) (تنبيه: المخاطر الكيميائية).
    ملاحظة: في هذه التجربة، تم إعداد 9 مزيج RT مختلفة لكل عينة.
  2. المزيج بلطف وتخزين مزيج RT على الجليد. إضافة 7 ميكرولتر من مزيج RT لكل أنبوب رد فعل.
  3. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي عينة (10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع) في أنبوب تفاعل ومزيج بلطف.
  4. إضافة 3 ميكرولتر من الاشعال النسخ العكسي 5X (تنبيه: المخاطر الكيميائية) من كل تجربة وضعت على أنبوب رد فعل المقابلة.
  5. مزيج ببطء، أغلق أنبوب واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
  6. تحميل أنبوب رد فعل في cycler الحرارية والبدء في رد فعل النسخ العكسي باستخدام القيم المعلمة التالية (HOLD على 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. HOLD في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. HOLD على 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. HOLD ∞ 4 ° C).

6. في الوقت الحقيقي تحليل PCR من Exosomal miRNAs

ملاحظة: كان هذا التحليليقوم باستخدام طقم التجارية في الوقت الحقيقي PCR (QPCR)، مع ثلاثة مكررات البيولوجية والتقنية لكل عينة.

  1. لكل رد فعل، وإعداد 17.67 ميكرولتر من مزيج الوقت الحقيقي PCR (10 ميكرولتر من PCR ميكس ماجستير + 7.67 ميكرولتر من المياه نوكلياز خالية)، ومزجها ووضعها على الجليد. (تنبيه: المخاطر الكيميائية)
  2. إضافة 1 ميكرولتر لكل أنبوب PCR، من 20x والاشعال QPCR (تنبيه: المخاطر الكيميائية).
  3. ضع 18.67 ميكرولتر من مزيج QPCR في كل لوحة بشكل جيد.
  4. إضافة 1.33 ميكرولتر من المنتج النسخ العكسي إلى مراسل جيدا لوحة.
  5. إغلاق لوحة وأنها تدور (300 GX 5 ثانية).
  6. إدراج لوحة في نظام الوقت الحقيقي PCR وبدء التشغيل باستخدام الظروف PCR التالية: عقد في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 40 دورة من 15 ثانية في 95 درجة مئوية و 60 ثانية في 60 درجة مئوية. عملية وتطبيع البيانات وفقا للصيغة 2 - ΔΔct 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تجهيز ما مجموعه 12 البلازما من مرضى NSCLC و 6 الاصحاء مع عدة التجارية لعزل exosome من البلازما. تمت معالجة كل عينة عن طريق تحليل البقعة الغربية لتقييم علامات exosomal ALIX (96 كيلو دالتون) وTSG101 (43 كيلو دالتون). ويرد مثال على هذه النتائج لمدة 3 عينات في الشكل 1، مشيرا إلى أن exosome بمعزل عن عينات البلازما هي مجدية مع هذا البروتوكول.

من أجل تميز biophysically عينات exosomal، تم إجراء تحليل تيم. وقد أظهرت تيم أن nanovesicles التي حصل عليها هذا البروتوكول العزلة لديهم متوسط ​​الحجم في مجموعة من حجم exosomal، بين 40-100 نانومتر (الشكل 2).

بعد العزلة exosome والتوصيف، ونحن التحقيق محتوى miRNAs بهم. اخترنا 8 miRNAs محددة، من المعروف أن deregulatإد في NSCLC. كما الرقابة الداخلية، وكنا مير 1228 التي تم التحقق من صحتها من قبل كعنصر تحكم الذاتية مستقرة وفعالة في أنواع الأورام المختلفة 10. ووفقا لهذه النتائج مير 1228 هو السيطرة الذاتية موثوقة ومستقرة. عندما تمت مقارنة مستوى التعبير من 8 اختيار ميرنا بين المتبرعين الأصحاء ومرضى سرطان الرئة، وقد وجد أن هذه miRNAs أن يجري إلغاء تنظيم بقوة في العينات السريرية تحليلها. في الشكل (3) يظهر نمط التعبير عن miRNAs اختيار 8 على مقياس لوغاريتمي ل12 عينة تم تحليلها (PAD1-12). ليست كل miRNAs التي يمكن اكتشافها في كل عينة، ونظرا لكمية محدودة من عينات أننا لا يمكن أن تؤدي التحليل الإحصائي.

شكل 1
الشكل 1. الغربية تحليل وصمة عار في 3 عينات Exosomal لALIX وTSG101. تظهر البقعة الغربية وجودعلامات exosomal معروفة، ALIX وTSG-101، في العينات التي تم تحليلها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل تيم العينات Exosomal هذه النتائج تدل على أن nanovesicles معزولة لديها متوسط ​​قطرها بين 40 - 100 نانومتر، داخل نطاق exosomal الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم الشخصي 3. التعبير عن 8 miRNAs مختارة في عينات Exosomal. هذه البيانات، كما هو موضح في مقياس لوغاريتمي، إثبات أن ماراح هذا البروتوكول هو ممكن لرؤية حتى- أو أسفل تنظيم miRNAs exosomal مختارة من المرضى NSCLC البلازما السريرية (PAD1-12)، مما أدى إلى اكتشاف محتمل من المؤشرات الحيوية exosomal من NSCLC. وتظهر البيانات كما أضعاف التعبير النسبي لضوابط صحية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مع هذا البروتوكول المشترك كان من الممكن إجراء تحليل ميرنا exosomal من البلازما من مرضى NSCLC. قد تعكس هذه البيانات على الحالة المرضية، ولكن هذا يحتاج إلى تأكيد من مزيد من الدراسة.

واستند البروتوكول المستخدم في هذه المقالة على عدة التجارية لعزل exosome. وكان السبب أن إجراءات العزل المعروفة الأخرى (على سبيل المثال، كثافة تنبيذ فائق التدرج) تتطلب إجراءات أكثر اليدوي، مما يؤدي إلى توحيد محدودة. ومع ذلك، واحدة من القيود المفروضة على هذا البروتوكول هو أنه في مقارنة مع تنبيذ فائق الكثافة التدرج لعزل exosome، كثافة التدرج تنبيذ فائق يبقى تقنية مفيدة جدا في العزلة exosome أن يستغل كثافة معينة من exosomes (بين 1،13-1،19 ز / مل). وهناك تعديل محتمل هو مزيج من الاثنين معا الإجراءات، والتي قد يكون المعيار الذهبي في هذا المجال.

إمكانية معالجة sampl الدراسي السريريأعطت وفاق مع العلاج ريبونوكلياز لنا عينات نقية بدون تلوث تعميم miRNAs. ومع ذلك، فإن وجود ريبونوكلياز الانزيمات في العينات يمكن أن تؤثر على كمية من exosomal ميرنا بعد تحلل exosome. لهذا السبب اخترنا مجموعة مع العلاج بروتين كاف، من أجل القضاء على تعميم البروتينات الملوثات وللحط من الانزيمات ريبونوكلياز.

بعد توحيد جميع الإجراءات العزلة، وتوصيف المستقبل وتحليل ميرنا هذه البيانات يمكن أن تشكل أداة مفيدة للكشف عن المؤشرات الحيوية بطريقة غير الغازية خلال التشخيص الأولي والمتابعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total exosome isolation kit (from plasma)  Invitrogen 4484450 Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A Sigma-Aldrich R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9) Cell Signaling 2171S
TSG-101 Antibody (C-2) SantaCruz Biotecnology SC-7964 
Anti-Mouse HRP 1 ml   Cell Signaling 7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50 GE HealthCare 25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay Life Technologies 002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Life Technologies 4440043

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
  4. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
  5. Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
  6. Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
  7. Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
  8. Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
  9. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  10. Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
  11. Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
  12. Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  13. Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).

Tags

الطب، العدد 111، Exosomes، miRNAs، NSCLC، خزعة السائل، والسرطان، والعلامات البيولوجية
Exosomal تحليل ميرنا في الخلية غير الصغيرة سرطان الرئة (NSCLC) المرضى البلازما من خلال QPCR: والممكنة السائل أداة خزعة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Giallombardo, M., Chacártegui… More

Giallombardo, M., Chacártegui Borrás, J., Castiglia, M., Van Der Steen, N., Mertens, I., Pauwels, P., Peeters, M., Rolfo, C. Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool. J. Vis. Exp. (111), e53900, doi:10.3791/53900 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter